本發(fā)明涉及一種牙髓干細(xì)胞的制備方法，具體涉及一種應(yīng)用干細(xì)胞自身特性制備牙髓干細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)：

干細(xì)胞是未充分分化的細(xì)胞，具有自我更新與分化為特定組織器官的能力。牙髓干細(xì)胞(dentalpulpstemcells，dpscs)又稱牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞，是指牙髓內(nèi)可以快速增殖并且具有一定克隆形成能力的牙髓細(xì)胞，由gronthos等于2000年首次提出，它具有與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相似的免疫表型。

牙髓干細(xì)胞具有來源豐富、采集方便、免疫原性低、無倫理爭議等優(yōu)點(diǎn)。因此，牙髓干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)和組織工程修復(fù)中有著廣泛的應(yīng)用前景。牙髓干細(xì)胞在牙周組織缺損、牙周炎、牙髓組織再生中顯示出較強(qiáng)的優(yōu)勢。大規(guī)模培養(yǎng)穩(wěn)定可靠的dpscs已成為一種趨勢。

以往dpscs增殖能力較一般，nelsonf.lizier等發(fā)表的文獻(xiàn)“scaling-upofdentalpulpstemcellsisolatedfrommultipleniches”（文獻(xiàn)來源：plosone.2017;7(6)），其記載了p3代最高培養(yǎng)出1.8*10⁸個。

對干細(xì)胞表面的分子標(biāo)記進(jìn)行確認(rèn)是分離鑒定干細(xì)胞常用的手段，目前發(fā)現(xiàn)dpscs表達(dá)中胚層標(biāo)記物stro-1和cd146。stro-1是間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymalstemcells,mscs）的早期細(xì)胞標(biāo)志分子之一，能夠鑒定dpscs的未分化狀態(tài)。farzanehaghajani等發(fā)表的文獻(xiàn)“comparativeimmunophenotypiccharacteristics,proliferativefeatures,andosteogenicdifferentiationofstemcellsisolatedfromhumanpermanentanddeciduousteethwithbonemarrow”（文獻(xiàn)來源：molbiotechnol(2016)58:415–427），其記載了dpscs的表面標(biāo)志stro-1表面標(biāo)志一般＜5%。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供制備牙髓干細(xì)胞的方法，該方法縮短了原代培養(yǎng)的時間，而且增殖能力強(qiáng)，制備的牙髓干細(xì)胞具有很好的干細(xì)胞特征，分化潛力強(qiáng)。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種應(yīng)用干細(xì)胞自身特性制備牙髓干細(xì)胞的方法，該方法包含：

步驟1：選取牙齒樣本，破牙冠，從牙齒樣本的髓腔中抽取牙髓，使用緩沖溶液洗滌牙髓，將牙髓分成若干小塊，放入離心管內(nèi)；

步驟2：配制消化液，該消化液包含：氯化鈉注射液、膠原酶ⅰ、分散酶ⅱ（dispaseⅱ）、白蛋白、鎂鹽和鈣鹽，將該消化液加入步驟1中的離心管內(nèi)，將離心管密封，混合均勻后在37℃下消化；

步驟3：待離心管內(nèi)的小塊松散后，對離心管表面滅菌處理，加入消化終止液，終止消化；

步驟4：將步驟3得到的溶液進(jìn)行離心，去除上清液，在底部的沉淀加入msc原代培養(yǎng)基，使沉淀重懸后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，在5%co2，37℃下，進(jìn)行原代培養(yǎng)；

步驟5：當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時，收集上清液，并進(jìn)行超濾，收集上層濾網(wǎng)中的干細(xì)胞提取液，將該干細(xì)胞提取液加入到msc原代培養(yǎng)基中，得到傳代培養(yǎng)基；

步驟6：將步驟5中下層沉淀的細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時，將培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)基移出備用，用磷酸鹽緩沖液沖洗培養(yǎng)瓶，在培養(yǎng)瓶中加入稀釋的胰酶，將胰酶平鋪于培養(yǎng)瓶底部，進(jìn)行胰酶消化，消化時間不超過1min，加入上述備用的培養(yǎng)基終止消化；稀釋的胰酶為濃度為0.025%的胰酶；

