本發(fā)明涉及一種可同時檢測和鑒別偽狂犬病毒(prv)、豬細小病毒(ppv)和豬圓環(huán)病毒2型(pcv-2)的一步法多重熒光pcr檢測試劑盒及引物和探針，可實現(xiàn)一次采樣，一次分析，同時檢測和區(qū)分3種豬病毒的目的，屬于檢驗檢疫領域。
背景技術：
：偽狂犬病病毒(prv)、豬細小病毒(ppv)和豬圓環(huán)病毒2型(pcv-2)是引起豬多系統(tǒng)疾病的常見病原，經(jīng)常混合感染，診斷和防治比較困難，是危害養(yǎng)豬業(yè)最為嚴重的幾種病原，是世界各國的重點防控疫病，也是我國養(yǎng)豬場檢疫凈化的主要對象。目前，針對上述幾種豬病病原建立了多種分子檢測技術，如pcr和熒光pcr技術等，在這些疫病的診斷和防控中發(fā)揮了重要作用。但目前所建立的方法多是針對一種病原的單目標檢測，在實際檢測中需要重復多次，才能完成檢測不同病原的目的，檢測工作量大且時間長，不能滿足大批量動物檢疫快速通關的實際需要。且難以實現(xiàn)實際樣品中大量存在的混合感染以及癥狀相似疫病的鑒別診斷。在建立單目標病原檢測技術的同時，各國獸醫(yī)機構(gòu)也相繼研制了可同時檢測牛常見病毒的多重pcr，但傳統(tǒng)pcr技術靈敏度低、結(jié)果不易判定等缺點限制了其在多重檢測中的應用。本研究利用熒光pcr技術在核酸檢測方面具有的特異、敏感等特性，建立了prv、ppv和pcv-2三種豬病毒一步法多重熒光pcr檢測和鑒別方法并組裝成試劑盒，可以實現(xiàn)一次采樣，一次分析，可同時檢測和鑒別3種重要豬病的目的，不僅減少了檢測的工作量和成本，且能在最短的時間內(nèi)完成疫病的檢測，為疾病防治贏得時間。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一個目的是提供特異性強、靈敏度高的同時檢測和鑒別偽狂犬病毒(prv)、豬細小病毒(ppv)和豬圓環(huán)病毒2型(pcv-2)的多重熒光pcr引物和探針。本發(fā)明的另一個目的是提供快速、準確、使用方便的同時檢測和鑒別偽狂犬病毒(prv)、豬細小病毒(ppv)和豬圓環(huán)病毒2型(pcv-2)的一步法多重熒光pcr檢測試劑盒。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案：在序列比對分析的基礎上，針對偽狂犬病毒ge基因、豬細小病毒ns1基因和豬圓環(huán)病毒2型orf2基因，分別設計并篩選出能覆蓋大部分分離株又適合多重檢測并能進行鑒別的引物和探針(序列見表1)。偽狂犬病毒(prv)引物對由1條正向引物、1條反向引物和1條探針組成，豬細小病毒(ppv)引物對由1條正向引物、1條反向引物和1條探針組成，豬圓環(huán)病毒2型(pcv-2)引物對由1條正向引物、3條反向引物和2條探針組成，多重反應體系中引物混合物是這7條引物組成的混合物，探針混合物是這4條探針組成的探針混合物，經(jīng)過多重熒光pcr反應，可以實現(xiàn)三種病原的同時檢測和鑒別。表1偽狂犬病毒、豬細小病毒和豬圓環(huán)病毒2型一步法多重熒光pcr檢測引物和探針注：胞嘧啶(c)、鳥嘌呤(g)、腺嘌呤(a)、胸腺嘧啶(t)。簡并堿基w代表a或t，簡并堿基y代表c或t，簡并堿基r代表g或a，簡并堿基k代表g或t。探針5‘端標記有發(fā)光基團，探針3‘端標記有淬滅基團。我們采用多重熒光pcr技術建立了同時檢測和鑒別偽狂犬病毒(prv)、豬細小病毒(ppv)和豬圓環(huán)病毒2型(pcv-2)的檢測方法并組裝了試劑盒。檢測和鑒別偽狂犬病毒(prv)、豬細小病毒(ppv)和豬圓環(huán)病毒2型(pcv-2)的一步法多重熒光pcr檢測試劑盒，包括上述多重熒光pcr檢測引物和探針。進一步地，該試劑盒還包括完成多重熒光pcr反應所需的材料和試劑，例如，反應緩沖液、酶、陽性對照、陰性對照等。