本發(fā)明涉及一種表達(dá)載體及其在植物基因功能研究中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

基因是存在于染色體上的一段dna序列，生物的性狀都是由基因的表達(dá)與否控制的。研究基因的功能不僅可以獲取基因的具體生物學(xué)信息，更可以直接進(jìn)行操作和改良，為人類生活和健康提供服務(wù)。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和生物學(xué)的迅猛發(fā)展，許多模式生物的基因功能已被解析。在國(guó)際上，酵母全基因組基因缺失突變體已經(jīng)構(gòu)建完成；在線蟲以及果蠅中，利用不同的功能基因組學(xué)方法也闡明了許多基因的功能。近年來(lái)，在植物的模式生物擬南芥和水稻中，功能基因組學(xué)也取得了矚目的成就。但是，對(duì)于大多數(shù)不是模式生物的作物，功能基因組學(xué)研究顯得相對(duì)滯后。大豆在我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占據(jù)重要地位，為我們提供豐富的蛋白質(zhì)資源和油料品種。但由于大豆基因組結(jié)構(gòu)龐大，同時(shí)也是4倍體作物，含有大量非編碼序列冗余重復(fù)基因，所以對(duì)其功能基因組研究顯得十分滯后。

大規(guī)模研究基因功能的方法有正向遺傳學(xué)和反向遺傳學(xué)。正向遺傳學(xué)從表型入手，構(gòu)建群體定位基因，最后闡明基因功能，比如ems誘變等，但這種方法耗時(shí)，效率偏低，僅僅依靠ems誘變已不能滿足快速有效分析基因功能的需求。反向遺傳學(xué)從突變的基因入手，尋找表型，最后解釋基因功能，如建立t-dna插入突變體庫(kù)等，但這種方法在基因冗余程度高的物種中不好應(yīng)用。

cdna文庫(kù)是表達(dá)基因的集合，建立全長(zhǎng)cdna文庫(kù)，從全長(zhǎng)cdna文庫(kù)中大規(guī)模發(fā)掘?qū)ふ一蚬δ苁且粋€(gè)可靠的選擇。全長(zhǎng)cdna是指不僅包含完整的閱讀框架，還擁有5’和3’端非編碼區(qū)的cdna。全長(zhǎng)cdna文庫(kù)的優(yōu)點(diǎn)非常明顯，其絕大多數(shù)克隆是全長(zhǎng)的，這不僅能大大提高基因測(cè)序和生物信息學(xué)分析過(guò)程，還利于后期蛋白質(zhì)表達(dá)和功能分析。此外，全長(zhǎng)cdna文庫(kù)是高效、大規(guī)模分離闡釋基因功能信息的一條有效途徑。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種表達(dá)載體及其在植物基因功能研究中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種特異表達(dá)載體：包括如下元件：lb序列、rb序列、抗性篩選基因甲、抗性篩選基因乙、啟動(dòng)子、終止子和特異dna分子；所述特異dna分子中具有兩個(gè)sfii酶切位點(diǎn)；所述特異表達(dá)載體中，所述特異dna分子以外的其它部分不具有sfii酶切位點(diǎn)；所述啟動(dòng)子、所述特異dna分子和所述終止子處于同一表達(dá)盒，且自上游至下游依次為：所述啟動(dòng)子、所述特異dna分子和所述終止子。

