本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種用于檢測人類mgmt基因甲基化突變的多重?zé)晒鈖cr檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
：mgmt基因編碼o6-甲基鳥嘌呤dna甲基轉(zhuǎn)移酶，可將鳥嘌呤o6位置的烷基加合物移除，該加合物在dna復(fù)制過程中會阻礙正常復(fù)制過程，mgmt蛋白在該過程中起到保護(hù)細(xì)胞的作用。在某些腫瘤，特別是神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，mgmt啟動子區(qū)域常存在一定程度的甲基化，由此導(dǎo)致mgmt活性或表達(dá)下降，但同時缺乏mgmt的個體，一定程度上對于某些腫瘤藥物更為敏感。同時，mgmt特定位點甲基化的程度，在某些腫瘤中，還可作為分期、用藥以及生存期等的判斷依據(jù)之一。因此，臨床上可依據(jù)mgmt特定位點甲基化狀態(tài)，做出適當(dāng)?shù)脑\斷，并進(jìn)行相應(yīng)的治療。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測人類mgmt基因甲基化突變的多重?zé)晒鈖cr檢測試劑盒。本發(fā)明的技術(shù)方案如下：一種用于檢測人類mgmt基因甲基化突變的多重?zé)晒鈖cr檢測試劑盒，包括：dna亞硫酸鈉轉(zhuǎn)化試劑、mgmt檢測引物組、內(nèi)標(biāo)引物組、mgmt檢測探針和內(nèi)標(biāo)檢測探針；mgmt檢測探針的5’端修飾有第一熒光報告基團(tuán)，3’端修飾有第一熒光猝滅基團(tuán)；內(nèi)標(biāo)檢測探針的5’端修飾有與第一熒光報告基團(tuán)不同的第二熒光報告基團(tuán)，3’端修飾有第二熒光猝滅基團(tuán)；其中，mgmt檢測引物組由正向引物mgmt-16-f1和反向引物mgmt-16-r1組成，依次包括如seqidno01和02所示的序列；內(nèi)標(biāo)引物組由正向引物actb-f1和反向引物actb-r1組成，依次包括如seqidno03和04所示的序列；該多重?zé)晒鈖cr檢測試劑盒的反應(yīng)體系的組成如下：mgmt檢測引物組mgmt檢測探針內(nèi)標(biāo)引物組內(nèi)標(biāo)檢測探針1×pcr緩沖液mgcl2dntpstaq酶h2o經(jīng)dna亞硫酸鈉轉(zhuǎn)化試劑處理的dna模板；該多重?zé)晒鈖cr檢測試劑盒的每一反應(yīng)體系的反應(yīng)條件均為：95℃預(yù)變性5分鐘，1個循環(huán)；95℃變性25秒，56℃退火20秒，72℃延伸10秒，15個循環(huán)；95℃變性25秒，56℃退火35秒，72℃延伸10秒，30個循環(huán)，后30個循環(huán)在退火時檢測熒光信號。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述mgmt檢測探針為mgmt-16-probe-1，包括如seqidno05所示的序列。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述內(nèi)標(biāo)檢測探針為actb-probe-1，包括如seqidno06所示的序列。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述第一熒光報告基團(tuán)為fam，所述第一熒光猝滅基團(tuán)為bhq1，所述第二熒光報告基團(tuán)為hex，第二熒光猝滅基團(tuán)為bhq1。進(jìn)一步優(yōu)選的，所述反應(yīng)體系的具體組成如下：本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明以人類mgmt基因甲基化突變?yōu)闄z測對象，通過特異引物的優(yōu)化組合以及熒光探針，從而實現(xiàn)準(zhǔn)確、簡單、快速地同時檢測mgmt基因甲基化突變，而且檢測突變的能力高達(dá)1％。附圖說明圖1為本發(fā)明實施例2的多重?zé)晒鈖cr反應(yīng)程序圖。