本發(fā)明涉及細(xì)胞分離
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及了一種人臍帶組織消化方法。
背景技術(shù)：
：間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcell，msc)可在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下，分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經(jīng)、肝、心肌、內(nèi)皮等多種組織細(xì)胞，且在連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細(xì)胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復(fù)。間充質(zhì)干細(xì)胞根據(jù)存在組織的不通，主要包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。其中，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞相比骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有來(lái)源豐富、成本低、對(duì)捐獻(xiàn)者無(wú)損害等優(yōu)勢(shì)，具有更加廣闊的前景。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞大量存在于臍帶華通氏膠和血管周圍組織中，具有自我更新、增殖和多向分化潛能。目前，從臍帶中分離mscs常用的方法有組織貼壁法和酶消化法，由于組織貼壁法時(shí)間長(zhǎng)，獲取率和活性均不高，所以多采用后者。酶消化法在酶的選擇與消化時(shí)間上沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，存在的問(wèn)題主要有：組織塊徹底消化時(shí)間長(zhǎng)；消化酶種類單一，不能徹底消化透明質(zhì)酸、膠原纖維；單純?cè)黾用傅膭┝?，?huì)破壞游離出的細(xì)胞表面蛋白如粘附因子，使細(xì)胞活力與貼壁能力受到影響。中國(guó)專利，申請(qǐng)公告號(hào)cn104988118a，酶消化的過(guò)程中采用透明質(zhì)酸酶和abc酶聯(lián)合消化沃頓膠，整體上可以獲得細(xì)胞品質(zhì)最優(yōu)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，并且避免了胰酶和膠原酶長(zhǎng)期消化對(duì)細(xì)胞體的影響，最終制備得到的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞獲取率較高；并且獲得的干細(xì)胞具有更高的細(xì)胞活性和分化潛能。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：基于
背景技術(shù)：
存在的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提出了一種人臍帶組織消化方法，從臍帶中獲取華通氏膠，并用不同的組織消化酶進(jìn)行兩次消化，然后進(jìn)行過(guò)濾、離心獲得所需要的間充質(zhì)干細(xì)胞，該方法的細(xì)胞獲取率高且細(xì)胞具有較高的活性和分化潛能。一種人臍帶組織消化方法，方法步驟如下：s1：臍帶預(yù)處理：產(chǎn)房中將臍帶剝離胎兒后放入臍帶運(yùn)輸液中，4℃冷藏備用；取出臍帶組織放入預(yù)冷的組織清洗液中清洗兩次；清洗后的臍帶組織剪成4-5cm的小段，在清洗液中剝離臍帶外壁和血管，即可獲得透明的膠狀物質(zhì)即華通氏膠；s2：一次消化：將s1獲得的華通氏膠清洗后剪碎成1-2mm3的碎塊，加入1-2倍體積的組織消化液，加入1-1.5倍體積的組織消化酶，于37℃振蕩培養(yǎng)箱中消化1.5-2h，直至無(wú)成形組織塊；s3：二次消化：s2結(jié)束后加入胰酶繼續(xù)消化10min，即完成組織消化，在消化漿液中就具有較多游離出來(lái)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；s4：過(guò)濾：將s3中所得的消化后的組織置于dmem培養(yǎng)基中，混勻后靜置2min以便于未消化的組織塊沉降，然后過(guò)100um篩網(wǎng)去除未消化的組織塊；s5：離心：將s4中所得的細(xì)胞懸液進(jìn)行一次離心，去除上清液；將得到的細(xì)胞組織放入dmem培養(yǎng)基清洗一次，進(jìn)行二次離心，去上清液即得所需要的細(xì)胞組織。優(yōu)選的，所述s2中組織消化酶的制備：將膠原酶、透明質(zhì)酸酶和dna酶放入dmem培養(yǎng)基中，并通過(guò)0.22um濾膜過(guò)濾除菌，于37℃預(yù)溫備用。優(yōu)選的，所述膠原酶、透明質(zhì)酸酶和dna酶添加質(zhì)量比例為(40-60)∶(40-60)∶1。優(yōu)選的，所述s3中胰酶的質(zhì)量濃度為0.02-0.08％。優(yōu)選的，所述s5中一次離心的轉(zhuǎn)速為2000rpm，時(shí)間為10min；二次離心的轉(zhuǎn)速為2000rpm，時(shí)間為5min。一種人臍帶組織消化方法可應(yīng)用于分離臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。