本發(fā)明涉及一種狀元豆多糖脫色脫蛋白的純化方法。
背景技術(shù)：
目前多糖脫色脫蛋白方法主要有：酶法、有機(jī)試劑法(Sevage法、三氯乙酸法等)、吸附法(活性炭法、大孔樹脂法等)、過氧化氫氧化法等。其中有機(jī)試劑法存在重復(fù)次數(shù)多、試劑用量大等問題，酶法存在成本較高，且滅活溫度高易破壞多糖結(jié)構(gòu)破壞活性等問題，過氧化氫存在易造成多糖降解等問題，活性炭存在脫色時間長，多糖損失量大等問題。而大孔樹脂法主要通過范德華力作用或離子交換結(jié)合蛋白、色素達(dá)到目的，操作步驟簡單，對多糖結(jié)構(gòu)影響小，且樹脂具有價廉、環(huán)保、選擇性好、操作簡單、吸附快且容量大及可重復(fù)使用等優(yōu)點。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
基于目前尚未見脫除狀元豆粗多糖中色素、蛋白質(zhì)的研究報道，本發(fā)明的目的在于提供一種狀元豆多糖脫色脫蛋白的純化方法，具有操作步驟簡單，對多糖結(jié)構(gòu)影響小，且成本低、環(huán)保、吸附快且容量大等優(yōu)點。
為了達(dá)成上述目的，本發(fā)明的解決方案是：
一種狀元豆多糖脫色脫蛋白的純化方法，其步驟如下：
第一步，狀元豆多糖的提?。?/p>
將烘干至恒重的狀元豆，粉碎過40目篩，索氏提取器中回流4h，回流提取溶劑為乙酸乙酯，回流提取2次，除酯類物質(zhì)，取出，通風(fēng)干燥；
上述獲得的去脂狀元豆粉末在超聲波裝置中水浴提取2h，回流提取3次，再離心取上清液；
上清液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至含水率為10％±1％，加入乙醇沉淀多糖，4℃冰箱冷藏過夜，4500r/min離心15min取沉淀物，依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，低溫干燥得到狀元豆粗多糖；
第二步，D113弱酸性陽離子交換樹脂的預(yù)處理：
去離子水反復(fù)浸洗至水澄清無褐色，選取玻璃層析柱，濕法裝柱，先用堿溶液洗脫，再去離子水洗至pH值為7±0.2，接著用酸溶液洗脫后，去離子水洗至pH值為7±0.2，去離子水浸泡備用；
第三步，狀元豆多糖脫色脫蛋白的純化：
采用D113弱酸性陽離子交換樹脂，以質(zhì)量濃度為4.0～4.5mg/mL，pH值為5.3～5.8，2.7～3.2BV體積加入狀元豆粗多糖，1.4～1.9mL/min流速操作，去除蛋白，脫色，保留多糖。
所述第一步，狀元豆粉末：乙酸乙酯(g:mL)＝1：200-220，沸點60℃。
所述第一步，去脂狀元豆粉末：水(g:mL)＝1：30-40，超聲功率300W，超聲溫度50℃，超聲時間40min，離心4500r/min，15min。
所述第一步，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀轉(zhuǎn)速120r/min，65℃水浴；離心；無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌用量為沉淀物的2-3倍(m/v)；低溫干燥溫度在40℃以下，在真空干燥箱中進(jìn)行。
所述第三步，純化操作后，用20～40％乙醇配制的0.5～2.0mol/L鹽酸，以1.0～3.0mL/min流速洗脫1.0～2.5h后，使樹脂再生。
采用上述方法后，本發(fā)明利用D113弱酸性陽離子交換樹脂(大孔樹脂)對狀元豆多糖進(jìn)行脫色脫蛋白，蛋白去除率達(dá)89.37～91.11％，脫色率達(dá)85.51～87.69％，多糖保留率達(dá)93.82～95.22％，可有效提高脫色和脫蛋白率，降低生產(chǎn)成本，減少有機(jī)溶劑的使用，同時可最大限度地保護(hù)多糖結(jié)構(gòu)，為狀元豆粗多糖初步純化和后期狀元豆多糖理化性質(zhì)及生物活性等研究提供科學(xué)依據(jù)。
與各種其他方法(酶法、Sevage法、活性炭法、TCA法、H2O2等)和靜態(tài)純化操作相比，避免了使用有機(jī)溶劑，操作簡單省時，工藝安全、環(huán)保、經(jīng)濟(jì)、成本低、吸附快且容量大，樹脂可循環(huán)再利用，且經(jīng)其處理后的狀元豆多糖更有利于進(jìn)一步的功能活性研究。