步驟7：將步驟6消化得到的液體離心，底部沉淀的細(xì)胞加入到步驟5得到的傳代培養(yǎng)基中，混合均勻，按1×10²/cm²的細(xì)胞密度進(jìn)行種瓶，在5%co2，37℃的條件下進(jìn)行傳代培養(yǎng)；

步驟8：重復(fù)上述步驟6和7，進(jìn)行若干次傳代培養(yǎng)；

步驟9：將細(xì)胞凍存液置于凍存管中，在4℃下進(jìn)行預(yù)冷，凍存管中加入步驟8細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)得到的干細(xì)胞傳代培養(yǎng)基，細(xì)胞密度為1.5×10⁶~2×10⁶/1.5ml/管，逐漸降溫至-80℃，24h之后將凍存的細(xì)胞放入-196℃的液氮罐中保存。

其中，所述的msc原代培養(yǎng)基中包含：生長因子。

優(yōu)選地，在步驟1中，所述的緩沖溶液包含：0.9%氯化鈉注射液、10,000units/ml青霉素和10,000μg/ml鏈霉素。

其中，所述的氯化鈉注射液：青霉素：鏈霉素的體積比為198:1:1。

優(yōu)選地，在步驟2中，所述的鎂鹽包含：氯化鎂；所述的鈣鹽包含：氯化鈣。

其中，所述的消化液中各組分的濃度為：0.9%氯化鈉注射液、3%膠原酶ⅰ、4%分散酶ⅱ、1mol/l氯化鎂、200mg/ml氯化鈣和20%白蛋白。

其中，所述的0.9%氯化鈉注射液：1mol/l氯化鎂：200mg/ml氯化鈣：20%白蛋白的體積比為1ml：5μl：5μl：100μl；

其中，所述的3%膠原酶ⅰ的生物活性為270u/mg；

其中，所述的4%分散酶ⅱ的生物活性為0.85u/mg。

優(yōu)選地，在步驟3中，所述的終止液包含：0.9%氯化鈉注射液和20%白蛋白，所述的0.9%氯化鈉注射液：20%白蛋白的體積比為9：1。

優(yōu)選地，在步驟4中，所述的msc原代培養(yǎng)基包含：人類間充質(zhì)干細(xì)胞無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子和l-谷氨酰胺。

其中，所述的生長因子包含：成纖維細(xì)胞生長因子、肝細(xì)胞生長因子、表皮生長因子和血管內(nèi)皮生長因子。

其中，所述的人類間充質(zhì)干細(xì)胞無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基的體積：肝細(xì)胞生長因子的質(zhì)量：表皮生長因子的質(zhì)量：血管內(nèi)皮生長因子的質(zhì)量：基質(zhì)細(xì)胞衍生因子的質(zhì)量：l-谷氨酰胺的體積=100ml：1μg：2μg：2μg：2μg：100μl。

其中，所述的成纖維細(xì)胞生長因子的含量為100iu/ml。

優(yōu)選地，在步驟4中，所述的培養(yǎng)瓶為經(jīng)過處理的培養(yǎng)瓶，處理方法為：將貼壁試劑因子和磷酸鹽緩沖液以體積比10μl：1ml混合重懸后，加入培養(yǎng)瓶中，并搖晃培養(yǎng)瓶使貼壁試劑因子完全覆蓋住培養(yǎng)瓶底部。

