本發(fā)明屬于分子生物學領(lǐng)域，具體涉及大瀧六線魚單核苷酸多態(tài)性位點。
背景技術(shù)：
：大瀧六線魚(學名：hexagrammosotakii)為六線魚科六線魚屬的魚類。分布于朝鮮、日本以及中國東海、黃海、渤海等海域，系冷溫性近海底層魚類。大瀧六線魚的食性很廣，以底棲生物為主，也攝食小蝦、小魚。大瀧六線魚素以其味道鮮美肉質(zhì)細膩而聞名，素有“北方石斑”之稱，與其它魚類相比大瀧六線魚的含水量較低(73.85％)，可食部分比值高，蛋白質(zhì)含量極高(18.50％)，必需氨基酸含量高(7.25％)(kangbin)。大瀧六線魚是一種十分具有發(fā)展?jié)摿Φ慕?jīng)濟魚種，但大瀧六線魚生長發(fā)育十分緩慢，體長一般約為15-25厘。大瀧六線魚性成熟較早，性成熟時間一般在2～3齡，雄魚早于雌魚，性成熟后體重增長放緩，體重拐點在3.6齡。目前，國內(nèi)外有關(guān)大瀧六線魚的研究報道還比較少，主要集中在生物學地位、生態(tài)分布以及種群資源量，還有一些學者對其生理、生化等方面進行了研究。對于大瀧六線魚遺傳學方面的研究相對較少，目前國外只有habib等人基于coi、coiii-nd3-nd4l和cytb對黃海和日本海附近群體遺傳結(jié)構(gòu)進行研究，國內(nèi)的研究有劉奇和李瑩等人關(guān)于大瀧六線魚遺傳多樣性的研究，但取樣地都集中在黃渤海海域，且只使用了d-loop序列進行遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)的分析，并未使用cytb或coi基因進行對比分析。未見大瀧六線魚單核苷酸多態(tài)性方面的研究。單核苷酸多態(tài)性標記(snp：simplenucleotidepolymorphism)，是一種廣泛應用的遺傳學領(lǐng)域的dna分子標記。snp是廣泛存在真核生物基因組中的單核苷酸突變，一般有轉(zhuǎn)換、顛換、缺失、插入四種形式，其中動物體中以轉(zhuǎn)換顛換最為常見。單核苷酸多態(tài)性具有多態(tài)性高，提供的遺傳信息多，pcr擴增效果重復性好，以及在基因組中分散分布等優(yōu)點，常用于生物的遺傳多樣性分析，遺傳圖譜和雜交育種等。由于單核苷酸多態(tài)性研究所用dna的數(shù)量少，對樣品要求低，因此，單核苷酸多態(tài)性分析在遺傳學領(lǐng)域具有廣泛的應用性。作為中國重要的漁業(yè)資源之一，開發(fā)大瀧六線魚與生長發(fā)育經(jīng)濟性狀相關(guān)的snp標記研究是十分重要的。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供與大瀧六線魚生長發(fā)育相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性位點，本發(fā)明提供的單核苷酸多態(tài)性位點選自：seqnoid：1所示序列第177位等位基因為a/t，seqnoid：2所示序列第228位等位基因為g/a，seqnoid：3所示序列第228位等位基因為c/t，seqnoid：4所示序列第269位等位基因為a/g。本發(fā)明提供的單核苷酸多態(tài)性位點，其中與大瀧六線魚體長增長關(guān)聯(lián)顯著的單核苷酸多態(tài)性位點選自：seqnoid：1所示序列第177位等位基因為a/t，seqnoid：3所示序列第228位等位基因為c/tseqnoid：4所示序列第269位等位基因為a/g。本發(fā)明提供的單核苷酸多態(tài)性位點，其中與大瀧六線魚體重增長關(guān)聯(lián)顯著的單核苷酸多態(tài)性位點選自：seqnoid：2所示序列第228位等位基因為g/a，seqnoid：3所示序列第228位等位基因為c/t。本發(fā)明還提供所述單核苷酸多態(tài)性位點用于評估大瀧六線魚生長發(fā)育、大瀧六線魚選種或大瀧六線魚育種的用途。