從華通氏膠中分離制備的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可以直接接種，接種密度由組織量決定，約10ml組織接種一個(gè)15cmbd培養(yǎng)皿，約5-6ml組織接種一個(gè)t75培養(yǎng)瓶；接種的細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)三天，三天后全量換液去除雜物，之后每3天半量或全量換液，細(xì)胞長(zhǎng)至80-90％時(shí)傳代或凍存；從華通氏膠中分離制備的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可以進(jìn)行凍存，所得的原代細(xì)胞可以直接加入適量?jī)龃嬉?，分裝凍存，凍存密度可以根據(jù)組織量決定，約5-6ml組織凍存一支，復(fù)蘇時(shí)可以直接接種一個(gè)t75培養(yǎng)瓶，根據(jù)上述培養(yǎng)方法培養(yǎng)原代細(xì)胞。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的有益效果在于：本發(fā)明提出的一種人臍帶組織消化方法，該方法采用兩次消化，一次消化中將膠原酶、透明質(zhì)酸酶和dna酶進(jìn)行復(fù)配，對(duì)臍帶華通氏膠進(jìn)行消化，該消化酶可有效降低消化粘稠度，對(duì)細(xì)胞損傷小，該組織消化酶的酶解速率高，縮短了臍帶組織的消化時(shí)間；二次消化中采用胰酶，使細(xì)胞分離的更加完全。本發(fā)明提出的方法避免了膠原酶和胰酶等消化酶長(zhǎng)期消化對(duì)細(xì)胞體的影響，最終得到的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞獲取率高且具有較高的活性和分化潛能。附圖說(shuō)明圖1為貼壁法培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞第三周的掃描電鏡圖；圖2為實(shí)施例3的方法培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞第五天的掃描電鏡圖；圖3為實(shí)施例3的方法培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞第六天的掃描電鏡圖；圖4為實(shí)施例3的方法培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞第七天的掃描電鏡圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步解說(shuō)。實(shí)施例1一種人臍帶組織消化方法，方法步驟如下：組織消化酶的配制：將膠原酶、透明質(zhì)酸酶和dna酶放入dmem培養(yǎng)基中，并通過(guò)0.22um濾膜過(guò)濾除菌，于37℃預(yù)溫備用；膠原酶、透明質(zhì)酸酶和dna酶添加質(zhì)量比例為40∶40∶1。s1：臍帶預(yù)處理：產(chǎn)房中將臍帶剝離胎兒后放入臍帶運(yùn)輸液中，4℃冷藏備用；取出臍帶組織放入預(yù)冷的組織清洗液中清洗兩次；清洗后的臍帶組織剪成4-5cm的小段，在清洗液中剝離臍帶外壁和血管，即可獲得透明的膠狀物質(zhì)即華通氏膠；s2：一次消化：將s1獲得的華通氏膠清洗后剪碎成1-2mm3的碎塊，加入1倍體積的組織消化液，加入1倍體積的組織消化酶，于37℃振蕩培養(yǎng)箱中消化2h，直至無(wú)成形組織塊；s3：二次消化：s2結(jié)束后加入質(zhì)量濃度為0.02％胰酶繼續(xù)消化10min，即完成組織消化，在消化漿液中就具有較多游離出來(lái)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；s4：過(guò)濾：將s3中所得的消化后的組織置于dmem培養(yǎng)基中，混勻后靜置2min以便于未消化的組織塊沉降，然后過(guò)100um篩網(wǎng)去除未消化的組織塊；s5：離心：將s4中所得的細(xì)胞懸液進(jìn)行一次離心，轉(zhuǎn)速為2000rpm，時(shí)間為10min，去除上清液；將得到的細(xì)胞組織放入dmem培養(yǎng)基清洗一次，進(jìn)行二次離心2000rpm，時(shí)間為5min，去上清液即得所需要的細(xì)胞組織。實(shí)施例2一種人臍帶組織消化方法，方法步驟如下：組織消化酶的配制：將膠原酶、透明質(zhì)酸酶和dna酶放入dmem培養(yǎng)基中，并通過(guò)0.22um濾膜過(guò)濾除菌，于37℃預(yù)溫備用；膠原酶、透明質(zhì)酸酶和dna酶添加質(zhì)量比例為60∶60∶1。s1：臍帶預(yù)處理：產(chǎn)房中將臍帶剝離胎兒后放入臍帶運(yùn)輸液中，4℃冷藏備用；取出臍帶組織放入預(yù)冷的組織清洗液中清洗兩次；清洗后的臍帶組織剪成4-5cm的小段，在清洗液中剝離臍帶外壁和血管，即可獲得透明的膠狀物質(zhì)即華通氏膠；s2：一次消化：將s1獲得的華通氏膠清洗后剪碎成1-2mm3的碎塊，加入2倍體積的組織消化液，加入1.5倍體積的組織消化酶，于37℃振蕩培養(yǎng)箱中消化1.5h，直至無(wú)成形組織塊；s3：二次消化：s2結(jié)束后加入質(zhì)量濃度為0.08％胰酶繼續(xù)消化10min，即完成組織消化，在消化漿液中就具有較多游離出來(lái)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；s4：過(guò)濾：將s3中所得的消化后的組織置于dmem培養(yǎng)基中，混勻后靜置2min以便于未消化的組織塊沉降，然后過(guò)100um篩網(wǎng)去除未消化的組織塊；s5：離心：將s4中所得的細(xì)胞懸液進(jìn)行一次離心，轉(zhuǎn)速為2000rpm，時(shí)間為10min，去除上清液；將得到的細(xì)胞組織放入dmem培養(yǎng)基清洗一次，進(jìn)行二次離心2000rpm，時(shí)間為5min，去上清液即得所需要的細(xì)胞組織。