所述特異dna分子如序列表的序列1自5’端第2568-2605位核苷酸所示。

所述特異dna分子位于所述特異表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)中。

所述抗性篩選基因甲為bar基因。所述bar基因如序列表的序列1自5’端第759-1310位核苷酸所示。

所述抗性篩選基因乙為卡那霉素抗性基因。所述卡那霉素抗性基因如序列表的序列1自5’端第4571-5365位核苷酸所示。

所述啟動(dòng)子為35s啟動(dòng)子。所述35s啟動(dòng)子如序列表的序列1自5’端第1617-2456位核苷酸所示。

所述終止子為nos終止子。所述nos終止子如序列表的序列1自5’端第2640-2892位核苷酸所示。

所述lb序列如序列表的序列1自5’端第1-25位核苷酸所示。

所述rb序列如序列表的序列1自5’端第2945-2969位核苷酸所示。

所述特異表達(dá)載體為序列表的序列1所示的環(huán)形質(zhì)粒。

本發(fā)明還保護(hù)一種試劑盒，包括以上任一所述特異表達(dá)載體；所述試劑盒的功能為如下(a1)-(a9)中的至少一種：

(a1)構(gòu)建cdna文庫(kù)；

(a2)構(gòu)建大豆cdna文庫(kù)；

(a3)構(gòu)建植物cdna文庫(kù)；

(a4)研究大豆基因功能；

(a5)研究植物基因功能；

(a6)挖掘植物新基因；

(a7)挖掘植物新基因并驗(yàn)證其功能；

(a8)挖掘大豆新基因；

(a9)挖掘大豆新基因并驗(yàn)證其功能。

所述試劑盒還包括菌株。所述菌株具體可為大腸桿菌或農(nóng)桿菌。所述大腸桿菌具體可為dh10b-t1菌株。所述農(nóng)桿菌具體可為農(nóng)桿菌gv3101。

本發(fā)明還保護(hù)以上任一所述特異表達(dá)載體或以上任一所述試劑盒的應(yīng)用，為如下(b1)-(b9)中的至少一種：

(b1)構(gòu)建cdna文庫(kù)；

(b2)構(gòu)建大豆cdna文庫(kù)；

(b3)構(gòu)建植物cdna文庫(kù)；

(b4)研究大豆基因功能；

(b5)研究植物基因功能；

(b6)挖掘植物新基因；

(b7)挖掘植物新基因并驗(yàn)證其功能；

(b8)挖掘大豆新基因；

(b9)挖掘大豆新基因并驗(yàn)證其功能。

本發(fā)明還保護(hù)一種植物cdna文庫(kù)的構(gòu)建方法(方法甲)，包括如下步驟：(1)提取植物總rna；(2)以所述總rna為模板，采用引物5sm4z、引物5sm4za和引物5sm4zb進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到第一鏈cdna；(3)將第一鏈cdna均一化，得到均一化cdna；(4)采用限制性內(nèi)切酶sfii酶切均一化cdna，得到酶切產(chǎn)物；(4)將權(quán)利要求1-5任一所述的表達(dá)載體采用限制性內(nèi)切酶sfii酶切，得到載體骨架；(5)將所述酶切消化產(chǎn)物和所述載體骨架連接，得到植物cdna文庫(kù)。

所述引物5sm4z如序列表的序列2所示。

所述引物5sm4za如序列表的序列3所示。

所述引物5sm4zb如序列表的序列4所示。

所述步驟(1)中，所述總rna為混合總rna。所述混合總rna具體通過(guò)將植物根、莖、葉和莖尖組織的總rna混合得到。

所述步驟(2)中，所述引物5sm4z、引物5sm4za和引物5sm4zb具體可按照摩爾比1∶1∶1加入。

所述步驟(3)中，所述“將第一鏈cdna均一化”具體可采用差減雜交法進(jìn)行。所述均一化cdna的制備方法具體可包括如下步驟：

(a)以所述總rna為模板，采用引物tester

(cagtggtatcaacgcagagtttttttttttttttttt)進(jìn)行pcr，得到testercdna；將tests5序列(單鏈，cagtggtatcaacgcagag)連接到testercdna的3′端，然后采用5′磷酸化引物tests3(5pgtaatacgactcactatagggc)進(jìn)行pcr擴(kuò)增(pcr擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃1.5min；95℃30s，55℃30s，72℃3min，15個(gè)循環(huán)；72℃10min)，得到全長(zhǎng)冗余富集的testercdna；將全長(zhǎng)冗余富集的testercdna采用lambdaexonuclease消化；

(b)以所述總rna為模板，采用引物driver

(gggtaactataacggtcctaaggtagctttttttttttttttttt)進(jìn)行pcr，得到drivercdna；將driver5序列(單鏈，gaacacgcgtcgtttacctcc)連接到drivercdna的3′端，然后采用5′磷酸化引物driver3

