本發(fā)明涉及活性膠原蛋白肽的提取工藝，具體涉及從豬皮中提取膠原蛋白的酸酶結(jié)合法。
背景技術(shù)：
膠原蛋白又叫膠原，是一種含糖蛋白質(zhì)，在自然界分布廣泛，主要分布在哺乳動(dòng)物的結(jié)締組織中，作為皮膚、骨骼、肌腱、韌帶、血管的構(gòu)成材料。膠原特有的空間結(jié)構(gòu)賦予其優(yōu)異的理化性質(zhì)和生物活性-生物相容性、生物可降解性和低抗原性等，從而成為目前研究和應(yīng)用最為廣泛的一類結(jié)構(gòu)蛋白，在食品、化妝品、組織工程和生物醫(yī)學(xué)材料等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。
目前，從動(dòng)物組織中提取膠原的方法主要有單獨(dú)使用或聯(lián)用酸法、堿法、酶解法及熱水抽提法。其中，酸法、堿法和熱水抽提法膠原溶出率很低，且酸法、堿法對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重，水抽提法得到的往往是膠原的變性產(chǎn)物，而酶法轉(zhuǎn)移性強(qiáng)、破壞性小，能更好地獲得活性膠原，但水解不夠徹底。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是從豬皮中提取膠原蛋白的酸酶結(jié)合法，本提取方法采用醋酸和胃蛋白酶相結(jié)合，對(duì)環(huán)境無污染、保留活性成分，且提取率高，同時(shí)提高豬皮的利用率。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
從豬皮中提取膠原蛋白的酸酶結(jié)合法，包括以下步驟：
(1)將豬皮皮下脂肪和表面的毛發(fā)剔除干凈，利用蒸餾水徹底洗凈后，切成豬皮小顆粒狀，再用蒸餾水潤(rùn)洗一遍，瀝干水；
(2)在40℃條件下，用體積比為5:3的異丙醇個(gè)乙酸乙酯混合有機(jī)溶劑，按照料液比為1:4m/v對(duì)豬皮顆粒脫脂4.5h，然后用蒸餾水反復(fù)潤(rùn)洗豬皮顆粒直至無有機(jī)溶劑氣味，瀝干水后，置于-20℃條件下保存?zhèn)溆茫?/p>
(3)將脫脂后的豬皮顆粒置于醋酸中，按與豬皮質(zhì)量比為0.012～0.013mg/g加入胃蛋白酶，置于溫度為3～5℃的條件下提取55～65h；
(4)待提取結(jié)束后，加入氯化鈉粉末進(jìn)行鹽析出膠原絮狀沉淀，然后將膠原絮狀沉淀溶于0.4mol/L醋酸溶液中，再注入透析袋內(nèi)并先后于0.02mol/L的磷酸鈉溶液和蒸餾水中透析3～4天后，用硝酸銀溶液檢測(cè)透析液至無渾濁現(xiàn)象為止，真空冷凍干燥后即可得到產(chǎn)品。
作為優(yōu)選技術(shù)方案，為了使豬皮中的膠原蛋白盡可能溶解于胃蛋白酶，有利于提高膠原蛋白的提取率，同時(shí)避免胃蛋白酶的浪費(fèi)，所述步驟(3)中加入胃蛋白酶與豬皮的質(zhì)量比0.0125mg/g。
作為優(yōu)選技術(shù)方案，為了使豬皮中的膠原蛋白盡可能溶解于胃蛋白酶，有利于提高膠原蛋白的提取率，同時(shí)防止提取過長(zhǎng)浪費(fèi)能源，所述步驟(3)中提取60h。