優(yōu)選地，在步驟5中，所述的干細(xì)胞提取液：msc原代培養(yǎng)基的體積比為1：50。

優(yōu)選地，在步驟6中，所述的0.025%的胰酶為0.25%胰酶和磷酸鹽緩沖液以體積為1：9配制得到。

優(yōu)選地，在步驟9中，降溫速度為1℃/min；所述的細(xì)胞凍存液為無動物源血清的凍存液。

優(yōu)選地，在步驟1中，在選取牙齒樣本之前，用保存液將牙齒樣本保存，并對牙齒樣本進(jìn)行篩選。

其中，所述的保存液包含：0.9%氯化鈉注射液、青鏈霉素和白蛋白，所述的0.9%氯化鈉注射液：青鏈霉素：白蛋白的體積比為100ml：1ml：2ml。

其中，所述的青鏈霉素包含：10,000u/ml青霉素，10,000μg/ml鏈霉素。

其中，進(jìn)行牙齒樣本篩選時，同時具備以下條件：

包含乙肝、丙肝、梅毒、艾滋、cmv、ebv和htlv病毒中的任意一種或兩種以上檢測為陰性；牙齒未發(fā)炎；非自然脫落的牙齒。

本發(fā)明的應(yīng)用干細(xì)胞自身特性制備牙髓干細(xì)胞的方法，具有以下優(yōu)點(diǎn)：

（1）本發(fā)明的方法在原代培養(yǎng)第2-3天即可觀察到有貼壁細(xì)胞長出，第一次貼壁細(xì)胞出現(xiàn)時間短；

（2）本發(fā)明的方法在原代培養(yǎng)第7-10天，細(xì)胞融合度能夠達(dá)到80%以上，可進(jìn)行傳代操作，極大的減少原代培養(yǎng)時間；

（3）本發(fā)明的方法利用細(xì)胞貼壁試劑促進(jìn)干細(xì)胞貼壁生長，利用干細(xì)胞本身的特性在低密度種瓶下進(jìn)行篩選具有極強(qiáng)增殖能力的牙髓干細(xì)胞，利用多種細(xì)胞因子聯(lián)合本身細(xì)胞分泌的提取物進(jìn)行培養(yǎng)，使得細(xì)胞數(shù)目比其他方法制備的細(xì)胞數(shù)目擴(kuò)增了十幾倍，本發(fā)明可使細(xì)胞數(shù)在p3代達(dá)到2*10⁹個；

（4）本發(fā)明的方法制備的牙髓干細(xì)胞具有很好的干細(xì)胞特性，其間充質(zhì)干細(xì)胞的陽性指標(biāo)cd73、cd90、cd105均＞95%，其間充質(zhì)干細(xì)胞的陰性指標(biāo)cd34、cd31、cd45、hla-dr均＜2%；

（5）本發(fā)明的方法制備的牙髓干細(xì)胞具有很好的分化潛能，其p3代細(xì)胞表面標(biāo)志stro-1＞20%；

（6）本發(fā)明的方法制備的牙髓干細(xì)胞具有很好的免疫抑制活性，具有干細(xì)胞的特性。

附圖說明

圖1為牙髓干細(xì)胞培養(yǎng)第3天的細(xì)胞狀態(tài)圖。

圖2為牙髓干細(xì)胞培養(yǎng)第9天的細(xì)胞狀態(tài)圖。

圖3為牙髓干細(xì)胞傳代后的細(xì)胞狀態(tài)圖（細(xì)胞融合度已經(jīng)達(dá)到80%）。

圖4為牙髓干細(xì)胞的細(xì)胞生長曲線圖。

圖5為本發(fā)明的牙髓干細(xì)胞表面抗原cd31的檢測圖。

圖6為本發(fā)明的牙髓干細(xì)胞表面抗原cd34的檢測圖。

圖7為本發(fā)明的牙髓干細(xì)胞表面抗原cd45的檢測圖。

圖8為本發(fā)明的牙髓干細(xì)胞表面抗原h(huán)la-dr的檢測圖。

圖9為本發(fā)明的牙髓干細(xì)胞表面抗原cd73的檢測圖。

圖10為本發(fā)明的牙髓干細(xì)胞表面抗原cd90的檢測圖。

圖11為本發(fā)明的牙髓干細(xì)胞表面抗原cd105的檢測圖。

圖12為本發(fā)明的牙髓干細(xì)胞表面抗原stro-1的檢測圖。

圖13為牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞抑制免疫細(xì)胞能力的結(jié)果圖（a為顯微細(xì)胞圖，b為免疫活性細(xì)胞統(tǒng)計(jì)圖）。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的說明。

實(shí)施例1

一、牙齒樣本的保存

配置牙齒樣本保存液，該保存液的組份包含：0.9%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）氯化鈉注射液100ml、1ml青鏈霉素和2ml白蛋白，1ml青鏈霉素（gibco?，貨號15140-122）中含有10，000單位的青霉素（堿）（penicillin）和10，000μg的鏈霉素（堿）（streptomycin），將牙齒樣本保存在上述保存液中，保存溫度為2℃-20℃。上述白蛋白為20%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的人血清白蛋白（購自：山西康寶生物制品股份有限公司，10g/50ml/20%/瓶）