本發(fā)明提供一種大瀧六線魚單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，包括以下步驟：1)基因組dna的提取：采用天根海洋動物組織dna提取試劑盒2)單核苷酸多態(tài)性pcr擴增：利用assaydesign3.1軟件設(shè)計單核苷酸多態(tài)性引物擴增大瀧六線魚基因組dna，獲得其擴增產(chǎn)物。3)擴增產(chǎn)物檢測：啟動massarraynanodispenserrs1000點樣儀，將純化后的產(chǎn)物進行點樣，并用maldi-tof質(zhì)譜儀分析，檢測結(jié)果使用typer4.0軟件進行分析。4)遺傳多樣性分析：根據(jù)每個個體堿基類型取定基因型，利用popgene32計算遺傳多樣性參數(shù)。本發(fā)明體用提供能擴增出所述單核苷酸多態(tài)性位點的的引物對，引物對具有選自以下序列對所示的序列：seqidno：5和seqidno：6；seqidno：7和seqidno：8；seqidno：9和seqidno：10；seqidno：11和seqidno：12。本發(fā)明提供所述引物對在大瀧六線魚單核苷酸多態(tài)性位點檢測中的用途。本發(fā)明提供了所述引物對在評估大瀧六線魚生長發(fā)育、大瀧六線魚選種或大瀧六線魚育種的用途。實施例一、單核苷酸多態(tài)性位點篩選首先采用2b-rad技術(shù)與高通量測序結(jié)合，對大瀧六線魚進行簡化基因組測序，共發(fā)現(xiàn)158,733個snp，分布在27,404個序列標簽中。通過blast比對篩選其中與生長發(fā)育相關(guān)且位于編碼區(qū)域的snp位點，共得到21個snp位點。通過sequenom實驗平臺采用iplexgold技術(shù)及massarray系統(tǒng)檢測了21個snp位點在四個地理群體中的多樣性。四個地理群體所使用的樣本分別采自大連(n39°25′，e122°51′，野生群體，29尾)，舟山(n30°03′，e122°37′，野生群體，20尾)，瑯琊臺(n35°30′，e119°58′，野生群體，30尾)，即墨(即墨山東省海洋生物研究院養(yǎng)殖場，養(yǎng)殖群體，60尾)，取尾鰭和肌肉組織，存放于95％的無水乙醇中，放于-80℃冰箱中備用。基因組dna的提?。菏褂帽本┨旄萍加邢薰镜暮Ｑ髣游锝M織基因組dna提取試劑盒提取大瀧六線魚樣品基因組dna。具體流程如下：首先采用assaydesigner3.1軟件進行引物設(shè)計，通過在四個地理群體120個樣本中進行pcr擴增，而后擴增產(chǎn)物去鹽后4000rpm離心4分鐘，在芯片上點樣，再點calibrant，并將芯片放到scout板上并放回compact中，使用massarray進行分析、質(zhì)量控制及報告輸出。報告結(jié)果采用popgene1.32計算等位基因數(shù)(observednumberofalleles，na)、有效等位基因數(shù)(effectivenumberofalleles，ne)、觀望雜合度(observedheterozygosity，ho)、期望雜合度(expectedheterozygosity，he)、nei’氏多樣性指數(shù)(nei′sgenediversityindex，nei)。多態(tài)信息含量(polymorphisminformationcontent，pic)計算公式為(式中pi和pj是第i和第j個等位基因頻率，n是等位基因數(shù)目)。分析結(jié)果顯示17個位點具有多態(tài)性，平均等位基因數(shù)為1.9524，平均有效等位基因數(shù)是1.4571，平均觀望雜合度0.2158，平均期望雜合度為0.2432，平均多態(tài)信息含量為0.2517。二、snp位點與生長發(fā)育性狀關(guān)聯(lián)性研究在關(guān)聯(lián)性研究中將多態(tài)性位點與大瀧六線魚體重體長增量的生長發(fā)育性狀進行關(guān)聯(lián)。