實(shí)施例3一種人臍帶組織消化方法，方法步驟如下：組織消化酶的配制：將膠原酶、透明質(zhì)酸酶和dna酶放入dmem培養(yǎng)基中，并通過(guò)0.22um濾膜過(guò)濾除菌，于37℃預(yù)溫備用；膠原酶、透明質(zhì)酸酶和dna酶添加質(zhì)量比例為50∶50∶1。s1：臍帶預(yù)處理：產(chǎn)房中將臍帶剝離胎兒后放入臍帶運(yùn)輸液中，4℃冷藏備用；取出臍帶組織放入預(yù)冷的組織清洗液中清洗兩次；清洗后的臍帶組織剪成4-5cm的小段，在清洗液中剝離臍帶外壁和血管，即可獲得透明的膠狀物質(zhì)即華通氏膠；s2：一次消化：將s1獲得的華通氏膠清洗后剪碎成1-2mm3的碎塊，加入1.5倍體積的組織消化液，加入1.2倍體積的組織消化酶，于37℃振蕩培養(yǎng)箱中消化1.8h，直至無(wú)成形組織塊；s3：二次消化：s2結(jié)束后加入質(zhì)量濃度為0.05％胰酶繼續(xù)消化10min，即完成組織消化，在消化漿液中就具有較多游離出來(lái)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；s4：過(guò)濾：將s3中所得的消化后的組織置于dmem培養(yǎng)基中，混勻后靜置2min以便于未消化的組織塊沉降，然后過(guò)100um篩網(wǎng)去除未消化的組織塊；s5：離心：將s4中所得的細(xì)胞懸液進(jìn)行一次離心，轉(zhuǎn)速為2000rpm，時(shí)間為10min，去除上清液；將得到的細(xì)胞組織放入dmem培養(yǎng)基清洗一次，進(jìn)行二次離心2000rpm，時(shí)間為5min，去上清液即得所需要的細(xì)胞組織。一、掃描電鏡結(jié)果分析根據(jù)圖1-4可得到以下結(jié)論：由圖1可知，采用貼壁法培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，第三周才出現(xiàn)較多的組織細(xì)胞，其培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)且細(xì)胞分布不均勻；由圖2-4可知，采用本發(fā)明的方法培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，在第五天出現(xiàn)均勻的細(xì)胞分布，在第六天和第七天的掃描電鏡圖中可以看出細(xì)胞在均勻快速的生長(zhǎng)，說(shuō)明該消化方法效率高且細(xì)胞生長(zhǎng)優(yōu)良。二、細(xì)胞表面抗原的流式檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法：1)采用實(shí)施例3的方法對(duì)人臍帶組織進(jìn)行消化所獲得的細(xì)胞。2)在每個(gè)流式檢測(cè)管中加入50ul的稀釋后的一抗；在空白管或同型對(duì)照管中加入50ul緩沖液，細(xì)胞濃度范圍2-0.03ug/106細(xì)胞。3)在各管中分別加入50ul細(xì)胞懸液，并輕輕混勻。4)避光冰浴或在4℃冰箱中孵育20分鐘。5)孵育完成后，加入緩沖液(每流式檢測(cè)管中加2ml)，4℃下400g離心5分鐘，并棄去上清。6)重復(fù)洗滌過(guò)程3次。7)重懸細(xì)胞后上流式儀檢測(cè)。8)使用直接標(biāo)記一抗，用500ul緩沖液重懸細(xì)胞后上機(jī)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表型：應(yīng)該表達(dá)的一種表面標(biāo)記cd73、cd90和cd105必須為陽(yáng)性，陽(yáng)性率不低于95％；同時(shí)為了保證消化酶獲得的干細(xì)胞中沒(méi)有混雜其它細(xì)胞，選取一組已知的間充質(zhì)干細(xì)胞不表達(dá)的表型作為輔助，證實(shí)我們方法的優(yōu)越性。cd34、cd45、cd14、hla-dr、iggpe、iggecd、iggfitc，陽(yáng)性率不得超過(guò)2％。表1本發(fā)明的方法得到的細(xì)胞表面抗原的陽(yáng)性率表面抗原cd34cd45cd14hla-driggpeiggecdiggfitccd73cd90cd105陽(yáng)性率0.1％0.3％0.3％0.2％0.1％0.4％0.3％99.77％99.89％99.82％表2為用文獻(xiàn)的方法得到的細(xì)胞表面抗原的陽(yáng)性率表面抗原cd34cd45cd14hla-driggpeiggecdiggfitccd73cd90cd105陽(yáng)性率1.5％1.4％0.8％0.7％0.3％0.8％0.6％67.67％89.36％77.35％實(shí)驗(yàn)結(jié)論：說(shuō)明本發(fā)明所制得的消化酶，用于消化得到的細(xì)胞純度更高。以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)12