二、牙齒樣本的篩選

對牙齒樣本的要求，具體如下：

（1）乙肝、丙肝、梅毒、艾滋、cmv、ebv、htlv病毒檢測為陰性，其檢測方法為本領(lǐng)域的常規(guī)檢測方法，如乙肝hbv-dna檢測方法、丙型肝炎病毒抗體檢測等；

（2）牙齒未發(fā)炎；

（3）排除成人及兒童自然脫落的牙齒，自然脫落的牙齒牙髓組織完全萎縮，不能進(jìn)行培養(yǎng)；兒童拔除的乳牙、正畸牙，成人拔除的智齒可以采用，還可采用未侵襲牙髓組織的輕度蛀牙。

三、牙齒樣本的運(yùn)輸

運(yùn)輸條件為：在2-8℃下，12h內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。

四、牙髓干細(xì)胞的制備方法

1、培養(yǎng)瓶

人類間充質(zhì)干細(xì)胞促貼壁試劑（bioind公司，產(chǎn)品規(guī)格：05-752-1f）50μl+5ml磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffersaline，pbs）重懸后，加入到t75培養(yǎng)瓶中，搖晃培養(yǎng)瓶使貼壁試劑完全覆蓋住培養(yǎng)瓶底部，置于37℃培養(yǎng)箱中待用。上述磷酸鹽緩沖液的ph值為7.4。

2、msc原代培養(yǎng)基的配制

人類間充質(zhì)干細(xì)胞無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基（bioind公司，產(chǎn)品規(guī)格：05-200-1a）500ml+bfgf（堿性成纖維細(xì)胞生長因子）50000iu（internationalunit，生物效價的國際單位）+hgf（肝細(xì)胞生長因子）5μg+egf（表皮生長因子）10μg+vegf（血管內(nèi)皮生長因子）10μg+sdf-1（基質(zhì)細(xì)胞衍生因子）10μg+l-谷氨酰胺500μl。

上述各因子的介紹，具體如下：

（1）bfgf（堿性成纖維細(xì)胞生長因子）：bfgf（basicfibroblastgrowthfactor）是成纖維細(xì)胞生長因子家族的一個成員。已有證據(jù)表明：bfgf可以支持未分化的人類胚胎干細(xì)胞的干細(xì)胞特性，也能夠刺激中胚層來源的細(xì)胞，以及神經(jīng)外胚層、外胚層和內(nèi)胚層來源細(xì)胞的增殖。在體外，bfgf對內(nèi)皮細(xì)胞具有趨化和促進(jìn)有絲分裂的作用，并且能夠促進(jìn)神經(jīng)的分化、存活和再生。它已被證明在調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育和分化中至關(guān)重要，它可能在血管生成，組織修復(fù)，胚胎發(fā)育，以及神經(jīng)元功能的體內(nèi)的調(diào)制中發(fā)揮作用。

（2）hgf（肝細(xì)胞生長因子）：hgf（hepatocytegrowthfactor）是一種多肽生長因子，具有促進(jìn)包括肝細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、造血細(xì)胞等多種類型細(xì)胞的生長、遷移和形態(tài)發(fā)生的作用。

（3）egf（表皮生長因子）：egf（epidermalgrowthfactor）是一種多功能的生長因子，在體內(nèi)體外都對多種組織細(xì)胞有強(qiáng)烈的促分裂作用。egf同應(yīng)答細(xì)胞表面的特異受體結(jié)合，促進(jìn)受體二聚化并使細(xì)胞質(zhì)位點(diǎn)磷酸化。被激活的受體至少可與5種具有不同信號序列的蛋白結(jié)合，進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在翻譯水平上對蛋白質(zhì)的合成起調(diào)節(jié)作用。此外egf可提高細(xì)胞內(nèi)dna拓?fù)洚悩?gòu)酶活性，也可促進(jìn)一些與增殖有關(guān)的基因表達(dá)，如myc基因（一組癌基因）、fos基因（原癌基因）等。

（4）vegf（血管內(nèi)皮生長因子）：vegf（vascularendothelialgrowthfactor）早期亦稱作血管通透因子(vascularpermeabilityfactor,vpf)，是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的肝素結(jié)合生長因子(heparin-bindinggrowthfactor,hbgf)，可在體內(nèi)誘導(dǎo)血管新生。