圖2為本發(fā)明實施例2中多重?zé)晒鈖cr檢測mgmt基因甲基化陰性對照樣品檢測曲線圖。圖3為本發(fā)明實施例2中多重?zé)晒鈖cr檢測mgmt基因甲基化陽性的樣品檢測曲線圖。具體實施方式以下通過具體實施方式結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行進(jìn)一步的說明和描述。一種用于檢測人類mgmt基因甲基化突變的多重?zé)晒鈖cr檢測試劑盒，包括：dna亞硫酸鈉轉(zhuǎn)化試劑、mgmt檢測引物組、內(nèi)標(biāo)引物組、mgmt檢測探針和內(nèi)標(biāo)檢測探針；mgmt檢測探針的5’端修飾有第一熒光報告基團(tuán)，3’端修飾有第一熒光猝滅基團(tuán)；內(nèi)標(biāo)檢測探針的5’端修飾有與第一熒光報告基團(tuán)不同的第二熒光報告基團(tuán)，3’端修飾有第二熒光猝滅基團(tuán)；優(yōu)選的，所述第一熒光報告基團(tuán)為fam，所述第一熒光猝滅基團(tuán)為bhq1，所述第二熒光報告基團(tuán)為hex，第二熒光猝滅基團(tuán)為bhq1；其中，mgmt檢測引物組由正向引物mgmt-16-f1和反向引物mgmt-16-r1組成，依次如seqidno01和02所示；內(nèi)標(biāo)引物組由正向引物actb-f1和反向引物actb-r1組成，依次如seqidno03和04所示；該多重?zé)晒鈖cr檢測試劑盒的反應(yīng)體系的組成如下：mgmt檢測引物組mgmt檢測探針內(nèi)標(biāo)引物組內(nèi)標(biāo)檢測探針1×pcr緩沖液mgcl2dntpstaq酶h2o經(jīng)dna亞硫酸鈉轉(zhuǎn)化試劑處理的dna模板；該多重?zé)晒鈖cr檢測試劑盒的每一反應(yīng)體系的反應(yīng)條件均為：95℃預(yù)變性5分鐘，1個循環(huán)；95℃變性25秒，56℃退火20秒，72℃延伸10秒，15個循環(huán)；95℃變性25秒，56℃退火35秒，72℃延伸10秒，30個循環(huán)，后30個循環(huán)在退火時檢測熒光信號。所述mgmt檢測探針為mgmt-16-probe-1，如seqidno05所示。所述內(nèi)標(biāo)檢測探針為actb-probe-1，如seqidno06所示的。上述物及探針具體序列如下表所示：名稱序列mgmt-16-f1cggatatgttgggatagttcgmgmt-16-r1ctcttccgaaaacgaaacgmgmt-16-probe-1cccaaacactcaccaaatcgcaaactb-f1tggtgatggaggaggtttagtaactb-r1ccaataaaacctactcctccctactb-probe-1ccaccacccaacacacaataacaaac實施例1本實施例以人類mgmt基因甲基化突變?yōu)闄z測對象，通過特異引物的優(yōu)化組合以及熒光探針，從而實現(xiàn)準(zhǔn)確、簡單、快速地同時檢測mgmt基因甲基化突變，而且檢測突變的能力高達(dá)1％。野生型細(xì)胞系的基因組dna為野生型模板，以mgmt啟動子甲基化突變質(zhì)粒為陽性對照模板，建立多重?zé)晒鈖cr檢測mgmt基因啟動子甲基化突變的反應(yīng)體系，最終以達(dá)到設(shè)定的閾值時所需要的循環(huán)次數(shù)ct值作為結(jié)果判斷的標(biāo)準(zhǔn)(本實施例中的第一熒光報告基團(tuán)為fam，第一熒光猝滅基團(tuán)為bhq1，第二熒光報告基團(tuán)為hex，第二熒光猝滅基團(tuán)為bhq1)。上述多重?zé)晒鈖cr檢測的擴(kuò)增反應(yīng)體系為：序號物料物料濃度用量(μl)11×pcr緩沖液1×102mgcl225mm83dntps10mm54mgmt-16-f150μm25mgmt-16-r150mm0.16mgmt-16-probe-150mm0.17actb-f150mm0.18actb-r150mm0.19actb-probe-150mm0.110taq酶5u0.511h2o純化水18.912經(jīng)dna亞硫酸鈉轉(zhuǎn)化試劑處理的dna模板2ng/ul513總體積50以上試劑組分：1×pcr緩沖液，mgcl2，taq酶，dntp均購自中國大連寶生物公司。