(5pgggtaactataacggtcctaaggtagc)進(jìn)行pcr擴(kuò)增(pcr擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃1.5min；95℃30s，55℃30s，72℃3min，15個(gè)循環(huán)；72℃10min)，得到全長(zhǎng)冗余富集的drivercdna；將全長(zhǎng)冗余富集的drivercdna采用lambdaexonuclease消化；

(c)將步驟(a)的產(chǎn)物和步驟(b)的產(chǎn)物以摩爾比20∶1混合后，采用50mmtris-hcl(ph8.0)，0.5mnacl，0.2mmedta緩沖液作為體系，與步驟(2)得到的第一鏈edna進(jìn)行核酸雜交，68℃雜交6小時(shí)，去除雙鏈的冗余分子(具體方法可參照文獻(xiàn)：“patanjalisr，parimoos，weissmansm.constructionofauniform-abundance(normalized)cdnalibrary.[j].proceedingsofthenationalacademyofsciences，1991，88(5)：1943-7.”和“soaresmb，jelenep，sul，etal.constructionandcharacterizationofanormalizedcdnalibrary[j].proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica，1994，91(20)：9228-32.”)

(d)將步驟(c)得到的產(chǎn)物采用引物(cagtggtatcaacgcagag)進(jìn)行pcr擴(kuò)增(pcr擴(kuò)增的反應(yīng)程度為：95℃2min；95℃12s，68℃8min，20個(gè)循環(huán)；68℃30min)，得到均一化cdna。

本發(fā)明還保護(hù)所述方法甲的應(yīng)用，為如下(c1)-(c3)中的至少一種：

(c1)研究植物基因功能；

(c2)挖掘植物新基因；

(c3)挖掘植物新基因并驗(yàn)證其功能。

本發(fā)明還保護(hù)一種植物基因功能的研究方法，包括如下步驟：按照方法甲所述的方法構(gòu)建植物cdna文庫(kù)，將所述cdna文庫(kù)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，得到重組農(nóng)桿菌；將所述重組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化目的植物，通過(guò)同時(shí)對(duì)插入載體骨架的dna片段進(jìn)行序列分析和觀察轉(zhuǎn)化植物的表型，對(duì)植物基因功能進(jìn)行研究。

所述農(nóng)桿菌具體可為農(nóng)桿菌gv3101。

所述目的植物具體可為擬南芥。更具體可為哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。

以上任一所述植物具體可為擬南芥。更具體可為哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。

以上任一所述植物具體可為大豆。更具體可為大豆品種williams82。

選擇合適的載體連接cdna文庫(kù)是利用cdna文庫(kù)研究基因功能的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。本發(fā)明人工構(gòu)建了一種特異表達(dá)載體，作為連接cdna文庫(kù)的載體，該載體承載量大，適合大片段cdna的插入，同時(shí)含有35s啟動(dòng)子以及用于轉(zhuǎn)基因植物篩選的bar基因(提供basta抗性篩選)，可以用于構(gòu)建植物過(guò)表達(dá)載體，35s啟動(dòng)子是目前使用頻率最高的過(guò)表達(dá)啟動(dòng)子，過(guò)表達(dá)基因能夠使基因功能凸顯出來(lái)，對(duì)于快速鑒定基因最終作用功能十分有效。本發(fā)明將構(gòu)建的表達(dá)載體與獲得的全長(zhǎng)cdna文庫(kù)連接，得到過(guò)表達(dá)的大豆全長(zhǎng)cdna文庫(kù)，然后轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得眾多表型，證明了這一方法對(duì)于研究大豆功能基因組的有效性。