在即墨樣品中選取30尾魚體重體長相近，年齡約在1齡左右的大瀧六線魚進行熒光魚體t型外掛標簽標記，分別記錄初體重與初體長數(shù)據(jù)，在山東省海洋生物研究院即墨鰲山衛(wèi)基地進行為期125天的養(yǎng)殖，期間每天喂食兩次與養(yǎng)殖池內(nèi)的海水保持循環(huán)，記錄養(yǎng)殖結(jié)束后每個個體體重與體長數(shù)據(jù)。檢測養(yǎng)殖群體中具有多態(tài)性的snp位點，利用統(tǒng)計軟件spss對snp位點在30尾即墨養(yǎng)殖大瀧六線魚在不用基因型個體間的性狀進行多重比較(lsd)，去除出現(xiàn)少于3次的基因型，保證每個位點分析價值。4個與生長相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性位點pic值范圍從0.3457～0.6084，平均為0.4600，有限等位基因數(shù)范圍從1.8000～3.0958，平均為0.8682；觀測雜合度0.2933～0.5115，平均值0.4089；期望雜合度0.4444～0.6770，平均值0.5554。4個位點均未偏離h-w平衡(p＞0.05)，最小等位基因頻率均大于0.05，說明4個位點均未受到非隨機交配的影響，且突變率較高，適合進行遺傳學方面的研究，具有進一步研究的價值。與生長發(fā)育具有顯著性關(guān)系的snp位點及其兩翼序列如表1所示。位點單核苷酸多態(tài)性序列正向引物序列反向引物序列hos10seqidno：1seqidno：5seqidno：6hos13seqidno：2seqidno：7seqidno：8hos14seqidno：3seqidno：9seqidno：10hos17seqidno：4seqidno：11seqidno：124個單核苷酸多態(tài)性位點的多樣性結(jié)果如表2所示。具有顯著性的位點計算結(jié)果如表3所示，hos10中tt基因型的體長增長比較顯著。hos13中g(shù)g基因型與其他基因型相比，與體重增量有著較為顯著的關(guān)系。位點hos14中，體重增量上，位點缺失與其他基因型都沒有明顯差距：基因型tt比基因型cc、ct體重增長更快，差別極其顯著；體長增量上，與其余幾種基因型相比，tt基因型具有極其顯著的影響。hos17位點中g(shù)a基因型的體長增量明顯高于aa基因型，具有極顯著的影響?？傮w來看hos13對于體重增長有著顯著性影響，hos10與hos17對體長增長有著顯著性影響，hos14則對體重體長增長都用影響。一個標記與多個性狀相關(guān)聯(lián)可能與體重與體長本身就具有一定聯(lián)系有關(guān)。開發(fā)出的多態(tài)性位點與生長發(fā)育相關(guān)的位點在今后大瀧六線魚的生長發(fā)育、人工繁殖等研究提供參考價值。表3不同位點的不同基因型個體間生長性狀的增量及多重性比較注：同列中不同字母數(shù)值間差異顯著(p＜0.05)，大寫字母表示差異及其顯著(p＜0.01)。三、單核苷酸多態(tài)性位點引物本發(fā)明根據(jù)基于簡化基因組測序(rad)利用二代測序技術(shù)所開發(fā)出的snp文庫，根據(jù)blast中生長相關(guān)堿基序列的比對結(jié)果，并根據(jù)相關(guān)位點，設(shè)計了50對的篩選引物，在大瀧六線魚的20個個體中進行驗證。單核苷酸多態(tài)性引物的驗證擴增位于兩端已知序列之間的dna區(qū)域。每個pcr循環(huán)，反應混合體系都在模板變性、引物退火和引物延伸三種不同溫度下依序溫育。該過程可使用一種可編程序的溫度熱循環(huán)儀而達到自動化。5μl體系：模板1μl，pcrmastermix4μl(water1.850μl，pcrbuffer0.625μl，mgcl20.325μl，dntp0.1000μl，primermix1.000μl，hotstartaq0.100μl)。