在本發(fā)明的一個具體實施方式中，所述反應緩沖液為iqpowermixpcr反應緩沖液；所述陰性對照為無核酸滅菌水；所述陽性對照分別為偽狂犬病毒(prv)ge基因的體外dna標準品；ppv陽性對照為豬細小病毒(ppv)ns1基因的體外dna標準品；pcv-2陽性對照為豬圓環(huán)病毒2型(pcv-2)orf2基因的體外dna標準品。本發(fā)明還提供了一種檢測和鑒別偽狂犬病毒(prv)、豬細小病毒(ppv)和豬圓環(huán)病毒2型(pcv-2)的一步法多重熒光pcr檢測方法，包括如下步驟：(1)提取病毒總核酸；(2)配制pcr反應體系，其中，所述反應體系中包含上述的多重熒光pcr引物和探針；(3)進行一步法多重熒光pcr反應；(4)結(jié)果判定；①質(zhì)控標準：陽性對照均有s形擴增曲線，ct值大約在20左右，陰性對照無擴增信號。滿足此條件，視為此次試驗有效。②結(jié)果判斷：有擴增曲線，且ct值在30以下的判定為陽性；有擴增曲線，但30<ct值<35的，屬于疑似區(qū)間，需要重新確認；沒有擴增曲線或者ct值大于35的，判定為陰性。本發(fā)明的優(yōu)點是：1)多重性：可同時檢測并區(qū)分偽狂犬病毒、豬細小病毒和豬圓環(huán)病毒2型，節(jié)約了檢測時間和成本，有利于疫病特別是混合感染的及時診斷。2)靈敏：此多重熒光pcr體系可以同時檢測三種病原，其特異性與單個熒光pcr相當。3)特異：設計引物和探針時充分考慮了病原之間可能存在的干擾，經(jīng)過篩選保證了引物和探針的特異性和排他性。3)涵蓋性和通用性好：本發(fā)明中設計的引物和探針都分別針對偽狂犬病毒、豬細小病毒和豬圓環(huán)病毒2型最保守的基因設計，可以實現(xiàn)每種病毒不同亞型或血清型之間的通用檢測。對于每個病毒，其引物和探針都是多條，而且包含了簡并引物，基本上覆蓋了genebank中現(xiàn)有該種病毒的所有序列。4)簡便、易自動化：所有引物和探針的設計都是從可以進行多重檢測考慮，不管是dna或rna病毒，都可以使用該一步法程序，省卻了反轉(zhuǎn)錄過程，省時省力。附圖說明圖1：prv單熒光pcr標準曲線。圖2：ppv單熒光pcr標準曲線。圖3：pcv-2單熒光pcr標準曲線。圖4：prv,ppv和pcv-2多重熒光pcr標準曲線。圖5：prv單熒光pcr與多重熒光pcr的比較。圖6：ppv單熒光pcr與多重熒光pcr的比較。圖7：pcv-2單熒光pcr與多重熒光pcr的比較。具體實施方式為了更清楚地說明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實施例對本發(fā)明做進一步的說明。本領域技術人員應當理解，下面所具體描述的內(nèi)容是說明性的而非限制性的，不應以此限制本發(fā)明的保護范圍。下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所用的試驗材料，如無特殊說明，均為常規(guī)生化試劑供應商購買得到。實施例1試劑盒的組成和使用1.試劑盒的配制組成表2試劑盒的組成組份(50tests/kit)數(shù)量2×iqpowermixpcr緩沖液600μl×1管引物混合物90μl×1管prv探針25μl×1管ppv探針15μl×1管pcv-2探針15μl×1管prv陽性對照60μl×1管ppv陽性對照60μl×1管pcv-2陽性對照60μl×1管陰性對照60μl×1管depc處理水500μl×1管其中2×iqpowermixpcr緩沖液購自biorad公司產(chǎn)品iqmulitiplexpowermixkit。引物混合物包括prv的1條正向引物、1條反向引物，ppv的1條正向引物、1條反向引物以及pcv-2的1條正向引物和3條反向引物，引物序列如表1，混合引物的工作濃度為400nm，引物委托大連寶生物公司合成。prv探針有1條、ppv探針有1條，pcv-2探針包括2條，探針序列如表1，濃度分別為200nm，探針委托大連寶生物公司合成。