（5）sdf-1（基質(zhì)細(xì)胞衍生因子）：sdf-1（stromalcell-derivedfactor1）又稱趨化因子cxcl12，對淋巴細(xì)胞有強(qiáng)烈的趨化作用并在發(fā)育中起重要作用，在胚胎發(fā)育中引導(dǎo)造血干細(xì)胞從胎兒肝臟到骨髓的遷徙。

（6）l-谷氨酰胺：l-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時十分重要。脫掉氨基后，l-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。l-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時間后會降解，但是確切的降解率一直沒有最終確定，其降解會導(dǎo)致氨的形成，而氨對于一些細(xì)胞具有毒性。

3、應(yīng)用干細(xì)胞自身特性制備牙髓干細(xì)胞的方法，具體包含：

步驟1：選取牙齒樣本，破牙冠，從牙齒樣本的髓腔中抽取牙髓，使用緩沖溶液洗滌牙髓，將牙髓分成若干小塊，放入15ml離心管內(nèi)；上述緩沖液的組份包含：0.9%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）氯化鈉注射液495ml+10,000u/ml（units/ml）青霉素2.5ml+10,000μg/ml鏈霉素2.5ml；

步驟2：配制消化液，該消化液包含：0.9%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）氯化鈉注射液2ml、3%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）膠原酶ⅰ270u/mg、4%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）分散酶ⅱ（dispaseⅱ）0.85u/mg（units/mg）、20%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）白蛋白200μl、1mol/l氯化鎂10μl、200mg/ml氯化鈣10μl，將2ml消化液加入步驟1中的15ml離心管內(nèi)，左右搖晃使組織塊分散均勻，擰緊管蓋，用封口膜封嚴(yán)，貼好標(biāo)簽，搖晃混合后放入37℃恒溫水浴槽中，每分鐘取出離心管搖晃一次，使組織與消化液充分混勻，消化15min；上述白蛋白為20%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的人血清白蛋白（購自：山西康寶生物制品股份有限公司，10g/50ml/20%/瓶）；

步驟3：待離心管內(nèi)的小塊被消化松散后，對離心管表面滅菌處理，加入消化終止液至14ml終止消化，用槍頭吹打懸浮液，使細(xì)胞與組織盡可能脫離；上述消化終止液包含0.9%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）氯化鈉注射液和20%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）白蛋白，0.9%氯化鈉注射液：20%白蛋白體積比為9：1；

步驟4：將步驟3得到的溶液在1200rpm轉(zhuǎn)速下離心10min，去除上清液，在底部的沉淀中加入msc原代培養(yǎng)基10ml中，用槍頭吹打，使沉淀重懸后轉(zhuǎn)移至75cm²培養(yǎng)瓶中，利用細(xì)胞貼壁試劑進(jìn)行包被促進(jìn)干細(xì)胞貼壁生長，原代培養(yǎng)條件為5%co2（空氣：co2的體積比為95：5），37℃；在培養(yǎng)的第7天向75cm²培養(yǎng)瓶中補(bǔ)加5mlmsc原代培養(yǎng)基；

步驟5：當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時，收集上清液，使用50ml超濾管進(jìn)行超濾，在12000rpm轉(zhuǎn)速下離心10min，收集上層濾網(wǎng)中的干細(xì)胞提取液，將該干細(xì)胞提取液加入到msc原代培養(yǎng)基中，上述干細(xì)胞提取液：msc原代培養(yǎng)基的體積比為1：50，得到傳代培養(yǎng)基，多余的提取物需放置-20℃冰箱中；

步驟6：將步驟5中下層沉淀的細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時（細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底部80%～90%面積），將培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)基移出備用，移液管吸取pbs沖洗培養(yǎng)瓶底部，沖洗完后將pbs吸出移入廢液缸中，在培養(yǎng)瓶中加入稀釋的胰酶，將胰酶平鋪于培養(yǎng)瓶底部，進(jìn)行胰酶消化，消化時間不超過1min，加入上述備用的培養(yǎng)基終止消化；稀釋的胰酶為0.25%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）胰酶：pbs體積比為1:9的胰酶；

