本發(fā)明涉及一種s-誘抗素的制備方法。
背景技術(shù)：
：s-誘抗素(天然脫落酸)，與生長素、乙烯、赤霉素、細(xì)胞分裂素并列為植物五大類天然生長調(diào)節(jié)劑，是植物體的“抗逆誘導(dǎo)因子”，能夠啟動植物的抗逆基因，誘導(dǎo)激活植物體內(nèi)的抗逆免疫系統(tǒng)，提高植物自身對寒冷、干旱、病蟲害、鹽堿的抗性，通過施用s-誘抗素，可減少化學(xué)農(nóng)藥的使用量，在提高農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)等許多方面有著重要的生理活性作用和應(yīng)用價值。目前，s-誘抗素的制備方法主要有直接提取法、化學(xué)合成法、生物發(fā)酵法三種。直接提取法是指從植物中直接提取，但由于其植物體中含量較低，該生產(chǎn)方法產(chǎn)量較低，規(guī)模較?。换瘜W(xué)合成法制備s-誘抗素，其合成的純度較低，因為化學(xué)合成的方式得到的產(chǎn)物是非天然脫落酸和天然脫落酸(s-誘抗素)，只有天然脫落酸(s-誘抗素)具有以上的生理活性，化學(xué)合成法生產(chǎn)成本極高，所以目前只有日本、美國等發(fā)達(dá)國家應(yīng)用于大規(guī)模農(nóng)業(yè)生產(chǎn)；生物發(fā)酵法制備的s-誘抗素產(chǎn)量高，不會有非天然脫落酸產(chǎn)生，是目前綜合較好的s-誘抗素制備方法，然而該方法仍存在一些技術(shù)上的問題，例如，現(xiàn)有的發(fā)酵過程周期較長，產(chǎn)出的s-誘抗素含量還有待提高，發(fā)酵產(chǎn)生的副產(chǎn)物較多，對提取造成了一定的困難，且提取的過程參數(shù)不易控制造成大量s-誘抗素的浪費，另外也因為工藝的缺陷和過程參數(shù)的控制不易造成最終的s-誘抗素產(chǎn)品純度不高，只有不到95％，產(chǎn)品質(zhì)量無法得到提升。技術(shù)實現(xiàn)要素：有鑒于此，本申請?zhí)峁┮环Ns-誘抗素的制備方法，能夠縮短發(fā)酵周期，提高發(fā)酵產(chǎn)生s-誘抗素的含量，通過提取精制處理，避免s-誘抗素的浪費，同時提高s-誘抗素的純度，使最終產(chǎn)品中s-誘抗素的純度達(dá)到95％以上，提升了產(chǎn)品質(zhì)量。此外，制備工藝條件溫和，制備過程環(huán)保，有利于s-誘抗素的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是一種s-誘抗素的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：(1)采用能夠發(fā)酵產(chǎn)生s-誘抗素的菌種經(jīng)過種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)得到含有s-誘抗素的發(fā)酵液；(2)將步驟(1)所述含有s-誘抗素的發(fā)酵液經(jīng)板框過濾、膜過濾、酸析、萃取得到萃取液；(3)將步驟(2)所述萃取液經(jīng)過濃縮結(jié)晶、重結(jié)晶、干燥得到純度為95％以上的s-誘抗素成品。優(yōu)選的，步驟(1)所述能夠發(fā)酵產(chǎn)生s-誘抗素的菌種包括為灰葡萄孢霉菌。優(yōu)選的，步驟(1)中所述發(fā)酵培養(yǎng)具體為：維持發(fā)酵培養(yǎng)基的ph值在4-7，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。優(yōu)選的，步驟(1)所述發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基組分包括大豆蛋白、乳糖、葡萄糖、麥芽糖、飴糖、蔗糖、麥芽糊精、淀粉、玉米蛋白、棉籽餅粉、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、一水硫酸錳、七水硫酸亞鐵、七水硫酸鋅、硫酸銨、色拉油中的至少一種。其中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為20-35℃，發(fā)酵培養(yǎng)的時間為12-25d。更為優(yōu)選的，所述維持發(fā)酵培養(yǎng)基的ph值在4-7具體為：發(fā)酵培養(yǎng)基的ph值低于4時連續(xù)補(bǔ)充液態(tài)堿；ph值高于7時連續(xù)補(bǔ)充發(fā)酵培養(yǎng)基料液。優(yōu)選的，步驟(2)所述板框過濾前，向所述含有s-誘抗素的發(fā)酵液中加入固體naoh調(diào)節(jié)ph值至4-7，所述板框過濾中，控制壓力0.05-0.5mpa。