陰性對照為無核酸滅菌水。prv陽性對照為偽狂犬病毒(prv)ge基因的體外dna標準品；ppv陽性對照為豬細小病毒(ppv)ns1基因的體外dna標準品；pcv-2陽性對照為豬圓環(huán)病毒2型(pcv-2)orf2基因的體外dna標準品。偽狂犬病毒(prv)ge基因體外dna標準品的制備：通過bioedit基因分析軟件對genbank上登錄的prv各毒株ge基因序列進行比對分析，利用primerprimer3.0軟件設計特異性引物，從prv南陽株中擴增prv-ge基因序列(長度為399bp。將獲得的特異性pcr產(chǎn)物連接于pgem-teasy載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，挑取白色菌落，提取質(zhì)粒，經(jīng)pcr和酶切鑒定為陽性后，獲得包含prv-ge基因的陽性重組質(zhì)粒，命名為prv-ge-dna，并經(jīng)過序列測定確認，保存于-20℃?zhèn)溆?。偽狂犬病毒南陽株ge基因序列如序列表中seqidno：13所示。豬細小病毒(ppv)ns1基因體外dna標準品的制備：通過bioedit基因分析軟件對genbank上登錄的ppv各毒株ns1基因序列進行比對分析，利用primerprimer3.0軟件設計特異性引物，擴增ppv-ns1基因序列(長度為500bp)。將獲得的特異性pcr產(chǎn)物連接于pgem-teasy載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，挑取白色菌落，提取質(zhì)粒，經(jīng)pcr和酶切鑒定為陽性后，獲得包含ppv-ns1基因的陽性重組質(zhì)粒，命名為ppv-ns1-dna，并經(jīng)過序列測定確認，保存于-20℃?zhèn)溆?。豬細小病毒ppv-ns1基因序列如序列表中seqidno：14所示。豬圓環(huán)病毒(pcv-2)orf2基因體外dna標準品的制備：通過bioedit基因分析軟件對genbank上登錄的pcv-2各毒株orf-2基因序列進行比對分析，利用primerprimer3.0軟件設計特異性引物，擴增pcv2-orf2基因序列(長度為666bp)。將獲得的特異性pcr產(chǎn)物連接于pgem-teasy載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，挑取白色菌落，提取質(zhì)粒，經(jīng)pcr和酶切鑒定為陽性后，獲得包含pcv2-orf2基因的陽性重組質(zhì)粒，命名為pcv2-orf2-dna，并經(jīng)過序列測定確認，保存于-20℃?zhèn)溆?。豬圓環(huán)病毒pcv2-orf2基因序列如序列表中seqidno：15所示。2.試劑盒的使用方法1)提取病毒總核酸(rna/dna)病毒核酸的提取采用病毒基因組dna/rna提取試劑盒(tianampvirusdna/rnakit)，步驟如下：carrierrna溶液的配制：(1)carrierrna儲存液：向裝有310μgcarrierrna凍干粉的管子中加入310μlrnase-freeddh2o，將carrierrna徹底溶解，得到終濃度為1μg/μl的溶液，并分裝、置于-20℃儲存。(2)carrierrna工作液：根據(jù)樣品的數(shù)量計算所需緩沖液gb和carrierrna溶液的體積(計算公式如下)，將緩沖液gb與carrierrna溶液顛倒混勻，即得到carrierrna工作液；為避免溶液出現(xiàn)起泡現(xiàn)象，請勿使用渦旋振蕩。計算公式：n×0.22ml＝y(tǒng)mlyml×28μl/ml＝zμl式中n＝同時提取的樣品個數(shù)，y＝需要加入緩沖液gb的體積，z＝需要加入carrierrna溶液的體積。病毒總核酸的提?。?1)用移液器將20μlproteinasek加入一個干凈的1.5ml離心管中。