步驟7：將步驟6消化得到的液體離心，底部沉淀的細(xì)胞加入到步驟5得到的傳代培養(yǎng)基中，混合均勻，利用干細(xì)胞本身的特性在低密度種瓶下進(jìn)行篩選具有極強(qiáng)增殖能力的牙髓干細(xì)胞，按1×10²/cm²的細(xì)胞密度進(jìn)行種瓶，在培養(yǎng)瓶上標(biāo)明傳代時間、代次、樣本編號，在5%co2，37℃的條件下進(jìn)行傳代培養(yǎng)；

步驟8：重復(fù)上述步驟6和7，進(jìn)行若干次傳代培養(yǎng)；

步驟9：將細(xì)胞凍存液置于凍存管中，在4℃下進(jìn)行預(yù)冷，凍存管中加入步驟8細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)得到的干細(xì)胞傳代培養(yǎng)基，細(xì)胞密度為1.5×10⁶~2×10⁶/1.5ml/管，細(xì)胞存活率＞95%，以1℃/min的速度降溫至-80℃，24h之后將凍存的細(xì)胞放入-196℃的液氮罐中保存。上述細(xì)胞凍存液為無動物源血清的凍存液（bioind公司，產(chǎn)品規(guī)格：05-712-1e）。

在上述步驟9中，采用本領(lǐng)域常規(guī)方法，如臺盼藍(lán)染色和鏡檢法確定細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率＞95%為凍存標(biāo)準(zhǔn)。

在上述方法中，在msc原代培養(yǎng)基中加入牙髓干細(xì)胞的提取液作為傳代培養(yǎng)的培養(yǎng)基（步驟5），一般培養(yǎng)細(xì)胞都需要添加細(xì)胞因子，常規(guī)的做法為人為地添加某些已知的人工合成的細(xì)胞因子，而本發(fā)明的方法則是利用干細(xì)胞自身強(qiáng)大的分泌能力，在培養(yǎng)過程中干細(xì)胞會分泌出各種細(xì)胞因子以及某些元素到培養(yǎng)基中，作為細(xì)胞傳代時的營養(yǎng)成分。

在上述方法中，在低密度下接種（步驟7），用比現(xiàn)有技術(shù)培養(yǎng)密度低100倍的情況下，篩選出增殖能力超強(qiáng)并且具有較強(qiáng)的獨(dú)立生存能力的干細(xì)胞。干細(xì)胞相對比其他成體細(xì)胞增殖能力旺盛，干細(xì)胞往往在極低的密度下也能生長。牙髓組織通過貼壁消化方法獲得的細(xì)胞仍然存在不同細(xì)胞亞群，它們的功能和生長特點(diǎn)有些差異，其中有些亞群細(xì)胞對培養(yǎng)環(huán)境有較大的適應(yīng)性和具有較強(qiáng)的獨(dú)立生存能力，細(xì)胞集落率高，因此通過低密度接種篩選出這些增殖和生存能力強(qiáng)的細(xì)胞。

五、牙髓干細(xì)胞的檢測

1、牙髓干細(xì)胞的生長狀態(tài)的檢測

采用本領(lǐng)域常規(guī)方法在顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長狀況，觀察到原代培養(yǎng)第2-3天即可觀察到有貼壁細(xì)胞長出，第一次貼壁細(xì)胞出現(xiàn)時間短。而且，原代培養(yǎng)第7-10天細(xì)胞融合度已經(jīng)達(dá)到80%，即可進(jìn)行傳代操作，第一次傳代時間短，極大的減少原代培養(yǎng)時間。

如圖1所示，為牙髓干細(xì)胞培養(yǎng)第3天的細(xì)胞狀態(tài)圖，如圖2所示，為牙髓干細(xì)胞培養(yǎng)第9天的細(xì)胞狀態(tài)圖，如圖3所示，為牙髓干細(xì)胞傳代后的細(xì)胞狀態(tài)圖（細(xì)胞融合度已經(jīng)達(dá)到80%），從圖1、2和3可以看出，第3天時細(xì)胞形態(tài)大部分呈梭形，密度小，第9天時細(xì)胞集落明顯增大，細(xì)胞生長密度增加，排列方向不一致，隨著培養(yǎng)時間越長，細(xì)胞在培養(yǎng)基上的面積越來越大，達(dá)到80%時基本鋪滿了整個培養(yǎng)基，呈旋渦狀排列，細(xì)胞均一性好、細(xì)胞狀態(tài)佳。