作為優(yōu)選技術(shù)方案，為了保證溫度合適，使豬皮中的膠原蛋白盡可能溶解于胃蛋白酶，有利于提高膠原蛋白的提取率，所述步驟(3)中置于溫度為4℃的條件下提取。
作為優(yōu)選技術(shù)方案，為了盡可能使豬皮中的膠原蛋白都溶解出來，提高提取率，同時(shí)防止豬皮顆粒太小損壞膠原蛋白，所述步驟(1)中的豬皮小顆粒狀的規(guī)格為4.5mm×4.5mm。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的效益：本發(fā)明采用醋酸和胃蛋白酶相結(jié)合提取，一方面對(duì)環(huán)境無污染，另一方面完好保留膠原蛋白的活性成分，同時(shí)在酶用量為0.0125mg/g、提取時(shí)間60h、提取溫度為4℃最優(yōu)提取條件下提取，膠原蛋白的提取率高達(dá)19.87％，提取率高，且使豬皮得到最大利用價(jià)值，且該方法簡(jiǎn)單、易于操作、提取成本低，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地說明。
實(shí)施例1
從豬皮中提取膠原蛋白的酸酶結(jié)合法，包括以下步驟：
(1)將豬皮皮下脂肪和表面的毛發(fā)剔除干凈，利用蒸餾水徹底洗凈后，切成4.5mm×4.5mm的豬皮小顆粒狀，再用蒸餾水潤(rùn)洗一遍，瀝干水；
(2)在40℃條件下，用體積比為5:3的異丙醇個(gè)乙酸乙酯混合有機(jī)溶劑，按照料液比為1:4m/v對(duì)豬皮顆粒脫脂4.5h，然后用蒸餾水反復(fù)潤(rùn)洗豬皮顆粒直至無有機(jī)溶劑氣味，瀝干水后，置于-20℃條件下保存?zhèn)溆茫?/p>
(3)將脫脂后的豬皮顆粒置于醋酸中，按與豬皮質(zhì)量比為0.012mg/g加入胃蛋白酶，置于溫度為3℃的條件下提取55h；
(4)待提取結(jié)束后，加入氯化鈉粉末進(jìn)行鹽析出膠原絮狀沉淀，然后將膠原絮狀沉淀溶于0.4mol/L醋酸溶液中，再注入透析袋內(nèi)并先后于0.02mol/L的磷酸鈉溶液和蒸餾水中透析3～4天后，用硝酸銀溶液檢測(cè)透析液至無渾濁現(xiàn)象為止，真空冷凍干燥后即可得到產(chǎn)品。
實(shí)施例2
從豬皮中提取膠原蛋白的酸酶結(jié)合法，包括以下步驟：
(1)將豬皮皮下脂肪和表面的毛發(fā)剔除干凈，利用蒸餾水徹底洗凈后，切成豬皮小顆粒狀，再用蒸餾水潤(rùn)洗一遍，瀝干水；
(2)在40℃條件下，用體積比為5:3的異丙醇個(gè)乙酸乙酯混合有機(jī)溶劑，按照料液比為1:4m/v對(duì)豬皮顆粒脫脂4.5h，然后用蒸餾水反復(fù)潤(rùn)洗豬皮顆粒直至無有機(jī)溶劑氣味，瀝干水后，置于-20℃條件下保存?zhèn)溆茫?/p>
(3)將脫脂后的豬皮顆粒置于醋酸中，按與豬皮質(zhì)量比為0.0122mg/g加入胃蛋白酶，置于溫度為3.5℃的條件下提取57h；
(4)待提取結(jié)束后，加入氯化鈉粉末進(jìn)行鹽析出膠原絮狀沉淀，然后將膠原絮狀沉淀溶于0.4mol/L醋酸溶液中，再注入透析袋內(nèi)并先后于0.02mol/L的磷酸鈉溶液和蒸餾水中透析3～4天后，用硝酸銀溶液檢測(cè)透析液至無渾濁現(xiàn)象為止，真空冷凍干燥后即可得到產(chǎn)品。
實(shí)施例3
從豬皮中提取膠原蛋白的酸酶結(jié)合法，包括以下步驟：