上述多重?zé)晒鈖cr檢測的反應(yīng)條件是：95℃預(yù)變性5分鐘，1個循環(huán)；95℃變性25秒，56℃退火20秒，72℃延伸10秒，15個循環(huán)；95℃變性25秒，56℃退火35秒，72℃延伸10秒，30個循環(huán)，后30個循環(huán)在退火時檢測fam和hex熒光信號。上述檢測第一熒光報告基團(tuán)和第二熒光報告基團(tuán)的熒光信號的ct值，是采用mx3000p熒光pcr擴(kuò)增儀或mx3005p熒光pcr擴(kuò)增儀或abi7500熒光pcr擴(kuò)增儀，一次可檢測96份樣品(包括陰陽性對照)。根據(jù)熒光pcr擴(kuò)增儀顯示的ct值判斷結(jié)果：檢測反應(yīng)體系的fam和hex熒光強(qiáng)度，以hex信號達(dá)到設(shè)定閾值(ct＞18)時表明上樣dna量在允許范圍內(nèi)，fam信號結(jié)果可信；以fam達(dá)到設(shè)定的閾值時所需要的循環(huán)次數(shù)ct值作為陰陽性判斷的標(biāo)準(zhǔn)，ct值為0或30：陰性；ct小于30：陽性。實施例2本實施例中以mgmt基因啟動子甲基化突變?yōu)槔齺矸治霰景l(fā)明的多重?zé)晒鈖cr檢測mgmt基因甲基化突變的方法。實驗用2個質(zhì)粒，分別為mgmt甲基化陰性質(zhì)粒和mgmt甲基化陽性質(zhì)粒質(zhì)粒；50份正常一代測序驗證過的甲基化陰性樣本，50份一代測序驗證mgmt甲基化陽性的臨床腦膠質(zhì)瘤石蠟切片樣品。。利用上述熒光pcr檢測mgmt基因啟動子區(qū)甲基化的方法包括以下步驟：(1)樣品處理和模板提取質(zhì)控：樣品適用范圍包括手術(shù)切除的新鮮病理組織，甲醛固定石蠟包埋病例組織，石蠟切片標(biāo)本。新鮮病理組織，取綠豆大小，約1g重，使用qiagen公司組織dna提取試劑盒提取基因組dna，具體步驟按試劑盒操作說明。蠟塊樣品切成5～8μm切片，取5片，或已經(jīng)制成的5～8μm切片取5片，經(jīng)過二甲苯脫蠟后，使用qiagen公司石蠟包埋dna提取試劑盒提取基因組dna，具體步驟按試劑盒操作說明。所提dna溶于tris-hcl(10mmol/l，ph8.0)，經(jīng)紫外分光光度計檢測提取質(zhì)量，并確定濃度，用tris-hcl溶液(10mmol/l，ph8.0)調(diào)整dna濃度到100ng/μl或2ng/μl作為pcr擴(kuò)增的模板。(2)用本發(fā)明的多重?zé)晒鈖cr試劑盒(本實施例中的第一熒光報告基團(tuán)為fam，第一熒光猝滅基團(tuán)為bhq1，第二熒光報告基團(tuán)為hex，第二熒光猝滅基團(tuán)為bhq1)對步驟(1)所得的模板進(jìn)行熒光pcr擴(kuò)增檢測，配制反應(yīng)體系：序號物料物料濃度用量(μl)11×pcr緩沖液1×102mgcl225mm83dntps10mm54mgmt-16-f150μm25mgmt-16-r150mm0.16mgmt-16-probe-150mm0.17actb-f150mm0.18actb-r150mm0.19actb-probe-150mm0.110taq酶5u0.511h2o純化水18.912dna模板2ng/ul513總體積50所述熒光pcr的反應(yīng)條件如圖1所示：95℃變性25秒，56℃退火20秒，72℃延伸10秒，15個循環(huán)；95℃變性25秒，56℃退火20秒，72℃延伸10秒，30個循環(huán)。(3)檢測：采用mx3000p實時pcr擴(kuò)增儀(stratagene公司)后30個循環(huán)退火階段檢測fam和hex熒光信號，一次可以檢測94份樣品(包括陰陽性對照)。結(jié)果判斷：根據(jù)熒光pcr擴(kuò)增儀顯示的ct值判斷結(jié)果：檢測反應(yīng)體系的fam和hex熒光強(qiáng)度，以hex信號達(dá)到設(shè)定閾值(ct＞18)時表明上樣dna量在允許范圍內(nèi)，fam信號結(jié)果可信；以fam達(dá)到設(shè)定的閾值時所需要的循環(huán)次數(shù)ct值作為陰陽性判斷的標(biāo)準(zhǔn)，ct值為0或30：陰性；ct小于30：陽性，檢測結(jié)果具體如圖2和圖3所示。