附圖說明
圖1是不同再生法的再生效果圖。
具體實施方式
本發(fā)明以脫色率、蛋白脫除率和多糖保留率為綜合評價指標(biāo)，并引入了綜合效應(yīng)指數(shù)客觀評價10種大孔樹脂對狀元豆粗多糖蛋白和色素吸附性能，篩選出效果最佳的樹脂，在此基礎(chǔ)上，通過單因素試驗及利用Design-Expert軟件對D113大孔樹脂的脫色脫蛋白工藝條件進(jìn)行分析優(yōu)化，并對D113樹脂再生條件的進(jìn)行了考察。
本發(fā)明的具體步驟是：
一、狀元豆多糖的提取
將105℃烘干至恒重的狀元豆，粉碎過40目篩，索氏提取器中回流4h，除酯類物質(zhì)，取出，通風(fēng)干燥?；亓魈崛∪軇橐宜嵋阴?，回流提取2次。狀元豆粉末：乙酸乙酯(g:mL)＝1：200-220，沸點60℃。
獲得的去脂狀元豆粉在超聲波裝置中水浴提取2h，回流提取3次，離心取上清液。去脂狀元豆粉末：水(g:mL)＝1：30-40，超聲功率300W，超聲溫度50℃，超聲時間40min，離心4500r/min，15min。
上清液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至含水率為10％左右，加入乙醇沉淀多糖，4℃冰箱冷藏過夜，4500r/min離心15min取沉淀物，低溫干燥得到狀元豆粗多糖。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀轉(zhuǎn)速120r/min，65℃水?。怀恋矶嗵堑囊掖加昧渴?倍量溶液體積，95％濃度；沉淀物依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，低溫干燥得到狀元豆粗多糖。無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌用量為沉淀物的2-3倍(m/v)；低溫干燥溫度在40℃以下，在真空干燥箱中進(jìn))。
二、狀元豆多糖脫色脫蛋白試驗
(1)樹脂預(yù)處理及篩選試驗
大孔吸附樹脂(DA201、AB-8、D-101、HPD100)：去離子水反復(fù)浸洗至無泡沫，選取(Φ30mm×650mm)玻璃層析柱，濕法裝柱，用95％乙醇以0.5mL/min洗脫至流出液加等量去離子水不變渾濁后，去離子水洗脫至無醇味。去離子水浸泡備用。
陰(陽)離子交換樹脂(D152、D113、D061、D301R、D370、D290)：去離子水反復(fù)浸洗至水澄清無褐色，選取(Φ30mm×650mm)玻璃層析柱，濕法裝柱，先用5％NaOH(HCl)溶液以0.5mL/min洗脫8h，再去離子水洗至pH值為6～7，接著用5％HCl(NaOH)溶液以0.5mL/min洗脫8h后去離子水洗至pH值為7左右，去離子水浸泡備用。
分別稱取預(yù)處理好的10種樹脂各2.0g，置于150mL具塞磨口錐形瓶中，依次加入30.0mL，5mg/mL的狀元豆粗多糖，振蕩(25℃，120r/min，6h)，吸附。
(2)用吸光度法測多糖、色素及蛋白質(zhì)含量
取供試樣品液，用蒸餾水定容至2mL，加人體積分?jǐn)?shù)5％苯酚溶液1.0mL和濃硫酸5mL，充分混勻，室溫靜置30min，于490nm波長處測定吸光度。根據(jù)吸光度(X)和葡萄糖質(zhì)量濃度(Y)的回歸方程：C＝0.13339A-0.0007(R2＝0.9996，計算多糖質(zhì)量濃度。
以蒸餾水作參比，對狀元豆多糖提取液和脫色后的溶液進(jìn)行紫外全波長掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無最大吸收波長。于200～600nm波長范圍內(nèi)每隔10nm測定吸光度，計算脫色率平均值，以最接近該平均值的420nm作為測定波長，測定狀元豆多糖脫色前、后的吸光值。
取供試樣品液，用蒸餾水定容至1mL，再加入5.0mL考馬斯亮藍(lán)備用液，靜置15min，蒸餾水作空白對照，于595nm波長處測吸光度，根據(jù)吸光度(Y)和牛血清蛋白質(zhì)量濃度(X)的回歸方程：Y＝0.0082X+0.0306(R2＝0.9953，計算蛋白質(zhì)濃度。
綜合吸附效應(yīng)指數(shù)ζ(0≤ζ≤1)，ζ＝0.3X1(脫色率)+0.3X2(脫蛋白率)+0.4X3(多糖保留率)，即為樹脂的脫色率、蛋白去除率以及多糖保留率的加權(quán)和，其值越大表明樹脂的綜合處理能力越好。