采用本領(lǐng)域常規(guī)方法測定細(xì)胞的生長曲線，如mtt法（檢測細(xì)胞存活和生長的方法）。如圖4所示，為牙髓干細(xì)胞的細(xì)胞生長曲線圖（p0為原代），在經(jīng)過第2次傳代（p2）培養(yǎng)后，細(xì)胞的數(shù)目急劇增加，從第1次傳代（p1）約為8*10⁷的細(xì)胞數(shù)目在p2后增加到接近8*10⁸的細(xì)胞數(shù)目，到第3次傳代（p3）時，細(xì)胞數(shù)目已經(jīng)接近2*10⁹，擴(kuò)增倍數(shù)接近50倍，而“scaling-upofdentalpulpstemcellsisolatedfrommultipleniches”（plosone.2012;7(6)）中p3代細(xì)胞數(shù)目為1.8*10⁸個。因此，表明本發(fā)明的制備方法能夠使細(xì)胞生長狀態(tài)好，增殖能力強(qiáng)，能夠大量擴(kuò)增。

2、牙髓干細(xì)胞的表面抗原檢測

采用本領(lǐng)域常規(guī)檢測方法（如流式細(xì)胞儀檢測）對p3代牙髓干細(xì)胞的表面抗原cd31、cd34、cd45、hla-dr、cd73、cd90、cd105和stro-1進(jìn)行檢測。

cd31又稱血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子，屬于免疫球蛋白超家族成員；cd34是i型跨膜糖蛋白，cd34在原始細(xì)胞分化為成熟細(xì)胞后表達(dá)下降；cd45又稱白細(xì)胞共同抗原，可表達(dá)于成熟紅細(xì)胞、血小板表面；hla-dr是人類白細(xì)胞抗原dr；cd73又稱為胞外5核苷酸酶，是糖基磷脂酰肌醇(gpi)錨定于細(xì)胞膜外表面的一種糖蛋白；cd90（又稱thy-1）與細(xì)胞的黏附、分化、細(xì)胞間相互作用有關(guān)，是人類微血管內(nèi)皮細(xì)胞活化的標(biāo)記；cd105又稱內(nèi)皮素，是轉(zhuǎn)化生長因子β超家族的成員；stro-1是骨髓基質(zhì)干細(xì)胞和幼紅細(xì)胞前體細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞表面蛋白，對于stro-1陽性的細(xì)胞，其成纖維細(xì)胞克隆形成單位顯著增加，能夠分化形成多向間質(zhì)細(xì)胞系。

在mscs表面不表達(dá)cd31、cd34、cd45和hla-dr，表達(dá)cd73、cd90、cd105和stro-1。

如圖5所示，為本發(fā)明的牙髓干細(xì)胞表面抗原cd31的檢測圖，cd31的表達(dá)比例為0.60%；如圖6所示，為本發(fā)明的牙髓干細(xì)胞表面抗原cd34的檢測圖，cd34的表達(dá)比例為0.94%；如圖7所示，為本發(fā)明的牙髓干細(xì)胞表面抗原cd45的檢測圖，cd45的表達(dá)比例為0.47%；如圖8所示，為本發(fā)明的牙髓干細(xì)胞表面抗原h(huán)la-dr的檢測圖，hla-dr的表達(dá)比例為1.10%；如圖9所示，為本發(fā)明的牙髓干細(xì)胞表面抗原cd73的檢測圖，cd73的表達(dá)比例為99.2%；如圖10所示，為本發(fā)明的牙髓干細(xì)胞表面抗原cd90的檢測圖，cd90的表達(dá)比例為97.2%；如圖11所示，為本發(fā)明的牙髓干細(xì)胞表面抗原cd105的檢測圖，cd105的表達(dá)比例為99.6%；如圖12所示，為本發(fā)明的牙髓干細(xì)胞表面抗原stro-1的檢測圖，stro-1的表達(dá)比例為27.0%。