附圖說(shuō)明

圖1為總rna電泳圖。

圖2為第一鏈cdna電泳圖。

圖3為均一化的cdna電泳圖。

圖4為菌落pcr檢測(cè)電泳結(jié)果圖。

圖5為大豆各染色體上對(duì)應(yīng)的測(cè)序基因數(shù)目。

圖6為陽(yáng)性苗篩選結(jié)果。

圖7為不同表型的陽(yáng)性苗。

具體實(shí)施方式

以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

大豆品種williams82：中國(guó)國(guó)家作物種質(zhì)資源庫(kù)(http：//www.cgris.net/)。

dh10b-t1菌株：invitrogen，貨號(hào)：c5100-03。

農(nóng)桿菌gv3101：北京全是金公司，貨號(hào)：waryonggt707。

哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(arabidopsisthalianaecotypecolumbia，col-0)：abrc(arabidopsisbiologicalresourcecenter)。

basta：invitrogen，貨號(hào)：w9062-100ml。

實(shí)施例1、表達(dá)載體的構(gòu)建

人工合成序列表的序列1所示的環(huán)形質(zhì)粒，將其命名為特異表達(dá)載體。特異表達(dá)載體可用于構(gòu)建cdna文庫(kù)、研究植物基因功能、發(fā)掘植物新基因以及進(jìn)行植物新基因的功能驗(yàn)證。

特異表達(dá)載體包括如下元件：農(nóng)桿菌識(shí)別序列l(wèi)b(序列1自5’端第1-25位)和rb(序列1自5’端第2945-2969位)、bar基因(序列1自5’端第759-1310位)、卡那霉素抗性基因(序列1自5’端第4571-5365位)、35s啟動(dòng)子(序列1自5’端第1617-2456位)、特異dna分子(序列1自5’端第2568-2605位)、nos終止子(序列1自5’端第2640-2892位)。特異dna分子中具有兩個(gè)sfii酶切位點(diǎn)。特異表達(dá)載體中，特異dna分子以外的其它部分不具有sfii酶切位點(diǎn)。

特異表達(dá)載體承載量大(可插入大于10kb的外源dna)，適合大片段cdna的插入。同時(shí)特異表達(dá)載體含有35s啟動(dòng)子、農(nóng)桿菌識(shí)別序列l(wèi)b和rb以及用于轉(zhuǎn)基因植物篩選的bar基因(提供basta抗性篩選)，可以用于構(gòu)建含有cdna的植物過(guò)表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化目的植物得到轉(zhuǎn)基因植物。35s啟動(dòng)子是目前使用頻率最高的過(guò)表達(dá)啟動(dòng)子，過(guò)表達(dá)基因能夠使基因功能凸顯出來(lái)，對(duì)于快速鑒定基因最終作用功能十分有效。

特異表達(dá)載體的應(yīng)用原理如下：

提取大豆的總rna，將總rna用加接頭序列(sfii酶切位點(diǎn))的引物反轉(zhuǎn)錄得到cdna，并對(duì)cdna均一化，然后采用限制性內(nèi)切酶sfii進(jìn)行酶切，得到酶切產(chǎn)物(每個(gè)edna中均具有限制性內(nèi)切酶sfii識(shí)別序列，因此得到核苷酸序列不同的多種酶切產(chǎn)物)；

取特異表達(dá)載體，采用限制性內(nèi)切酶sfii酶進(jìn)行酶切，收集載體骨架；

將所述酶切產(chǎn)物和所述載體骨架連接(由于前面步驟中得到了多種酶切產(chǎn)物，因此連接后得到具有不同插入序列的多個(gè)重組質(zhì)粒，這些重組質(zhì)粒組成cdna文庫(kù))，然后轉(zhuǎn)化宿主菌，通過(guò)卡那霉素抗性篩選獲得重組菌(cdna文庫(kù)由多個(gè)重組質(zhì)粒組成，因此得到了多個(gè)重組菌)；

分別取各個(gè)重組菌，提取質(zhì)粒，一方面通過(guò)測(cè)序獲得插入載體骨架的dna片段的序列，另一方面對(duì)出發(fā)植物進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化并通過(guò)basta抗性篩選獲得轉(zhuǎn)基因植物，通過(guò)比較出發(fā)植物與轉(zhuǎn)基因植物的性狀差異發(fā)掘來(lái)源于大豆cdna的基因功能。