前述50份一代測序驗證過mgmt甲基化陰性的樣本經(jīng)本發(fā)明的體系檢測，只有陽性對照品有熒光信號，其他樣品無熒光信號，進(jìn)一步證明了熒光pcr的特異性。靈敏度分析：將甲基化突變質(zhì)粒從10的4次方連續(xù)10倍梯度稀釋，分別為10的3次方，10的2次方，10的1次方，10的0次方。每次反應(yīng)加入5μldna。結(jié)果表明本發(fā)明的熒光pcr方法的靈敏度高，5拷貝dna基因組即可檢出。選擇性能力分析：固定每次pcr反應(yīng)總dna用量，100ng/反應(yīng)和10ng/反應(yīng)。先將甲基化突變質(zhì)粒dna和野生型細(xì)胞系dna濃度都調(diào)整為20ng/μl和2ng/μl。這樣每個反應(yīng)加5μl模板即為100ng/反應(yīng)和10ng/反應(yīng)。按下述方法配置模擬dna模板。a：50％即為10的3次方甲基化突變細(xì)胞dna。b：30％取a液60μl后混入40μl10的3次方甲基化突變細(xì)胞dna，震蕩混均。c：20％取a液40μl后混入60μl10的3次方甲基化突變細(xì)胞dna，震蕩混均。d：15％取b液50μl后混入50μl10的3次方甲基化突變細(xì)胞dna，震蕩混均。e：10％取c液50μl后混入50μl10的3次方甲基化突變細(xì)胞dna，震蕩混均。f：5％取e液50μl后混入50μl10的3次方甲基化突變細(xì)胞dna，震蕩混均。g：1％取f液20μl后混入80μl10的3次方甲基化突變細(xì)胞dna，震蕩混均。h：0.5％取g液50μl后混入50μl10的3次方甲基化突變細(xì)胞dna，震蕩混均。i：0.1％取h液20μl后混入80μl10的3次方甲基化突變細(xì)胞dna，震蕩混均。結(jié)果表明本發(fā)明的熒光pcr方法的選擇性檢測能力為在10ng總dna中可以檢出5拷貝的突變dna，檢測能力為1％。重復(fù)性試驗：每個反應(yīng)分別加入突變甲基化質(zhì)粒dna10ng、1ng和100pg，重復(fù)10次進(jìn)行熒光pcr擴(kuò)增，10次ct值相差不到0.1個循環(huán)。收集手術(shù)切除的腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本共50例，其中男性31例，女性19例。年齡為36-71歲，平均年齡為55歲。對于甲基化突變，本發(fā)明檢測結(jié)果與dna測序結(jié)果完全一致：50例樣品中有23例發(fā)生mgmt甲基化突變，27例均為野生型。本發(fā)明多重?zé)晒鈖cr反應(yīng)就可以同時檢測mgmt基因甲基化突變，因此本發(fā)明準(zhǔn)、簡單、快捷可滿足突變的快速診斷。而且，多重?zé)晒鈖cr方法和傳統(tǒng)測序方法結(jié)果的符合率為100％，熒光pcr靈敏度和選擇性檢測能力高于傳統(tǒng)測序方法，10ng樣品dna中含1％的突變dna即可檢出。以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，故不能依此限定本發(fā)明實施的范圍，即依本發(fā)明專利范圍及說明書內(nèi)容所作的等效變化與修飾，皆應(yīng)仍屬本發(fā)明涵蓋的范圍內(nèi)。<110>廈門飛朔生物技術(shù)有限公司<120>一種用于檢測人類mgmt基因甲基化突變的多重?zé)晒鈖cr檢測試劑盒<160>6<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列<400>1cggatatgttgggatagttcg21<210>2<211>19<212>dna<213>人工序列<400>2ctcttccgaaaacgaaacg19<210>3<211>22<212>dna<213>人工序列<400>3tggtgatggaggaggtttagta22<210>4<211>22<212>dna<213>人工序列<400>4ccaataaaacctactcctccct22<210>5<211>23<212>dna<213>人工序列<400>5cccaaacactcaccaaatcgcaa23<210>6<211>26<212>dna<213>人工序列<400>6ccaccacccaacacacaataacaaac26當(dāng)前第1頁12