優(yōu)選的，步驟(2)所述膜過濾包括微濾、超濾和納濾工序。更為優(yōu)選的，步驟(2)所述微濾工序具體為：在壓力為0.05-0.6mpa，過濾溫度不大于60℃的條件下進(jìn)行微濾。更為優(yōu)選的，步驟(2)所述超濾工序具體為：在壓力為0.05-1.0mpa，過濾溫度不大于60℃的條件下進(jìn)行超濾。更為優(yōu)選的，步驟(2)所述納濾工序包括一級納濾和二級納濾，所述一級納濾具體為：在壓力為0.1-2.0mpa，過濾溫度不大于60℃的條件下進(jìn)行一級納濾；所述二級納濾具體為：在壓力為0.5-10.0mpa，過濾溫度不大于60℃的條件下進(jìn)行二級納濾。優(yōu)選的，步驟(2)所述萃取中，采用的萃取劑為至少一種選自石油醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、正戊醇、乙醇、丙酮、甲醇，萃取體系的ph值為1-4。優(yōu)選的，步驟(3)所述濃縮結(jié)晶、重結(jié)晶、干燥的溫度為40-80℃。所述s-誘抗素的純度為以質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計的純度。本申請技術(shù)方案提供了一種s-誘抗素的制備方法，具體是一種發(fā)酵法生產(chǎn)重量百分?jǐn)?shù)為95％以上的s-誘抗素的制備方法，采用發(fā)酵法生產(chǎn)s-誘抗素，其產(chǎn)量較高，通過從發(fā)酵液中提取精制，得到的s-誘抗素產(chǎn)品具有95％以上的純度。在上述的本申請技術(shù)方案中，步驟(1)中，采用能夠發(fā)酵產(chǎn)生s-誘抗素的菌種經(jīng)過種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)得到含有s-誘抗素的發(fā)酵液，其中能夠發(fā)酵產(chǎn)生s-誘抗素的菌種選自，發(fā)酵培養(yǎng)基中，以葡萄糖、乳糖、麥芽糖、飴糖、蔗糖、麥芽糊精、淀粉、大豆蛋白、玉米蛋白、棉籽餅粉中的至少一種作為碳源和氮源，以硫酸銨作為氮源，提高了有益元素的比例，促進(jìn)菌種發(fā)酵，促進(jìn)s-誘抗素的快速生成；含有的天然油脂色拉油作為碳源，同時使培養(yǎng)基料液黏稠，具有消泡作用，且防止發(fā)酵培養(yǎng)過程中受到污染；添加了促進(jìn)菌種快速繁殖的微量元素錳，以一水硫酸錳的形式進(jìn)行添加；還添加了七水硫酸鎂、七水硫酸亞鐵、七水硫酸鋅，增加發(fā)酵培養(yǎng)中促進(jìn)菌種發(fā)酵過程的鎂元素、鐵元素、鋅元素，促進(jìn)s-誘抗素的生成。此外，在發(fā)酵培養(yǎng)基中ph值低于4時連續(xù)補(bǔ)充補(bǔ)充液態(tài)堿；ph值高于7時連續(xù)補(bǔ)充發(fā)酵培養(yǎng)基料液，使所述發(fā)酵培養(yǎng)基的ph值維持在4-7。通過流加液態(tài)堿和發(fā)酵培養(yǎng)基料液的方式，對發(fā)酵培養(yǎng)基的ph值進(jìn)行微調(diào)，既不會改變發(fā)酵培養(yǎng)基的成分，也不會對菌種的發(fā)酵造成干擾。通過適宜產(chǎn)s-誘抗素菌種的培養(yǎng)基設(shè)置，以及培養(yǎng)條件的結(jié)合，能夠明顯縮短發(fā)酵周期(從29天縮短至18天)，同時提高發(fā)酵液中s-誘抗素的含量(從3000ppm提高到8000ppm)。步驟(2)中，將含有s-誘抗素的發(fā)酵液經(jīng)板框過濾、膜過濾、酸析、萃取得到萃取液。其中在板框過濾之前，先加入固體naoh調(diào)節(jié)ph值至4-7，起到助濾作用；此外，通過膜過濾對板框過濾后的濾液進(jìn)一步過濾，該膜過濾包括有依次設(shè)置的微濾、超濾和納濾，在微濾過程中，板框過濾后的濾液中的懸浮顆粒、菌種以及其他大顆粒雜質(zhì)被濾除；在超濾過程中，微濾后的濾液中的大分子蛋白質(zhì)、葡萄糖等被濾除；在納濾過程中，對超濾后的濾液進(jìn)一步過濾，濾除部分小分子，得到較為純凈的s-誘抗素溶液?？刂莆V、超濾以及納濾過程中的壓力，可以提高過濾的效率，同時避免濾液的浪費。經(jīng)過膜過濾后的溶液通過萃取進(jìn)行進(jìn)一步分離，采用石油醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、正戊醇、乙醇、丙酮、甲醇中的至少一種作為萃取劑，控制萃取的體系為ph值為1-4的酸性環(huán)境，實現(xiàn)s-誘抗素與油類、酯類物質(zhì)的分離。