實(shí)施例2、大豆cdna文庫(kù)的構(gòu)建

1、分別提取大豆品種williams82幼苗3片復(fù)葉時(shí)期的根、莖、葉和莖尖組織的總rna，將各組織提取的總rna混合，得到混合總rna(電泳結(jié)果如圖1所示)。

2、以步驟1得到的混合總rna為模板，采用引物5sm4z、引物5sm4za和引物5sm4zb(摩爾比1∶1∶1)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成第一鏈cdna(電泳結(jié)果如圖2所示)。

5sm4z：5’-gccattacggccaagttacggggg-3’；

5sm4za：5’-gccattacggccaagttacgggg-3’；

5sm4zb：5’-gccattacggccaagttacggg-3’。

引物5sm4z、引物5sm4za和引物5sm4zb中，下劃線為sfii酶切位點(diǎn)。

3、將步驟2合成的第一鏈cdna用差減雜交法去除豐度高的序列，獲得均一化的cdna。具體方法如下：

(a)以步驟1得到的混合總rna為模板，采用引物tester

(cagtggtatcaacgcagagtttttttttttttttttt)進(jìn)行pcr，得到testercdna；將tests5序列(單鏈，cagtggtatcaacgcagag)連接到testercdna的3′端，然后采用5′磷酸化引物tests3(5pgtaatacgactcactatagggc)進(jìn)行pcr擴(kuò)增(pcr擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃1.5min；95℃30s，55℃30s，72℃3min，15個(gè)循環(huán)；72℃10min)，得到全長(zhǎng)冗余富集的testercdna；將全長(zhǎng)冗余富集的testercdna采用lambdaexonuclease消化；

(b)以步驟1得到的混合總rna為模板，采用引物driver

(gggtaactataacggtcctaaggtagctttttttttttttttttt)進(jìn)行pcr，得到drivercdna；將driver5序列(單鏈，gaacacgcgtcgtttacctcc)連接到drivercdna的3′端，然后采用5′磷酸化引物driver3

(5pgggtaactataacggtcctaaggtagc)進(jìn)行pcr擴(kuò)增(pcr擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃1.5min；95℃30s，55℃30s，72℃3min，15個(gè)循環(huán)；72℃10min)，得到全長(zhǎng)冗余富集的drivercdna；將全長(zhǎng)冗余富集的drivercdna采用lambdaexonuclease消化；

(c)將步驟(a)的產(chǎn)物和步驟(b)的產(chǎn)物以摩爾比20∶1混合后，采用50mmtris-hcl(ph8.0)，0.5mnacl，0.2mmedta緩沖液作為體系，與步驟(2)得到的第一鏈cdna進(jìn)行核酸雜交，68℃雜交6小時(shí)，去除雙鏈的冗余分子(具體方法可參照文獻(xiàn)：“patanjalisr，parimoos，weissmansm.constructionofauniform-abundance(normalized)cdnalibrary.[j].proceedingsofthenationalacademyofsciences，1991，88(5)：1943-7.”和“soaresmb，jelenep，sul，etal.constructionandcharacterizationofanormalizedcdnalibrary[j].proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica，1994，91(20)：9228-32.”)

(d)將步驟(c)得到的產(chǎn)物采用引物(cagtggtatcaacgcagag)進(jìn)行pcr擴(kuò)增(pcr擴(kuò)增的反應(yīng)程度為：95℃2min；95℃12s，68℃8min，20個(gè)循環(huán)；68℃30min)，得到均一化cdna(電泳結(jié)果如圖3所示)。