(2)向離心管中加入200μl血漿/血清/淋巴液或25mg磨碎的組織(樣品需平衡至室溫)，如果樣本體積小于200μl，可加入0.9％nacl溶液補充。(3)加入200μlcarrierrna工作液，蓋上管蓋，渦旋振蕩15sec混勻。(4)56℃孵育15min，簡短離心以收集附著在管壁及管蓋的液體。(5)加入250μl無水乙醇，渦旋振蕩15sec，徹底混勻，在室溫(15-25℃)放置5min。(6)簡短離心，以收集附著在管壁及管蓋的液體。(7)將離心管中的溶液和絮狀沉淀全部轉(zhuǎn)移至rnase-free吸附柱cr2(吸附柱放在收集管中)，蓋上管蓋，8,000rpm(～6,000×g)離心1min，棄廢液，將吸附柱放回收集管中。(8)小心打開吸附柱蓋子，加入500μl溶液gd(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，蓋上管蓋，8,000rpm(～6,000×g)離心1min，棄廢液，將吸附柱放回收集管。(9)小心打開吸附柱蓋子，加入600μl溶液pw(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，蓋上管蓋，靜置2min，8,000rpm(～6,000×g)離心1min，棄廢液，將吸附柱放回收集管。(10)重復步驟(9)。(11)小心打開吸附柱蓋子，加入500μl無水乙醇，蓋上管蓋，8,000rpm(～6,000×g)離心1min，棄廢液。(12)將吸附柱放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)離心3min，使吸附膜完全變干，棄廢液。(13)將吸附柱放入一個新的rnase-free離心管(1.5ml)中，小心打開吸附柱的蓋子，室溫放置3min，使吸附膜完全變干。向吸附膜的中間部位懸空滴加20-150μlrnase-freeddh2o，蓋上蓋子，室溫放置5min。(14)12,000rpm(～13,400×g)離心1min，收集到的即為病毒總核酸(dna或rna)。2)熒光pcr檢測分別取檢測樣品、陽陰性對照，按照下表3配制反應體系：表3一步法多重熒光pcr反應體系：總體積20ul混合液組份體積(ul)終濃度(nm)2×iqpowermixpcr緩沖液101×引物混合物0.8400prv探針0.4200ppv探針0.2200pcv-2探針0.2200模板dna1depc處理水7.4反應總體積20將混合液充分混合后，最后加入模板，簡短離心，按照下列反應程序，進行一步法熒光pcr反應，見表4：表4多重熒光pcr反應程序3)結(jié)果描述及判定①質(zhì)控標準：陽性對照均有s形擴增曲線，ct值大約在20左右，陰性對照無擴增信號。滿足此條件，視為此次試驗有效。②結(jié)果判斷：有擴增曲線，且ct值在30以下的判定為陽性；有擴增曲線，但30<ct值<35的，屬于疑似區(qū)間，需要重新確認；沒有擴增曲線或者ct值大于35的，判定為陰性。實施例2、試劑盒的敏感性試驗1、材料偽狂犬病毒、豬細小病毒和豬圓環(huán)病毒2型均由本實驗室保存。2、方法1)陽性標準品的制備如實施例1所述的方法。2)標準品定量測定取制備好的體外dna標準品用無rna酶的滅菌水分別作200倍稀釋，用紫外分光儀測定其260nm和280nm的吸光度值(od260和od280)，計算待測樣品的濃度與純度。純dna：od260/od280≈1.8(＞1.9，表明有rna污染；＜1.6，表明有蛋白質(zhì)、酚等污染；＞2.0時表明可能有異硫氰酸殘存)。dna樣品的濃度(μg/μl)：od260×稀釋倍數(shù)×50/1000。同時根據(jù)測序結(jié)果，按以下公式計算拷貝數(shù)(copies/μl)：標準曲線繪制：將prv體外標準品進行10倍梯度稀釋后進行熒光pcr，用模板濃度倒數(shù)與對應的熒光ct值做濃度標準曲線，pcr擴增效率e值、相關系數(shù)r2值和曲線斜率slope值都落在可接受范圍內(nèi)，說明擴增效率良好。