本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種beclin1突變蛋白及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

細(xì)胞自噬(autophagy)是多細(xì)胞生物的一種“自食”現(xiàn)象，細(xì)胞通過包裹胞漿內(nèi)容物將其運(yùn)送到溶酶體系降解以循環(huán)使用降解產(chǎn)物供正常活動之需，該現(xiàn)象具有進(jìn)化保守性。自噬是機(jī)體重要的防御和保護(hù)機(jī)制，在許多生理和病理過程中扮演著復(fù)雜而多效的角色。在細(xì)胞生存受到威脅時，如缺氧或營養(yǎng)缺失，自噬可通過溶酶體降解生存非緊急的蛋白和細(xì)胞器等，循環(huán)使用新陳代謝營養(yǎng)原料以促進(jìn)細(xì)胞存活；自噬還可以降解和消除有毒性傾向的陳舊蛋白以及蛋白聚集體，形成保護(hù)機(jī)制以抵抗神經(jīng)退行性病變；此外，自噬亦能吞噬入侵的細(xì)菌和病毒，將其鎖定在自噬體內(nèi)，最終運(yùn)送到溶酶體消除以起到免疫防御的作用。自噬作用的紊亂會引起許多病理反應(yīng)，如腫瘤及神經(jīng)退行性疾病等。

自噬需要多個信號通路和酶復(fù)合物的協(xié)同作用，beclin1(bcl2-bindingmyosin-likeprotein1)為自噬分子機(jī)制的核心成分，是beclin1-vps34復(fù)合體中的骨架蛋白。vps34是哺乳動物iii型磷脂酰肌醇3激酶(pi3k)，它特異性地磷酸酯化肌糖環(huán)三位的磷脂酸肌醇并將其轉(zhuǎn)化為磷脂酸肌醇3磷酸酯(pi3ps)。vps34胞質(zhì)激酶活性的激活是自噬啟動機(jī)制中的關(guān)鍵步驟，因?yàn)樽允蛇^程的-用來包裹胞漿內(nèi)容物的雙膜自噬體-的形成需要大量由vps34產(chǎn)生的pi3ps。beclin1與vps34緊密結(jié)合，為自噬調(diào)節(jié)因子提供相互作用的平臺，因此它在自噬調(diào)控中扮演著獨(dú)特的角色。beclin1包含多個獨(dú)立的功能域，其卷曲螺旋域(coiledcoil)是募集眾多自噬調(diào)節(jié)因子的蛋白作用平臺，就目前所知，多個自噬調(diào)節(jié)因子均通過與beclin1相互作用而形成功能獨(dú)特的beclin1-vps34次級復(fù)合體以調(diào)節(jié)vps34的活性，從而發(fā)揮各自對自噬過程的調(diào)節(jié)作用。例如，atg14l(atg14-likeprotein)和uvrag(uvradiationassociatedgene)作為兩個關(guān)鍵的自噬激活因子，它們分別與beclin1相互作用，形成atg14l-beclin1-vps34復(fù)合體或uvrag-beclin1-vps34復(fù)合體，前者在自噬早期促進(jìn)自噬體的形成；后者在自噬晚期促進(jìn)自噬體的成熟，并協(xié)助內(nèi)吞轉(zhuǎn)運(yùn)(endocytictrafficking)。另外，細(xì)胞凋亡中的重要蛋白bcl-2也可以與beclin1直接作用，降低vps34活性和自噬通量。beclin1-vps34復(fù)合體活性的調(diào)節(jié)除了通過與自噬調(diào)控因子的結(jié)合來實(shí)現(xiàn)以外，還可以通過beclin1磷酸化實(shí)現(xiàn)，從而改變自噬強(qiáng)度。beclin1可在某些部位被磷酸化，從而影響beclin1-vps34復(fù)合體的形成，繼而敏銳而準(zhǔn)確地針對細(xì)胞內(nèi)諸多影響因素產(chǎn)生應(yīng)答。