4、采用限制性內(nèi)切酶sfii酶切步驟3得到的均一化的cdna，回收大于1kb的酶切消化產(chǎn)物。

5、采用限制性內(nèi)切酶sfii酶切實(shí)施例1構(gòu)建的步驟一構(gòu)建的表達(dá)載體，回收約6000bp的載體骨架。

6、將步驟4得到的酶切消化產(chǎn)物和步驟5得到的載體骨架連接，得到連接產(chǎn)物(cdna質(zhì)粒文庫(kù))。

7、將步驟6得到的cdna質(zhì)粒文庫(kù)轉(zhuǎn)化dh10b-t1菌株，接種于含有50μg/ml卡那霉素的lb固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，共獲得1.0×10⁶個(gè)克隆菌落。隨機(jī)選取若干菌落測(cè)序，結(jié)果顯示質(zhì)粒中插入片段中存在大于10kb的片段。從若干菌落中再隨機(jī)挑取14個(gè)菌落，采用引物f和引物r進(jìn)行菌落pcr檢測(cè)重復(fù)率克隆大小。電泳結(jié)果如圖4所示，結(jié)果顯示14個(gè)克隆中沒(méi)有重復(fù)克隆出現(xiàn)，并且大小在大約1.0-3.0kb范圍內(nèi)(已測(cè)序驗(yàn)證)，質(zhì)量達(dá)到要求。

f：5’-gacgcacaatcccactatc-3’：

r：5’-gccaatatatcctgtcaaacactg-3’。

8、將步驟6得到的cdna質(zhì)粒文庫(kù)用電轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入農(nóng)桿菌gv3101，得到重組農(nóng)桿菌。將重組農(nóng)桿菌接種于含有50μg/ml卡那霉素的lb固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑選96個(gè)菌斑，采用引物f和引物r進(jìn)行菌落pcr，產(chǎn)物測(cè)序測(cè)3kb，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果表明重復(fù)序列只占3％，說(shuō)明重復(fù)序列少。同時(shí)測(cè)出的基因序列在大豆20條染色體上都有分布，最少6個(gè)基因序列，最多16個(gè)，說(shuō)明庫(kù)容量大(圖5)。

9、將步驟8得到的重組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(方法參照文獻(xiàn)：cloughsj，bentaf.floraldip：asimplifiedmethodforagrobacterium-mediatedtransformationofarabidopsisthaliana[j].plantjournalforcell&molecularbiology，1998，16(6)：735.)，收獲t0代種子。將t0代種子播種到溫室，待子葉完全伸展開(kāi)后將basta(1∶1000稀釋)噴灑至葉片表面，每隔3天噴灑一次，持續(xù)2周。陽(yáng)性苗可正常生長(zhǎng)，陰性苗沒(méi)有抗性，最后全部死亡。

篩選結(jié)果如圖6所示。箭頭指向的為陽(yáng)性苗。

觀察陽(yáng)性苗表型，結(jié)果如圖7所示。

圖7中，陽(yáng)性苗顯示不同表型，具體如下所示：

a：鋸齒狀葉片(箭頭)；

b：失去中心莖尖分生組織活性(上箭頭)、葉子向上卷曲(下箭頭)；

c：棒狀葉子(箭頭)；

d：生長(zhǎng)緩慢(箭頭)；

e：不平整皺褶葉面(箭頭)；

f：不開(kāi)花(箭頭)；

g：分支增多(箭頭)；

h：莖干變矮且無(wú)莖生葉(白色箭頭)，黑色箭頭為正常表型；

i、j：莖干無(wú)表皮毛(白色箭頭)，黑色箭頭為正常表型有表皮毛。

上述結(jié)果表明，通過(guò)使用本發(fā)明的特異表達(dá)載體構(gòu)建大豆全長(zhǎng)cdna文庫(kù)，然后轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得眾多表型，證明了利用這一方法進(jìn)行篩選和分析基因，可以進(jìn)行大豆功能基因組的研究，并且這一方法還可以延伸到油菜，花生，芝麻等其它基因組學(xué)研究滯后的作物。

<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所

<120>一種表達(dá)載體及其在植物基因功能研究中的應(yīng)用

<160>4

<210>1

<211>6285

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

tggcaggatatattgtggtgtaaacaaattgacgcttagacaacttaataacacattgcg60

gacgtttttaaagtactggggtggttttggtaccgggccccccctcgaggtcgacggtat120

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