測定各樹脂平衡液吸光度并計算脫色率、蛋白去除率、多糖保留率及ζ值，比較篩選出最佳的樹脂。結(jié)果如表1。
表1 10種樹脂對狀元豆粗多糖吸附性能比較
注：同一列中不同英文字母表示差異顯著(P<0.05)。
(3)D113樹脂單因素試驗
室溫條件下，玻璃層析柱(Φ15mm×500mm)中濕法裝入預(yù)處理好的D113樹脂(10.0g)，取粗多糖上柱，依次考察上樣液質(zhì)量濃度(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0mg/mL)，上樣液pH值(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)，上樣流速(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mL/min)，上樣體積(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0BV)對樹脂脫色脫蛋白效果的影響。部分收集器收集，用步驟(2)方法測定所得狀元豆多糖中的各吸光度。
(4)D113樹脂優(yōu)化試驗
在單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，采用軟件Design-Expert8.0.6中的Box-Behnken設(shè)計試驗，以綜合吸附效應(yīng)指數(shù)ζ為響應(yīng)值，以A上樣液質(zhì)量濃度(3.0、4.0、5.0mg/mL)，B上樣液pH值(4.0、5.0、6.0)，C上樣流速(1.0、1.5、2.0mL/min)和D上樣體積(2.0、3.0、4.0BV)四個因素為自變量，建立多元二次方程：ζ＝+89.93-0.13A+4.93B+2.44C-1.67D+2.60AB+1.39AC-3.43AD-0.70BC+0.19BD-2.60CD-9.04A2-5.40B2-5.47C2-10.75D2。
(5)D113樹脂再生條件試驗
向三角瓶中加入已吸附飽和的D113樹脂各5g，依次加入1mol/L NaOH和HCl、乙醇(10％、20％、30％、40％、50％)和乙醇(10％、20％、30％、40％、50％)配制的1mol/L HCl各50mL。恒溫振蕩(25℃，120r/min，12h)，洗脫，取樣，用步驟(2)方法測定溶液在420nm和595nm處的吸光度值。結(jié)果如圖1。
本發(fā)明所產(chǎn)生的有益效果：目前大多關(guān)于樹脂對多糖脫色脫蛋白效果的研究，主要從樹脂種類、上樣質(zhì)量濃度、上樣及洗脫流速等單因素方面研究分析試驗條件對脫色脫蛋白的效果，未考慮各單因素的相互作用；或結(jié)合傳統(tǒng)正交設(shè)計，但因其是一種線性數(shù)學(xué)模型只能分析離散型數(shù)據(jù)，這些都對多糖脫色脫蛋白效果有較大的局限性。而響應(yīng)面法(RSM)采用非線性模型擬合響應(yīng)值與各因素之間的函數(shù)關(guān)系，能求得高精度的多元二次回歸方程，并通過合理預(yù)測分析來尋求最佳純化工藝參數(shù)。本發(fā)明優(yōu)化的工藝可在69.6-74.4min(平均為72.5min)內(nèi)處理質(zhì)量濃度為4.0～4.5mg/mL(平均為4.1mg/mL)的狀元豆多糖溶液2.7～3.2BV(1BV≈50mL，平均為145mL)，蛋白去除率、脫色率和多糖保留率分別達(dá)89.37～91.11％[平均為(90.24±0.87)％]、85.51～87.69％[平均為(86.60±1.09)％]]和93.82～95.22％[平均為(94.07±1.15)％]；相比采用D113樹脂對蟲草粗多糖動態(tài)吸附處理，即120min(3BV/1.5BV﹒h-1)處理質(zhì)量濃度為2.8mg/mL的蟲草多糖溶液75mL(1BV為25mL)，其脫蛋白率為(85.0±2.0)％，脫色率為(85.1±1.9)％和多糖保留率為(80.2±2.2)％，本發(fā)明優(yōu)化的工藝處理容量更大(約1.83倍)，操作更省時(約0.4倍)，并且蛋白去除率、脫色率和多糖保留率分別提高了6.17％、1.76％和14.74％。因此本發(fā)明方法也將為對其他植物類多糖脫色脫蛋白提供一定的參考。