見圖1。將ppv體外標準品進行10倍梯度稀釋后進行熒光pcr，用模板濃度倒數(shù)與對應的熒光ct值做濃度標準曲線，pcr擴增效率e值、相關系數(shù)r2值和曲線斜率slope值都落在可接受范圍內(nèi)，說明擴增效率良好。見圖2。將pcv-2體外標準品進行10倍梯度稀釋后進行熒光pcr，用模板濃度倒數(shù)與對應的熒光ct值做濃度標準曲線，pcr擴增效率e值、相關系數(shù)r2值和曲線斜率slope值都落在可接受范圍內(nèi)，說明擴增效率良好。見圖3。將prv、ppv和pcv-2體外標準品等量混合后，再進行10倍梯度稀釋，進行多重熒光pcr，用模板濃度倒數(shù)與對應的熒光ct值做濃度標準曲線，pcr擴增效率e值、相關系數(shù)r2值和曲線斜率slope值都落在可接受范圍內(nèi)，說明多重pcr之間沒有互相干擾，擴增效率良好。見圖4。3)一步法多重熒光pcr方法檢測極限的確定將上述定量的dna溶液調(diào)整為濃度大致相當，每種各取10μl，充分混勻后，制成陽性標準品。將該標準品10倍梯度稀釋后，按最佳條件進行熒光pcr檢測，最高稀釋倍數(shù)所能檢測出的ct值所對應的的濃度即為最低檢測限。3、結(jié)果1)dna溶液拷貝數(shù)測定結(jié)果將制備好的體外dna標準品，分別用紫外分光儀測定其260nm和280nm的吸光度值并推算出拷貝數(shù)，詳見下表5。表5dna純度及含量測定2)多重熒光rt-pcr方法檢測限的確定利用建立的多重熒光pcr檢測方法，對10倍系列稀釋的陽性標準品進行檢測，結(jié)果該方法可穩(wěn)定檢測到的最高ct值為35，所對應的的標準品濃度達到1-10拷貝數(shù)/反應。實施例3、試劑盒的特異性試驗1材料本試驗中所用到的病毒如表6。表6特異性試驗研究過程中應用到的病毒和核酸2、方法2.1分別用偽狂犬病毒、豬細小病毒與豬圓環(huán)病毒2型的引物和探針對表格中的其他8種病毒核酸進行熒光pcr檢測，以驗證引物和探針的特異性。2.2利用建立的多重熒光pcr檢測方法對表格中的9種病毒進行檢測，驗證多重熒光pcr方法的特異性。2.3進行多重熒光pcr和單熒光pcr比較。3、結(jié)果3.1每種病毒的引物和探針只能從自己的病毒核酸中擴增出曲線，其他病毒模板的擴增均為陰性，表明所設計的引物和探針特異性良好。3.2利用建立的多重熒光pcr方法對表格6中的病毒進行檢測，結(jié)果偽狂犬病毒、豬細小病毒和豬圓環(huán)病毒2型有擴增曲線，其它病毒均無特異性的擴增信號，表明所建立的方法特異性良好。表7特異性檢測結(jié)果3.3將prv、ppv和pcv-2體外標準品等量混合后，再進行10倍梯度稀釋，分別進行多重熒光pcr和prv單熒光pcr，將相同模板濃度對應的熒光ct值進行比較，求解回歸方程，二者之間相關系數(shù)r2值達到了0.9997，說明單熒光pcr和多重熒光pcr之間符合性良好，多重熒光pcr沒有產(chǎn)生干擾，沒有影響擴增效率。見圖5。將prv、ppv和pcv-2體外標準品等量混合后，再進行10倍梯度稀釋，分別進行多重熒光pcr和ppv單熒光pcr，將相同模板濃度對應的熒光ct值進行比較，求解回歸方程，二者之間相關系數(shù)r2值達到了0.9905，說明單熒光pcr和多重熒光pcr之間符合性良好，多重熒光pcr沒有產(chǎn)生干擾，沒有影響擴增效率。見圖6。將prv、ppv和pcv-2體外標準品等量混合后，再進行10倍梯度稀釋，分別進行多重熒光pcr和pcv-2單熒光pcr，將相同模板濃度對應的熒光ct值進行比較，求解回歸方程，二者之間相關系數(shù)r2值達到了0.9937，說明單熒光pcr和多重熒光pcr之間符合性良好，多重熒光pcr沒有產(chǎn)生干擾，沒有影響擴增效率。見圖7。實施例4：試劑盒對臨床樣品檢測的實驗報告1、材料實驗室收集的已知prv陽性組織樣品21份，ppv陽性組織樣品42份，pcv-2陽性組織樣品41份。2、方法對實驗室收集的已知陽性樣品進行多重熒光pcr檢測，用實際樣品驗證方法的敏感性和特異性。3、結(jié)果臨床樣品的檢測結(jié)果如表8。由表8可知，用多重熒光pcr進行檢測時，已知21份prv陽性全部為prv陽性，42份ppv陽性樣品全部為ppv陽性，41份pcv-2陽性樣品全部為pcv-2陽性。有趣的是，由于這些已知樣品原來只做了單目標檢測，其他病毒感染情況未知，但是通過本發(fā)明描述的多重熒光pcr檢測，發(fā)現(xiàn)在這共計104份樣品中，有14份為prv和ppv都是陽性，有27份ppv和pcv-2都為陽性，有12份prv和pcv-2都為陽性，有8份為prv、ppv和pcv-2全部陽性，這說明偽狂犬病毒、豬細小病毒和豬圓環(huán)病毒2型混合感染現(xiàn)象非常普遍，多重熒光pcr可以檢測到原來靠單一熒光pcr沒有進行篩查的非目標病原，檢出了混合感染，避免了漏檢。表8臨床樣品的檢測結(jié)果顯然，本發(fā)明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實施方式的限定，對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動，這里無法對所有的實施方式予以窮舉，凡是屬于本發(fā)明的技術方案所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護范圍之列。sequencelisting<110>北京出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心<120>一種能同時檢測和鑒別偽狂犬病毒、豬細小病毒和豬圓環(huán)病毒的檢測試劑盒及引物和探針<130><160>15<170>patentinversion3.3<210>1<211>19<212>dna<213>人工合成引物<400>1cggtgcctgctgtactacg19<210>2<211>17<212>dna<213>人工合成引物<400>2ggcgaggtgaagctgca17<210>3<211>20<212>dna<213>人工合成探針<400>3cgagccctgcatctaccacc20<210>4<211>18<212>dna<213>人工合成引物<400>4agcgagccaacaacacca18<210>5<211>22<212>dna<213>人工合成引物<400>5caccaaagcaggctcttatgtc22<210>6<211>24<212>dna<213>人工合成探針<400>6accaacctgcacttaactccaaca24<210>7<211>23<212>dna<213>人工合成引物<400>7acggatattgtaktcctggtcgt23<210>8<211>27<212>dna<213>人工合成引物<400>8cttccaaccmaayaacaaaagraatca27<210>9<211>29<212>dna<213>人工合成引物<400>9acttccaaccaaataacaaaagaaatcag29<210>10<211>24<212>dna<213>人工合成引物<400>10ccaaccaaacaacaaaagaaacca24<210>11<211>19<212>dna<213>人工合成探針<400>11cagtgccgaggcctacgtg19<210>12<211>19<212>dna<213>人工合成探針<400>12cagtgccgaggcctacrtg19<210>13<211>399<212>dna<213>prv的ge基因序列<400>13ggccacgcccaacgacacgggcctctacacgctgcacgacgcctcggggccgcgggccgt60gttctttgtggcggtgggcgaccggccgcccgcgccggcggacccggtgggccccgcgcg120ccacgagccccgcttccacgcgctcggcttccactcgcagctcttctcgcccggggacac180gttcgacctgatgccgcgcgtggtctcggacatgggcgactcgcgcgagaactttaccgc240cacgctggactggtactacgcgcgcgcgcccccgcggtgcctgctgtactacgtgtacga300gccctgcatctaccacccgcgcgcgcccgagtgcctgcgcccggtggacccggcgtgcag360cttcacctcgccggcgcgcgcgcggctggtggcgcgccg399<210>14<211>500<212>dna<213>ppv的ns1基因序列<400>14aaagaccagaacatacacaaccaataagagacagaatgttaaacataaacctaaccagaa60aactgccaggtgattttggacttttagaagaaactgaatggccactaatatgtgcttggt120tggtaaagaaaggttaccaagcaacaatggctagctatatgcatcattggggaaatgtac180ctgattggtcagaaaaatgggaggagccaaaaatgcaaaccccaataaatacaccaacag240actctcagatttccacatcagtgaaaacttcgccagcggacaacaactacgcagcaactc300caatacaggaggacctggatttagctttagccttggagccgtggagcgagccaacaacac360caactttcaccaacctgcacttaactccaacaccgccagattcagcaatacggacaccaa420gtccaacttggtcggaaatagaaaccgacataagagcctgctttggtgaaaactgtgcac480ccacaacaaaccttgaataa500<210>15<211>666<212>dna<213>pcv-2的orf2基因序列<400>15tctgaattgtacatacatggttacacggatattgtattcctggtcgtatatactgttttc60gaacgcagtgccgaggcctacgtggtctacatttccagcagtttgtagtctcagccacag120ctgatttcttttgttgtttggttggaagtaatcaatagtggaatctaggacaggtttggg180ggtaaagtagcgggagtggtaggagaagggctgggttatggtatggcgggaggagtagtt240tacataggggtcataggtgagggctgtggcctttgttacaaagttatcatctagaataac300agcactggagcccactcccctgtcaccctgggtgatcggggagcagggccagaattcaac360cttaacctttcttattctgtagtattcaaagggcacagagcgggggtttgagccccctcc420tgggggaagaaagtcattaatattgaatctcatcatgtccaccgcccaggagggcgtttt480gactgtggttcgcttgatagtatatccgaaggtgcgggagaggcgggtgttgaagatgcc540atttttccttctccagcggtaacggtggcgggggtggacgagccaggggcggcggcggag600gatctggccaagatggctgcgggggcggtgtcttcttctccggtaacgcctccttggata660cgtcat666當前第1頁12