目前，臨床上與腫瘤及神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的自噬抑制劑藥物選擇有限。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種beclin1突變蛋白及其制備方法和應(yīng)用，旨在解決現(xiàn)有細(xì)胞自噬抑制劑選擇有限的技術(shù)問題。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一方面，本發(fā)明提供一種beclin1突變蛋白，所述beclin1突變蛋白具有如seqidno:1所示的氨基酸序列；或如seqidno:1所示的氨基酸序列經(jīng)缺失、插入或替換所獲得的具有相同功能的氨基酸序列。

另一方面，本發(fā)明還提供一種編碼序列，所述編碼序列含有編碼上述beclin1突變蛋白的核苷酸序列。

還一方面，本發(fā)明還提供一種上述beclin1突變蛋白的制備方法，所述制備方法包括如下步驟：

獲得編碼上述beclin1突變蛋白的核苷酸序列；

將所述核苷酸序列插入pet載體中得重組質(zhì)粒；

將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21，并進(jìn)行異源表達(dá)培養(yǎng)；

提取所述大腸桿菌bl21異源表達(dá)的beclin1突變蛋白。

最后，發(fā)明還提供一種上述beclin1突變蛋白的應(yīng)用，所述beclin1突變蛋白用于制備自噬抑制劑。

本發(fā)明提供的beclin1突變蛋白(簡稱beclin1_227e231e)，具有鼠源beclin1的部分氨基酸序列(編號為174-266的氨基酸序列，簡稱beclin1_wt)，即ccd區(qū)(coiled-coildomain，卷曲螺旋區(qū))序列中的兩個酪氨酸(氨基酸編號分別227和231)同時突變?yōu)楣劝彼嵝纬傻耐蛔凅w的氨基酸序列。該beclin1突變蛋白能夠與atg14l競爭性結(jié)合beclin1_wt，形成二聚界面結(jié)合力更強(qiáng)的beclin1_wt-beclin1_227e231e二聚體，導(dǎo)致beclin1_wt-atg14l的解離；如其在細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)，導(dǎo)致表型上的自噬抑制。因此，其具有在治療自噬相關(guān)疾病的相關(guān)藥物開發(fā)價值。

本發(fā)明提供的beclin1突變蛋白的編碼序列，可翻譯成上述beclin1突變蛋白。因此，其可以用于制備表達(dá)上述beclin1突變蛋白的表達(dá)載體、宿主細(xì)胞等。

本發(fā)明提供的上述beclin1突變蛋白的制備方法，應(yīng)用基因技術(shù)，先將beclin1_227e231e的編碼序列的具體核苷酸序列人工合成，再將其在大腸桿菌bl21中異源表達(dá)、分離純化，得到高純度beclin1突變蛋白；其方法簡單易行，效率高、成本低。

本發(fā)明提供的上述beclin1突變蛋白的應(yīng)用，利用該beclin1突變蛋白的自噬抑制作用特點(diǎn)，將其用于制備自噬抑制劑，可用于治療自噬相關(guān)疾病。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中beclin1_227e231e的結(jié)構(gòu)圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中beclin1_227e231e的質(zhì)譜圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中免疫熒光結(jié)果圖；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例2中免疫印跡結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明要解決的技術(shù)問題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合附圖和實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

一方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種beclin1突變蛋白，該beclin1突變蛋白具有如seqidno:1所示的氨基酸序列；或如seqidno:1所示的氨基酸序列經(jīng)缺失、插入或替換所獲得的具有相同功能的氨基酸序列。seqidno:1：gpgsdseqlqrelkelaleeerliqeledveknrkvvaenlekvqaeaerldqeeaqeqreesefkrqqlelddelksvenqmryaqmqldklkktn。

因自噬的啟動需要經(jīng)歷三個步驟：第一步，beclin1_wt-beclin1_wt同源二聚體解離，變?yōu)閎elcin1_wt單體；第二步，beclin1_wt單體與atg14l形成beclin1_wt-atg14l異源二聚體；第三步，beclin1_wt-atg14l異源二聚體作為結(jié)合平臺，募集相應(yīng)活化因子，啟動自噬。基于這種蛋白相互作用的分子機(jī)制，在已解析的beclin1_wt-beclin1_wt同源二聚體三維結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，通過基因突變手段，將鼠源野生型beclin1蛋白中的兩個酪氨酸(氨基酸編號分別227和231)同時突變?yōu)楣劝彼嵝纬蒫cd區(qū)突變體，即該ccd區(qū)突變體長度為起始氨基酸編號174，終止氨基酸編號266，一共93個氨基酸，再引入連接表達(dá)載體的4個氨基酸(即最開始的4個氨基酸“gpgs”)，因此一共97個氨基酸組成本發(fā)明的beclin1突變蛋白的氨基酸序列。