(1)將豬皮皮下脂肪和表面的毛發(fā)剔除干凈，利用蒸餾水徹底洗凈后，切成4.5mm×4.5mm的豬皮小顆粒狀，再用蒸餾水潤(rùn)洗一遍，瀝干水；
(2)在40℃條件下，用體積比為5:3的異丙醇個(gè)乙酸乙酯混合有機(jī)溶劑，按照料液比為1:4m/v對(duì)豬皮顆粒脫脂4.5h，然后用蒸餾水反復(fù)潤(rùn)洗豬皮顆粒直至無有機(jī)溶劑氣味，瀝干水后，置于-20℃條件下保存?zhèn)溆茫?/p>
(3)將脫脂后的豬皮顆粒置于醋酸中，按與豬皮質(zhì)量比為0.0124mg/g加入胃蛋白酶，置于溫度為4℃的條件下提取60h；
(4)待提取結(jié)束后，加入氯化鈉粉末進(jìn)行鹽析出膠原絮狀沉淀，然后將膠原絮狀沉淀溶于0.4mol/L醋酸溶液中，再注入透析袋內(nèi)并先后于0.02mol/L的磷酸鈉溶液和蒸餾水中透析3～4天后，用硝酸銀溶液檢測(cè)透析液至無渾濁現(xiàn)象為止，真空冷凍干燥后即可得到產(chǎn)品。
實(shí)施例4
從豬皮中提取膠原蛋白的酸酶結(jié)合法，包括以下步驟：
(1)將豬皮皮下脂肪和表面的毛發(fā)剔除干凈，利用蒸餾水徹底洗凈后，切成豬皮小顆粒狀，再用蒸餾水潤(rùn)洗一遍，瀝干水；
(2)在40℃條件下，用體積比為5:3的異丙醇個(gè)乙酸乙酯混合有機(jī)溶劑，按照料液比為1:4m/v對(duì)豬皮顆粒脫脂4.5h，然后用蒸餾水反復(fù)潤(rùn)洗豬皮顆粒直至無有機(jī)溶劑氣味，瀝干水后，置于-20℃條件下保存?zhèn)溆茫?/p>
(3)將脫脂后的豬皮顆粒置于醋酸中，按與豬皮質(zhì)量比為0.0127mg/g加入胃蛋白酶，置于溫度為4.5℃的條件下提取63h；
(4)待提取結(jié)束后，加入氯化鈉粉末進(jìn)行鹽析出膠原絮狀沉淀，然后將膠原絮狀沉淀溶于0.4mol/L醋酸溶液中，再注入透析袋內(nèi)并先后于0.02mol/L的磷酸鈉溶液和蒸餾水中透析3～4天后，用硝酸銀溶液檢測(cè)透析液至無渾濁現(xiàn)象為止，真空冷凍干燥后即可得到產(chǎn)品。
實(shí)施例5
從豬皮中提取膠原蛋白的酸酶結(jié)合法，包括以下步驟：
(1)將豬皮皮下脂肪和表面的毛發(fā)剔除干凈，利用蒸餾水徹底洗凈后，切成4.5mm×4.5mm的豬皮小顆粒狀，再用蒸餾水潤(rùn)洗一遍，瀝干水；
(2)在40℃條件下，用體積比為5:3的異丙醇個(gè)乙酸乙酯混合有機(jī)溶劑，按照料液比為1:4m/v對(duì)豬皮顆粒脫脂4.5h，然后用蒸餾水反復(fù)潤(rùn)洗豬皮顆粒直至無有機(jī)溶劑氣味，瀝干水后，置于-20℃條件下保存?zhèn)溆茫?/p>
(3)將脫脂后的豬皮顆粒置于醋酸中，按與豬皮質(zhì)量比為0.013mg/g加入胃蛋白酶，置于溫度為5℃的條件下提取65h；
(4)待提取結(jié)束后，加入氯化鈉粉末進(jìn)行鹽析出膠原絮狀沉淀，然后將膠原絮狀沉淀溶于0.4mol/L醋酸溶液中，再注入透析袋內(nèi)并先后于0.02mol/L的磷酸鈉溶液和蒸餾水中透析3～4天后，用硝酸銀溶液檢測(cè)透析液至無渾濁現(xiàn)象為止，真空冷凍干燥后即可得到產(chǎn)品。
應(yīng)當(dāng)指出，以上案例僅是本發(fā)明有代表性的例子。顯然，本發(fā)明的技術(shù)方案并不限于上述實(shí)施例，還可以有許多變性。