通過上述檢測結(jié)果可以看出，間充質(zhì)干細(xì)胞的陽性指標(biāo)cd73、cd90、cd105均＞95%，其間充質(zhì)干細(xì)胞的陰性指標(biāo)cd34、cd31、cd45、hla-dr均＜2%。因此，本發(fā)明培養(yǎng)的細(xì)胞符合人間充質(zhì)干細(xì)胞的表面分子的特性。

本發(fā)明培養(yǎng)的p3代細(xì)胞表面標(biāo)志stro-1＞20%，“proliferativefeatures,andosteogenicdifferentiationofstemcellsisolatedfromhumanpermanentanddeciduousteethwithbonemarrow”（molbiotechnol,2016,58:415-427）記載了dpsc中p2、p3代細(xì)胞表面標(biāo)志stro-1＜5%，“人牙周韌帶細(xì)胞和牙髓細(xì)胞表型特征的比較”（華西口腔醫(yī)學(xué)雜質(zhì)，第27卷第1期2009年2月）記載了dpsc中p3代細(xì)胞表面標(biāo)志stro-1＜20%。因此，本發(fā)明培養(yǎng)的細(xì)胞的分化能力高，具有干性細(xì)胞的特性。

3、牙髓干細(xì)胞的免疫抑制活性的檢測

mscs不僅具有多種分化潛能，而且還具有免疫調(diào)節(jié)能力和低免疫原性，其能夠抑制t細(xì)胞的增殖，還對其他免疫細(xì)胞具有廣泛的調(diào)節(jié)作用，如其可以抑制nk介導(dǎo)的殺傷作用。

本發(fā)明通過流式細(xì)胞儀（flowcytometry）分析沒有被激活的人外周血單個核細(xì)胞（notactivated-humanpmbc）、被激活的人外周血單個核細(xì)胞（activated-humanpmbc）和激活的人外周血單個核細(xì)胞+p3代牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞（activated-humanpmbc+dpsc-p3）的免疫抑制活性（immunesuppressionactivity），如圖13所示，為牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞抑制免疫細(xì)胞能力的結(jié)果圖，a為顯微細(xì)胞圖，b為免疫活性細(xì)胞統(tǒng)計(jì)圖，發(fā)現(xiàn)被激活的人外周血單個核細(xì)胞中具有免疫活性的細(xì)胞的百分比接近零，被激活的人外周血單個核細(xì)胞中幾乎90%的細(xì)胞具有免疫活性，但是激活的人外周血單個核細(xì)胞+p3代牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞中具有免疫活性的細(xì)胞數(shù)目急劇下降，僅不到40%的細(xì)胞具有免疫活性。因此，表明dpsc具有顯著的抑制免疫活性的作用，證明了本發(fā)明制備的dpsc細(xì)胞具有很好干細(xì)胞的特性。

4、凍存細(xì)胞復(fù)蘇活率

采用常規(guī)檢測方法，凍存后細(xì)胞復(fù)蘇活率根據(jù)凍存時間長短略有不同，檢測凍存1年的細(xì)胞的復(fù)蘇活率，其復(fù)蘇活率大于90%。

本發(fā)明的方法能夠用于構(gòu)建牙髓干細(xì)胞工作庫。使用該方法可生產(chǎn)出大量同批次的細(xì)胞樣本，按照1*10⁶/kg的干細(xì)胞用量，僅一顆牙齒就可為50kg的人治療200次以上，為大規(guī)模生產(chǎn)可臨床化使用的牙髓干細(xì)胞提供了新方法。

綜上所述，本發(fā)明的應(yīng)用干細(xì)胞自身特性制備牙髓干細(xì)胞的方法，該方法縮短了原代培養(yǎng)的時間，而且增殖能力強(qiáng)，制備的牙髓干細(xì)胞具有很好的干細(xì)胞特征，分化潛力強(qiáng)。

盡管本發(fā)明的內(nèi)容已經(jīng)通過上述優(yōu)選實(shí)施例作了詳細(xì)介紹，但應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到上述的描述不應(yīng)被認(rèn)為是對本發(fā)明的限制。在本領(lǐng)域技術(shù)人員閱讀了上述內(nèi)容后，對于本發(fā)明的多種修改和替代都將是顯而易見的。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)由所附的權(quán)利要求來限定。