該beclin1突變蛋白的結(jié)構(gòu)如圖1所示，且以分子對接方法計算二聚體二聚界面結(jié)合力，beclin1_227e231e所選取的突變位點(diǎn)為227、231，這兩個位點(diǎn)野生型占位殘基為酪氨酸，該兩個位置的酪氨酸可以被相應(yīng)激酶進(jìn)行磷酸化修飾，從而產(chǎn)生功能抑制作用，因此，本發(fā)明是利用227、231兩個位點(diǎn)酪氨酸磷酸化的模擬(e為谷氨酸，glutamicacid，三字母簡寫為glu，單字母簡寫為e，谷氨酸酸性氨基酸，可從電荷上模擬磷酸化后的原子微環(huán)境)。

相關(guān)的二聚體二聚界面結(jié)合力的強(qiáng)弱如表1所示，具體排序如下：beclin1_wt-beclin1_227e231e>beclin1_wt-atg14l>beclin1_wt-beclin1_wt。因此，該beclin1突變蛋白能夠與atg14l競爭性結(jié)合beclin1_wt，形成二聚界面結(jié)合力更強(qiáng)的beclin1_wt-beclin1_227e231e二聚體，導(dǎo)致beclin1_wt-atg14l的解離；如其在細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)，導(dǎo)致表型上的自噬抑制。因此，其具有在治療自噬相關(guān)疾病的相關(guān)藥物開發(fā)價值。

表1

另一方面，本發(fā)明實(shí)施例還提供了上述beclin1突變蛋白的編碼序列。該編碼序列可翻譯成本實(shí)施例的beclin1突變蛋白。因此，其可以用于制備表達(dá)上述beclin1突變蛋白的表達(dá)載體、宿主細(xì)胞等。

具體地，在本發(fā)明一實(shí)施例中，beclin1突變蛋白的氨基酸序列為seqidno:1時，該編碼序列的核苷酸序列為seqidno:2：gggcccggatccgacagtgaacagctacagagggagctgaaggagttggccttggaggaggagaggctgatccaggagctggaagatgtggaaaaaaaccgaaaggtggtggcagaaaacctggagaaggtccaggctgaggcggagagactggaccaggaggaagctcaggaacagcgagaagaaagtgaatttaaaaggcagcagctggagctggatgatgagctcaagagtgtagagaaccagatgcgctatgcccagatgcagctggacaagctcaagaaaaccaattga。

還一方面，本發(fā)明實(shí)施例還提供一種上述beclin1突變蛋白的制備方法。該制備方法包括如下步驟：

s01：獲得編碼上述beclin1突變蛋白的核苷酸序列；

s02：將上述核苷酸序列插入pet載體中得重組質(zhì)粒；

s03：將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21，并進(jìn)行異源表達(dá)培養(yǎng)；

s04：提取上述大腸桿菌bl21異源表達(dá)的beclin1突變蛋白。

本發(fā)明提供的上述beclin1突變蛋白的制備方法，應(yīng)用基因技術(shù)，先將beclin1_227e231e的編碼序列的具體核苷酸序列人工合成，再將其在大腸桿菌bl21中異源表達(dá)、分離純化，得到高純度beclin1突變蛋白；其方法簡單易行，效率高、成本低。

優(yōu)選地，上述步驟s01中，當(dāng)beclin1突變蛋白的氨基酸序列為seqidno:1時，該編碼序列的核苷酸序列為seqidno:2；該seqidno:2所示的核苷酸序列可以人工合成。

優(yōu)選地，上述步驟s02中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21的重組質(zhì)粒質(zhì)量為：10ng-30ng。在該質(zhì)量范圍內(nèi)，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21的效果達(dá)到最佳。