通過以上的過濾和萃取工序，提高溶液中s-誘抗素的含量。步驟(3)中，萃取液經(jīng)過濃縮結(jié)晶、重結(jié)晶、干燥可以得到重量百分比為95％以上的s-誘抗素成品。在濃縮結(jié)晶、重結(jié)晶過程中，得到s-誘抗素結(jié)晶體，使其與萃取液中的可溶無機(jī)鹽類分離，提高了其純度，控制濃縮結(jié)晶、重結(jié)晶、干燥的溫度在40-80℃之間，可以加快濃縮結(jié)晶、重結(jié)晶、干燥的速度，同時避免對s-誘抗素的結(jié)構(gòu)造成破壞，影響其生理活性。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本申請技術(shù)方案所述的一種s-誘抗素的制備方法，能夠縮短發(fā)酵周期，提高發(fā)酵產(chǎn)生s-誘抗素的含量，通過提取精制處理，能夠進(jìn)一步提高s-誘抗素的純度，使最終產(chǎn)品中s-誘抗素的純度達(dá)到95％以上。此外，制備工藝條件溫和，制備過程環(huán)保，有利于s-誘抗素的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。具體實施方式為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。本申請所述的一種s-誘抗素的制備方法，具體是采用發(fā)酵法生產(chǎn)純度為95％以上的制備方法，包括有以下步驟：(1)采用能夠發(fā)酵產(chǎn)生s-誘抗素的菌種經(jīng)過種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)得到含有s-誘抗素的發(fā)酵液；其中，能夠發(fā)酵產(chǎn)生s-誘抗素的菌種包括有灰葡萄孢霉菌，發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基組分包括：大豆蛋白、乳糖、葡萄糖、麥芽糖、飴糖、蔗糖、麥芽糊精、淀粉、玉米蛋白、棉籽餅粉、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、一水硫酸錳、七水硫酸亞鐵、七水硫酸鋅、硫酸銨、色拉油；所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為20-35℃，發(fā)酵培養(yǎng)的時間為12-25d。在發(fā)酵培養(yǎng)時，發(fā)酵培養(yǎng)基中ph值低于4時連續(xù)補(bǔ)充液態(tài)堿；ph值高于7時連續(xù)補(bǔ)充發(fā)酵培養(yǎng)基料液，使所述發(fā)酵培養(yǎng)基的ph值維持在4-7，其中液態(tài)氮源可以為氨水。(2)將步驟(1)所述含有s-誘抗素的發(fā)酵液經(jīng)板框過濾、膜過濾、酸析、萃取得到萃取液，其中，板框過濾前，向所述含有s-誘抗素的發(fā)酵液中加入固體naoh調(diào)節(jié)ph值至4-7，所述板框過濾中，控制壓力0.05-0.5mpa；膜過濾包括有依次設(shè)置的微濾、超濾和納濾工序，在微濾工序中，壓力為0.05-0.6mpa，過濾溫度不大于60℃；在超濾工序中，壓力為0.05-1.0mpa，過濾溫度不大于60℃；納濾工序包括一級納濾和二級納濾，所述一級納濾中，壓力為0.1-2.0mpa，過濾溫度不大于60℃；所述二級納濾中，壓力為0.5-10.0mpa，過濾溫度不大于60℃。在萃取過程中，萃取劑為至少一種選自石油醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、正戊醇、乙醇、丙酮、甲醇，萃取體系的ph值為1-4。(3)將步驟(2)所述萃取液經(jīng)過40-80℃溫度下的濃縮結(jié)晶、重結(jié)晶、干燥得到所述s-誘抗素成品。為了驗證本申請技術(shù)方案的技術(shù)效果，在上述具體實施方式要求的基礎(chǔ)上，采用具體參數(shù)進(jìn)行試驗驗證，得到以下具體實施例。實施例1菌種種類對發(fā)酵周期及s-誘抗素產(chǎn)量的影響采用單因素實驗方法，在其他條件均一致的情況下，選擇不同種類菌種，采用前述培養(yǎng)方式，進(jìn)行種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)，結(jié)果見表1。表1菌種種類對發(fā)酵周期及s-誘抗素產(chǎn)量的影響結(jié)果注:lm-001～lm-007是灰葡萄孢霉菌誘變之后的不同菌株。