將pcr產(chǎn)物用sap(shrimpalkalinephosphatase，堿性磷酸酶)處理，以去除體系中游離的dntps。反應程序：94℃30s，[94℃5s，(52℃5s，80℃5s)5cycles，72℃3min]40cycles，4℃保存，產(chǎn)物用樹脂進行純化。啟動massarraynanodispenserrs1000點樣儀，將樹脂純化后的延伸產(chǎn)物移至384-wellspectrochipbioarray上。將點樣后的spectrochip芯片使用maldi-tof質(zhì)譜儀分析，檢測結(jié)果使用typer4.0軟件獲取原始數(shù)據(jù)及基因分型圖，檢查數(shù)據(jù)文件的完整性和正確性，將結(jié)果保存入相應存儲媒介并遞交生物信息室分析。使用軟件popgene32進行遺傳指標(等位基因(na：observednumberofalleles)、有效等位基因(ne：effectivenumberofalleles)、觀測雜合度(observedheterozygosity)、期望雜合度(expectedheterozygosity)、香農(nóng)遺傳指數(shù)(shannon′sinformationindex(i))、nei氏多樣性指數(shù)(nei′sgenediversityindex(nei))、多態(tài)信息含量(polymorphisminformationcontent(pic)))計算。4個單核苷酸多態(tài)性位點的多樣性及引物見表4。表4其中tm是單核苷酸多態(tài)性的退火溫度，na為等位基因數(shù)，ne為有效等位基因數(shù)，obs_het觀望雜合度，exp-het為期望雜合度。pic為多態(tài)信息含量，i是香農(nóng)指數(shù)，nei為nei氏多樣性指數(shù)，pic為多態(tài)信息含量。本發(fā)明的4對引物對20個大瀧六線魚基因組dna進行擴增，遺傳多樣性分析結(jié)果表明每個單核苷酸多態(tài)性位點平均等位基因數(shù)為2.75，平均有效等位基因數(shù)是2.3381，平均觀望雜合度0.4089，平均期望雜合度為0.5554。遺傳雜合度(geneticheterozygosity)包括了觀望雜合度和期望雜合度，表示群體某一特定基因位點上雜合子的比例，反應了群體遺傳變異程度的大小。觀測雜合度是指一個群體中觀察到的雜合子所占的比例；期望雜合度則是指在哈溫平衡假設(shè)下雜合度的期望值，也稱為基因多樣度(genediversity)，僅取決于等位基因頻率。雜合度的數(shù)值越低，遺傳一致性越高，遺傳多樣性越低，4個位點的雜合度處于相對較高的水平。4個位點均未偏離hw平衡，偏離hw平衡的原因可能是由于這些位點在繁殖時會受到選擇的壓力，進而影響不同等位基因產(chǎn)生的頻率，或是由于非隨機交配所導致的平衡偏離。4個位點的最小等位基因頻率(minorallelefrequency，maf)均高于0.05突變率相對較高，較小的maf將會是統(tǒng)計效能降低，從而造成假陰性的結(jié)果，故而造成關(guān)聯(lián)性研究的偏差根據(jù)計算結(jié)果得出，4對單核苷酸多態(tài)性引物可用于大瀧六線魚遺傳多樣性檢測，數(shù)量性狀遺傳圖譜，遺傳連鎖做圖、以及家系和個體鑒定。本發(fā)明提供的4個單核苷酸多態(tài)性位點：seqnoid：1序列第177位等位基因a/t，seqnoid：2序列第228位等位基因g/a，seqnoid：3序列第228位等位基因c/t，seqnoid：4序列第269位等位基因a/g，均與大瀧六線魚生長發(fā)育性狀顯著性相關(guān)。同時驗證了2b-rad技術(shù)開發(fā)大瀧六線魚單核苷酸多態(tài)性位點的可行性。本發(fā)明提供的snp位點能與大瀧六線魚生長發(fā)育相關(guān)，能有效用于大瀧六線魚評估大瀧六線魚生長發(fā)育、大瀧六線魚選種或大瀧六線魚育種。當前第1頁12