優(yōu)選地，上述步驟s03中，異源表達(dá)培養(yǎng)的條件為：在大腸桿菌bl21的培養(yǎng)基中添加0.2mm-0.5mm的iptg誘導(dǎo)劑，并在28℃-30℃下?lián)u瓶培養(yǎng)6h-8h。該培養(yǎng)條件下，beclin1突變蛋白表達(dá)量達(dá)到最佳。

優(yōu)選地，上述步驟s04中，beclin1突變蛋白的提取過程為：用超聲破碎大腸桿菌bl21，并離心處理得上清液；將上清液依次經(jīng)過親和層析和分子篩層析得所述beclin1突變蛋白。該提取條件可獲得高純度beclin1突變蛋白。

進(jìn)一步優(yōu)選的，親和層析為ni柱親和層析，分子篩層析為superdex200柱分子篩層析。這樣層析效果最佳。

進(jìn)一步優(yōu)選的，離心處理的離心力為：18000g-20000g(g為重力加速度)。在該離心力形成的離心條件下獲得的上清液所含的beclin1突變蛋白的量達(dá)到最佳。

最后，本發(fā)明實(shí)施例還提供一種上述beclin1突變蛋白的應(yīng)用，即beclin1突變蛋白用于制備自噬抑制劑。利用該beclin1突變蛋白的自噬抑制作用特點(diǎn)，將其用于制備自噬抑制劑，可用于治療自噬相關(guān)疾病，如腫瘤以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病。本發(fā)明實(shí)施例中，自噬抑制劑可以作為抗成纖維瘤藥物。

本發(fā)明先后進(jìn)行過多次試驗(yàn)，現(xiàn)舉一部分試驗(yàn)結(jié)果作為參考對發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)描述，下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)說明。

實(shí)施例1

一種beclin1突變蛋白，該beclin1突變蛋白的氨基酸序列為seqidno:1：gpgsdseqlqrelkelaleeerliqeledveknrkvvaenlekvqaeaerldqeeaqeqreesefkrqqlelddelksvenqmryaqmqldklkktn。

該beclin1突變蛋白的理論等電點(diǎn)pi為4.50，分子量為11529.6，其制備方法如下。

s11：人工合成seqidno:2所示的核苷酸序列。

s12：將上述核苷酸序列插入pet載體(其攜帶6個組氨酸標(biāo)簽用于后續(xù)純化)中得重組質(zhì)粒。

s13：用上述重組質(zhì)粒10ng-30ng轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21，并進(jìn)行異源表達(dá)培養(yǎng)；異源表達(dá)培養(yǎng)的條件為：在大腸桿菌bl21的培養(yǎng)基中添加0.2mm-0.5mm的iptg誘導(dǎo)劑，并在28℃-30℃下?lián)u瓶培養(yǎng)6h-8h。

s14：提取上述大腸桿菌bl21異源表達(dá)的beclin1突變蛋白。提取過程為：用超聲儀超聲破碎大腸桿菌bl21，并在離心力為18000g-20000g的條件下離心處理得上清液；將該上清液依次經(jīng)過ni柱親和層析(ge，hitrap)和分子篩層析(ge，superdex200)，純化得beclin1突變蛋白。

對提取的beclin1突變蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析，其結(jié)果如圖2所示，可確認(rèn)單體分子量與理論值相同。同時，用光散射儀測定beclin1突變蛋白聚合狀態(tài)，結(jié)果顯示beclin1_227e231e-beclin1_227e231e為同源二聚體(先前研究顯示野生型beclin1_wt-beclin1_wt為同源二聚體)，表示beclin1突變蛋白的聚合狀態(tài)與野生型一樣，二聚體同源界面的結(jié)合未因突變而改變。

另外，用恒溫量熱滴定儀測定體外蛋白相互作用，將beclin1_wt溶液滴入atg14l溶液、將beclin1_227e231e溶液滴入beclin1_wt溶液、將beclin1_227e231e溶液滴入atg14l溶液，測定結(jié)合常數(shù)，并進(jìn)行定量計算，發(fā)現(xiàn)beclin1_227e231e能夠干擾atg14l與beclin1_wt之間的作用，使beclin1_wt-atg14l復(fù)合物解離，導(dǎo)致自噬下調(diào)。

實(shí)施例2

用上述實(shí)施例1獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞系(人成纖維瘤細(xì)胞)，通過免疫熒光法和免疫印記法表征本實(shí)施例1中beclin1突變蛋白的生物學(xué)功效。

免疫熒光

本實(shí)施例選用人成纖維瘤ht1080細(xì)胞系，在補(bǔ)充10％fbs和1％的neaa的mem中培養(yǎng)。將細(xì)胞系傳代至6孔板中，過夜培養(yǎng)，第二天細(xì)胞貼壁后，分為兩組：一組轉(zhuǎn)染攜帶綠色熒光蛋白(gfp)的beclin1_wt和攜帶紅色熒光蛋白(asred)的atg14l，另一組轉(zhuǎn)染攜帶綠色熒光蛋白(gfp)的beclin1_227e231e和攜帶紅色熒光蛋白(asred)的atg14l，37℃培養(yǎng)箱中孵育24小時，將細(xì)胞用pbs清洗后，用甲醛溶液室溫固定細(xì)胞15分鐘，最后pbs潤洗，立即在顯微鏡下觀察。

結(jié)果如圖3所示，beclin1野生型和atg14l在人纖維瘤ht1080細(xì)胞胞漿中有明顯的共定位，表明兩者已形成復(fù)合物(圖3a)；而beclin1_227e231e和atg14l無顯微鏡可觀測的共定位特征，即兩者沒有形成復(fù)合物(圖3b)。

免疫印記

本實(shí)施例選用人成纖維瘤ht1080細(xì)胞系，在補(bǔ)充10％fbs和1％的neaa的mem中培養(yǎng)。將細(xì)胞傳代至6孔板中，過夜培養(yǎng)，第二天細(xì)胞貼壁后，轉(zhuǎn)染beclin1_wt及beclin1_227e231e，37℃培養(yǎng)箱中孵育24小時，將細(xì)胞用pbs清洗后，lysisbuffer裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白。將提取的細(xì)胞蛋白經(jīng)過煮沸變性后，利用免疫印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)行目標(biāo)蛋白表征，檢測beclin1_wt及beclin1_227e231e過表達(dá)對細(xì)胞自噬活性標(biāo)志物l3-i/ii轉(zhuǎn)化及p62蛋白降解水平的影響，即對自噬水平的影響。

結(jié)果如圖4所示：通過wb(westernblot蛋白質(zhì)印跡)重復(fù)試驗(yàn)證實(shí)，轉(zhuǎn)染處理24小時后，與野生型(圖4中wt)相比，beclin1_227e231e(圖4中227e231e)的過表達(dá)能使內(nèi)源性lc3-ii轉(zhuǎn)化率降低，同時p62蛋白降解速率下降，即表明beclin1_227e231e具有抑制自噬的作用。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>深圳人仁生物醫(yī)藥科技有限公司

<120>beclin1突變蛋白及其制備方法和應(yīng)用

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>1

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<212>prt

<213>人工序列

<400>1

glyproglyseraspsergluglnleuglnarggluleulysgluleu

151015

alaleugluglugluargleuileglngluleugluaspvalglulys

202530

asnarglysvalvalalagluasnleuglulysvalglnalagluala

354045

gluargleuaspglngluglualaglngluglnargglugluserglu

505560

phelysargglnglnleugluleuaspaspgluleulysservalglu

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<213>人工序列

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gggcccggatccgacagtgaacagctacagagggagctgaaggagttggccttggaggag60

gagaggctgatccaggagctggaagatgtggaaaaaaaccgaaaggtggtggcagaaaac120

ctggagaaggtccaggctgaggcggagagactggaccaggaggaagctcaggaacagcga180

gaagaaagtgaatttaaaaggcagcagctggagctggatgatgagctcaagagtgtagag240

aaccagatgcgctatgcccagatgcagctggacaagctcaagaaaaccaattga294