實施例2發(fā)酵培養(yǎng)基對發(fā)酵周期及s-誘抗素產(chǎn)量的影響采用單因素實驗方法，在其他條件均一致的情況下，采用不同組分發(fā)酵培養(yǎng)基，采用前述培養(yǎng)方式進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，結(jié)果見表2。表2發(fā)酵培養(yǎng)基對發(fā)酵周期及s-誘抗素產(chǎn)量的影響結(jié)果實施例3發(fā)酵培養(yǎng)基ph值調(diào)節(jié)方式對發(fā)酵周期及s-誘抗素產(chǎn)量的影響采用單因素實驗方法，在其他條件均一致的情況下，采用不同發(fā)酵培養(yǎng)基ph值調(diào)節(jié)方式，采用前述培養(yǎng)方式進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，結(jié)果見表3。表3發(fā)酵培養(yǎng)基ph值調(diào)節(jié)方式對發(fā)酵周期及s-誘抗素產(chǎn)量的影響實驗1實驗2實驗3實驗4ph值低于4加入液態(tài)堿碳酸鈣氫氧化鉀氫氧化鈉ph值高于7加入發(fā)酵培養(yǎng)基料液檸檬酸醋酸糖加入方式連續(xù)流加連續(xù)流加連續(xù)流加連續(xù)流加發(fā)酵周期(天)20161423s-誘抗素含量(ppm)8680502354106743實施例4發(fā)酵培養(yǎng)基ph值對發(fā)酵周期及s-誘抗素產(chǎn)量的影響采用單因素實驗方法，在其他條件均一致的情況下，采用不同發(fā)酵培養(yǎng)基ph值，采用前述培養(yǎng)方式進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，結(jié)果見表4。表4發(fā)酵培養(yǎng)基ph值對發(fā)酵周期及s-誘抗素產(chǎn)量的影響實施例5發(fā)酵液ph值對板框過濾效果的影響采用單因素實驗方法，在其他條件均一致的情況下，在板框過濾前，采用不同的發(fā)酵液ph值，采用前述的過濾參數(shù)進(jìn)行過濾，結(jié)果見表5。表5發(fā)酵液ph值對板框過濾效果的影響備注：本次實驗發(fā)酵液重量為50l，含量為8000ppm。實施例6板框過濾參數(shù)對板框過濾效果的影響采用單因素實驗方法，在其他條件均一致的情況下，采用不同的板框過濾參數(shù)進(jìn)行過濾，結(jié)果見表6。表6板框過濾參數(shù)對板框過濾效果的影響實驗1實驗2實驗3實驗4實驗5壓力(mpa)0.050.150.250.350.5過濾時間(min)151312.51110過濾效率(l/min)3.333.8544.555濾液中s-誘抗素含量(ppm)60326120621662506340濾渣中s-誘抗素(ppm)600580570560555備注：本次實驗發(fā)酵液重量為50l，含量為8000ppm。實施例7膜過濾參數(shù)對膜過濾效果的影響采用單因素實驗方法，在其他條件均一致的情況下，采用不同的膜過濾參數(shù)進(jìn)行過濾，結(jié)果見表7。表7膜過濾參數(shù)對膜過濾效果的影響備注：本次實驗所用板框濾液、微濾清液、超濾清液、一級納濾殘液重量分別為100l、90l、80l、70l。實施例8萃取劑組分對萃取效果的影響采用單因素實驗方法，在其他條件均一致的情況下，采用不同的萃取劑成分對濾液進(jìn)行萃取，結(jié)果見表8。表8萃取劑組分對萃取效果的影響備注：本實驗所用濃縮液含量為20000ppm。實施例9萃取體系ph值對萃取效果的影響采用單因素實驗方法，在其他條件均一致的情況下，采用不同的萃取體系ph值對濾液進(jìn)行萃取，結(jié)果見表9。表9萃取體系ph值對萃取效果的影響備注：本實驗所用濃縮液含量為20000ppm。實施例10濃縮結(jié)晶、重結(jié)晶、干燥溫度對s-誘抗素純度的影響采用單因素實驗方法，在其他條件均一致的情況下，采用不同的濃縮結(jié)晶、重結(jié)晶、干燥溫度，結(jié)果見表10。表10濃縮結(jié)晶、重結(jié)晶、干燥溫度對s-誘抗素純度的影響結(jié)果以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出的是，上述優(yōu)選實施方式不應(yīng)視為對本發(fā)明的限制，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)當(dāng)以權(quán)利要求所限定的范圍為準(zhǔn)。對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁12