糖基化重復基序分子綴合物的制作方法
本申請是申請人于2010年11月4日提交的題為“糖基化重復基序分子綴合物”的中國專利申請201080050066.1的分案申請。
本文報道了gemoc(糖基化重復基序分子綴合物)，其是重組生產的并包括體內糖基化，即來自表達emoc(重復基序分子綴合物)的細胞類型的糖基化，以及生產這類聚合物的方法和這類聚合物的用途。
發(fā)明背景
已開發(fā)了不同的重復基序分子作為經典抗原結合分子(例如免疫球蛋白)的備選物提供。
示例性的重復基序分子是設計的錨蛋白重復蛋白(darpins)。darpins可以以功能性形式在大腸桿菌菌株的細胞質中表達。darpins的重復基序包括33個殘基的氨基酸序列。重復包括β轉角基序和其后的一對反向平行α-螺旋和導致下一個重復折返的環(huán)。錨蛋白重復基序分子中一般存在1至30個以上的重復基序，最常見是4至6個。
kohl等人(kohl,a.等人，proc.natl.acad.sci.usa100(2003)1700-1705)基于對約2000個天然存在的錨蛋白重復序列的比對開發(fā)了人工的錨蛋白重復模塊。該人工的共同錨蛋白重復序列包括27個固定的氨基酸殘基和6個可變的氨基酸殘基，形成(一部分的)結合位點(forrer,p.等人，chembiochem5(2004)183-189)。
為了獲得darpins與預定靶分子的結合，將人工的共同錨蛋白重復序列的可變氨基酸殘基隨機化，通過核糖體展示鑒別特定的結合子(參見例如，wo02/020565；hanes,proc.natl.acad.sci.usa94(1997)4937-4942)。
在us2009/0148905中報道了抗原結合構建體。wo2008/135237中報道了補體因子h衍生的短共同重復抗體構建體。wo2007/122511中報道了抗體-rna酶-綴合物。us2008/0206201中報道了包含重組核酸的新城病病毒，當通過感染病毒的腫瘤細胞表達時，核酸編碼的結合蛋白具有治療活性。在us2008/0248026中，報道了pten/akt方法和涉及bmp的組合物。wo2005/076902和us2008/0103098中報道了以二硫鍵橋接的雙鏈形式重組表達的蛋白質。wo2009/068649中報道了抗原結合構建體。
發(fā)明概述
本文報道了糖基化形式的重復基序分子綴合物，即，在哺乳動物細胞中表達的。
因此，本文報道的第一個方面是下列通式的糖基化重復基序分子綴合物：
(重復基序分子-接頭n)m-(綴合部分)q-(接頭o-重復基序分子)p
其中n和o是彼此獨立的0或1的整數(shù)值，并且獨立于m和p和q的各個值，且m和p是彼此獨立的整數(shù)值0或1或2或3或4或5或6或7，且q是0或1的整數(shù)值，獨立于n、m、o和p，
其中重復基序分子綴合物包括至少一個與糖基化位點連接的寡糖，
且其中至少m＝q＝1或p＝q＝1。
在一個實施方案中，重復基序分子是錨蛋白-重復基序分子或富含亮氨酸的重復基序分子。在其他實施方案中，錨蛋白-重復基序分子具有seqidno:4或其變體的氨基酸序列。在另一個實施方案中，接頭是選自seqidno:14和seqidno:25至seqidno:33的肽接頭。在一個實施方案中，綴合部分(partner)是多聚的綴合部分。在仍然其他的實施方案中，多聚的綴合部分選自天然的或改造的成對重鏈ch2和ch3結構域、選自天然的或改造的成對重鏈ch1結構域和輕鏈恒定結構域、選自天然的或改造的重鏈鉸鏈區(qū)，選自重鏈鉸鏈區(qū)和ch2和ch3結構域的天然的或改造的序列、選自亮氨酸拉鏈結構域、選自異亮氨酸拉鏈結構域、選自4-螺旋束和選自p53四聚結構域，或選自其組合。
在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的綴合物的特征是具有通式：
((重復基序分子-接頭n)m-(綴合部分)q-(接頭o-重復基序分子)p)r
其中
i)n＝1、m＝1、q＝1、p＝0、r＝1，或
ii)n＝1、m＝1、q＝1、p＝0、r＝2，或
iii)n＝0、m＝1、q＝1、p＝0、r＝1，或
iv)n＝0、m＝1、q＝1、p＝0、r＝2，或
v)m＝0、o＝1、q＝1、p＝1、r＝1，或
vi)m＝0、o＝1、q＝1、p＝1、r＝2，或
vii)m＝0、o＝0、q＝1、p＝1、r＝1，或
viii)m＝0、o＝0、q＝1、p＝1、r＝2，或
ix)m＝1、n＝0、o＝1、q＝1、p＝1、r＝1，或
x)m＝1、n＝0、o＝1、q＝1、p＝1、r＝2，或
xi)m＝1、n＝1、o＝1、q＝1、p＝1、r＝1，或
xii)m＝1、n＝1、o＝1、q＝1、p＝1、r＝1，
其中，綴合部分選自天然的或改造的成對重鏈ch2和ch3結構域、天然的或改造的成對重鏈ch1結構域和輕鏈恒定結構域，天然的或改造的重鏈鉸鏈區(qū)，重鏈鉸鏈區(qū)和ch2和ch3結構域的天然的或改造的序列，
且其中重復基序分子是錨蛋白-重復基序分子。
在其他實施方案中，綴合物的特征是至少一個寡糖是通過在cho細胞或hek293細胞中表達綴合物而獲得的寡糖的混合物。
在一個實施方案中，綴合物的特征是
m＝0、q＝1、p＝1和o＝0或o＝1，和r＝1或2，
其中綴合部分選自seqidno:50或51或52的n端和seqidno:43或44的c端的綴合物，或者seqidno:53或54或55的n端和seqidno:45或46的c端的綴合物，且
其中重復基序分子是錨蛋白-重復基序分子。
本文報道的另一個方面是糖基化重復基序分子綴合物，其特征是包括兩個本文報道的糖基化重復基序分子綴合物。
在另一個實施方案中，糖基化重復基序分子綴合物包括兩個根據(jù)任一項前述實施方案的糖基化重復基序分子綴合物。
在其他實施方案中，糖基化重復基序分子綴合物還包含
a)如果重復基序分子的綴合部分選自seqidno:50、51和52，則包括seqidno:53或54或55的n端和seqidno:45或46的c端的兩個綴合物，或者
b)如果重復基序分子的綴合部分選自seqidno:53、54和55，則包括seqidno:50或51或52的n端和seqidno:43或44的c端的兩個綴合物。
本文報道的其他方面是包括下列元件的核酸：
-來自人細胞巨細胞病毒的立即早期增強子和啟動子，
-抗體種系基因的5’非翻譯區(qū)，
-免疫球蛋白重鏈信號序列，
-重復基序分子綴合物的編碼序列，
-多聚腺苷酸(polya)信號序列。
本文報道的另一個方面是用于生產本文報道的糖基化重復基序分子綴合物的方法，包括
-在適合表達重復基序分子的條件下，培養(yǎng)包含本文報道的核酸的哺乳動物細胞，
-從細胞或培養(yǎng)基中回收糖基化重復基序分子，從而生產糖基化重復基序分子，
-任選的純化所回收的糖基化重復基序分子。
在一個實施方案中，哺乳動物細胞選自cho細胞和hek293細胞。
在一個實施方案中，多聚的綴合部分是含三個半胱氨酸殘基的改造的重鏈鉸鏈區(qū)。在另一個實施方案中，綴合部分包括改造的抗體重鏈鉸鏈區(qū)、ch2結構域和ch3結構域。在其他實施方案中，重復基序分子是anticalin。在仍然另一個實施方案中，重復基序分子與綴合部分的n端綴合。
發(fā)明詳述
本文報道了下列通式的糖基化重復基序分子綴合物(gemoc)：
(重復基序分子-接頭n)m-(綴合部分)q-(接頭o-重復基序分子)p
其中n和o是彼此獨立的0或1的整數(shù)值，并且獨立于m和p的各個值，而m和p是彼此獨立的0或1或2或3或4或5或6或7的整數(shù)值，q是獨立的0或1，
其中綴合部分包括至少一個糖基化位點，而gemoc是在哺乳動物細胞在表達的。
術語“糖基化”或其語法等價體表示相應的重復基序分子包括與重復基序分子的氨基酸骨架中的氨基酸共價連接的糖殘基。在一個實施方案中，重復基序分子包括至少一個n-糖基化或o-糖基化位點基序，是天然存在的或改造的基序(參見seqidno:56和58)。在一個實施方案中，n-糖基化位點基序選自asp-x-thr、asp-x-ser或asp-x-cys，其中x可以是脯氨酸(pro、p)以外的任何氨基酸殘基。在另一個實施方案中，向重復基序分子添加糖基化標簽(參見例如，seqidno:60、61、62和63；還參見meder、d.等人，j.cellbiol.168(2005)303-313；bulbarelli,a.等人，j.cellsci.,115(2002)1689-1702)。因而，在一個實施方案中，綴合物包括seqidno:62或63的分子作為重復基序分子。使用這些糖基化標簽，可以獲得包括良好糖基化的重復基序分子。
術語“哺乳動物細胞”表示選自cho細胞、bhk細胞、hek細胞、cos細胞、per.
術語“氨基酸”在本申請中用于表示羧基α-氨基酸，可以被核酸直接編碼或以前體的形式被編碼。單個氨基酸由三個核苷酸組成的核酸編碼，即所謂的密碼子或堿基三聯(lián)體。每個氨基酸由至少一個密碼子編碼。這被稱為“遺傳密碼的簡并性”。術語“氨基酸”在本申請中用于表示天然存在的羧基α-氨基酸，包括丙氨酸(三字母密碼：ala，一字母密碼：a)、精氨酸(arg，r)、天冬酰胺(asn，n)、天冬氨酸(asp，d)、半胱氨酸(cys，c)、谷氨酰胺(gln，q)、谷氨酸(glu，e)、甘氨酸(gly，g)、組氨酸(his，h)、異亮氨酸(ile，i)、亮氨酸(leu，l)、賴氨酸(lys，k)、甲硫氨酸(met，m)、苯丙氨酸(phe，f)、脯氨酸(pro，p)、絲氨酸(ser，s)、蘇氨酸(thr，t)、色氨酸(trp，w)、酪氨酸(tyr，y)、纈氨酸(val，v)。
術語“抗體”指由一個或多個基本由抗體基因編碼的多肽組成的分子?？贵w一般包括兩條所謂的輕鏈多肽(輕鏈)和兩條所謂的重鏈多肽(重鏈)。每條重鏈和輕鏈多肽都含有可變結構域(可變區(qū))(一般是多肽鏈的氨基端部分)，可變結構域包括能夠與抗原相互作用的結合區(qū)。每條重鏈和輕鏈多肽都包括恒定區(qū)(一般是羧基端部分)。重鏈的恒定區(qū)介導抗體與下述結合：i)具有fcγ受體(fcγr)的細胞，例如巨噬細胞，或ii)具有新生兒fc受體(fcrn)的細胞，也稱為brambell受體。還介導與一些因子的結合，包括經典補體系統(tǒng)的因子，例如補體(c1q)?？贵w的輕鏈或重鏈的可變結構域依次包括不同的片段，即，四個框架區(qū)(fr)和三個超變區(qū)(cdr)。
術語“鉸鏈區(qū)”在一個實施方案中表示人的全長抗體重鏈的從殘基216(通常是谷氨酸殘基)至殘基226(通常是半胱氨酸殘基)，或至殘基230(通常是脯氨酸殘基)的片段。鉸鏈區(qū)包括可以與第二個鉸鏈區(qū)相應半胱氨酸殘基形成二硫鍵的半胱氨酸殘基，例如與第二抗體重鏈。在一個實施方案中，鉸鏈區(qū)包括兩個半胱氨酸殘基。
術語“第二重鏈恒定結構域”和“ch2結構域”和“ch2”可互換的使用，在一個實施方案中表示人的全長抗體重鏈的從殘基213至殘基340的片段。ch2結構域包括殘基297，其通常是氨基酸天冬酰胺，在此糖與氨基酸骨架共價連接。
術語“第三重鏈恒定結構域”和“ch3結構域”和“ch3”可互換的使用，在一個實施方案中表示人的全長抗體重鏈的從殘基341至殘基447的片段，即在ch2結構域的c端。
術語“抗體依賴性細胞介導的細胞毒性”和“adcc”可互換的使用，在本申請中表示通過細胞表面具有fc受體(fcr)的非特異性的細胞毒性細胞作用的細胞裂解機制，例如天然殺傷細胞(nk細胞)、嗜中性粒細胞和巨噬細胞。這些細胞識別和裂解含表面結合具有fc受體結合部分(例如fc部分)的抗體的細胞。
術語“補體依賴性細胞毒性”和“cdc”可互換的使用，在本申請中表示通過補體作用的細胞裂解機制，由c1q與例如結合抗原的抗體相結合而引發(fā)。
術語“結合靶分子”表示結合分子(即，提供互補性的)及其結合配偶體(即，特異性的靶分子)之間的特異性相互作用。該特異性相互作用的強度表示為結合親和力，以kd值給出。術語“不特異性的結合靶分子”表示在結合分子及其靶分子之間的非特異性相互作用，具有10-5mol/l或更高的kd值(例如，10-3mol/l)，在一個實施方案中，具有10-6mol/l或更高的kd值。結合親和力是用標準的結合測定來確定的，例如表面等離子體共振技術
在一個實施方案中，重復基序分子的重復是長度從20至40個氨基酸殘基。重復排列在單個結構單元中，共同形成重復基序分子。在一個實施方案中，重復基序分子選自錨蛋白-重復基序分子和富含亮氨酸的重復基序分子(lrrp)。
在一個實施方案中，綴合部分包括免疫球蛋白膜錨定結構域或gpi錨定結構域。
術語“重復基序分子”表示可作為單個分子(即，未與第二個分子或與自身的第二份拷貝綴合的)表達的天然存在的或人工的多肽，以可溶形式存在于大腸桿菌的細胞質或周質中。在一個實施方案中，重復基序分子包括至少兩個結構相同的單元(重復)。這些單元的氨基酸序列不需要相同。這些單元可以是但不必須是獨立折疊的結構域。除重復單元外，重復基序分子可以但不必包括其他序列片段。在一個實施方案中，重復基序分子是錨蛋白重復基序分子。在另一個實施方案中，重復基序分子是富含亮氨酸的重復基序分子。
術語“錨蛋白重復基序分子”表示包括1至30個共同的33個殘基的氨基酸序列的人工多肽。每個重復包括β轉角基序，后接成對的反向平行的α螺旋，以及導致折回下一個重復的環(huán)。在一個實施方案中，錨蛋白重復基序分子包括1至30個重復，在另一個實施方案中是2至10個重復，在另一實施方案中，是3至6個重復。
在一個實施方案中，錨蛋白重復基序分子通過隨機誘變和針對靶分子結合進行選擇(例如，通過核糖體展示、酵母展示或噬菌體展示)而源自下列共同序列之一：
dgnt(p，a)lhla(a，v)eng(h，n)le(i，v)vkll(l，i)eaga(d，n)ina
(seqidno：01)，
dsdgntplhlaaengqlevvkllleagadvnar(seqidno：02)，
(d，t)kngltplh(l，i)aaqeghlevvklllenga(d，n)(v，i)nak
(seqidno：03)，
dxxgxtplhlaaxxghleivevllk(h，n，y)gadvnax
(seqidno：04)，
advnakdkdgytplhlaareghleivevllkag(seqidno：05)，
dxxgxtplhlaaxxgpxpavpxllpxgadvnax(seqidno：06)，
dxxgxtplhlaxxxgxxxvvxlllxxgadvnax(seqidno：07)，
dxxgxtplhlaxxxgxxxivxvllxxgadvnax(seqidno：08)，
d11g1tplhlaa11ghleivevllk2gadvna1(seqidno：09)，
“x”表示完全可變的位置，
括號內給出的氨基酸表示可能在該位置的具體變體，
“a”表示具有非極性側鏈的氨基酸，
“p”表示具有極性側鏈的氨基酸殘基，
“1”表示選自(按一字母代碼)氨基酸殘基a、d、e、f、h、i、k、l、m、n、q、r、s、t、v、w和y的氨基酸殘基，以及
“2”表示選自氨基酸殘基h、n和y的氨基酸殘基。
可以通過篩選包含隨機化gemoc或隨機化錨蛋白重復基序分子的文庫(例如，通過核糖體展示)獲得包含與任何預定的靶分子結合的錨蛋白重復基序分子的gemoc(參見例如，wo02/120565；hanes,j.andplückthun,a.,proc.natl.acad.sci.usa94(1997)4937-4942)。
在一個實施方案中，gemoc包括氨基酸序列dlgkklleaaragqddevrilmangadv(seqidno:47)的n端加帽重復。
在一個實施方案中，gemoc包括氨基酸序列vnaqdkfgktafdisidngnedlaeilq(seqidno:48)的c端加帽重復。
在另一個實施方案中，重復基序分子是富含亮氨酸的重復基序分子(lrr)。用于制備富含亮氨酸的重復基序分子的方法報道在wo2006/083275中。
一般而言，抗體具有選自中和活性、針對毒性部分的靶向活性或效應子功能的活性。
在圖1中，顯示了抗體的結構域構造。全長抗體包括兩條所謂的輕鏈和兩條所謂的重鏈。每條輕鏈依次包括輕鏈可變結構域和輕鏈恒定結構域。輕鏈恒定結構域選自κ型結構域或λ型結構域。每條重鏈依次包括重鏈可變結構域、第一重鏈恒定結構域(ch1)、鉸鏈區(qū)、第二重鏈恒定結構域(ch2)、第三重鏈恒定結構域(ch3)，和任選的第四重鏈恒定結構域(ch4)。此外，全長抗體還包括在輕鏈恒定結構域和第一重鏈恒定結構域之間的二硫鍵，以及在兩條重鏈的第二重鏈恒定結構域之間的兩個二硫鍵。
在一個實施方案中，gemoc的綴合部分是全長抗體重鏈或全長抗體輕鏈，但都不含可變結構域。在一個實施方案中，gemoc的綴合部分是每個含可變結構域的抗體重鏈或抗體輕鏈。在另一個實施方案中，重復基序分子與各個抗體鏈的c端直接綴合或通過肽接頭綴合。在一個實施方案中，gemoc包括之前的實施方案中的兩個gemoc。
在一個實施方案中，綴合部分是抗aβ抗體的抗體輕鏈或重鏈。此類抗aβ抗體和相應的核酸序列報道在例如wo2003/070760或us2005/0169925中，或在seqidno:50至55或其變體中。
本文報道的綴合物包括含有一個或多個重復基序分子的各種變體，每種都結合相同的靶分子或結合不同的靶分子。在本文報道的綴合物中，非重復基序分子(即，綴合部分)的不論c末端或是n末端的僅一端共價連接單個重復基序分子。
第一個變體是包括兩個或多個重復基序分子的綴合物，每個結合相同或不同的靶分子，其中每對重復基序分子通過肽接頭連接。在一個實施方案中，重復基序分子的數(shù)量選自2、3、4、5、6、7、8、9或10個。在圖2中，顯示了包括通過肽接頭連接兩個或多個重復基序分子的示例性綴合物。
第二個變體是包括一個或多個重復基序分子和一個或多個非重復基序分子的綴合物。每個重復基序分子結合相同或不同的靶分子。非重復基序分子提供了一個或多個重復基序分子共價結合的支架，任選的和獨立的分別通過肽接頭。在一個實施方案中，非重復基序分子選自抗體cl結構域、抗體ch1結構域、抗體鉸鏈區(qū)、抗體ch2結構域、抗體ch3結構域、抗體ch4結構域、膜錨定基序、跨膜結構域、糖基化標簽序列、純化或檢測標簽序列，或其一種或多種的組合，不論是天然存在的或是其改造的變體。在一個實施方案中，非重復基序分子包括通過一個或多個二硫鍵共價連接在一起的兩個或多個多肽。在一個實施方案中，非重復基序分子是抗體fc部分。在一個實施方案中，非重復基序分子是由兩個單體組成的二體，其中每個單體按n端至c端的方向，都包括重鏈鉸鏈區(qū)、ch2結構域和ch3結構域，或者是由兩個單體組成的二體，其中每個單體按n端至c端的方向，都包括ch1結構域、重鏈鉸鏈區(qū)、ch2結構域和ch3結構域，或者是包括兩個按n端至c端的方向各自包括ch1結構域、重鏈鉸鏈區(qū)、ch2結構域和ch3結構域的單體和兩個包括輕鏈恒定結構域的單體的四體。在另一個實施方案中，每個單體彼此獨立的進一步包括可變結構域。
術語“肽接頭”表示包含通過肽鍵彼此連接的氨基酸殘基的天然和/或合成來源的接頭。由線性氨基酸鏈組成，其中20個天然存在的氨基酸是單體構建模塊。鏈具有從1至50個氨基酸殘基的長度，在一個實施方案中，在3至28個氨基酸殘基之間，在另一實施方案中，在4至20個氨基酸殘基之間。接頭可含有重復性氨基酸序列或天然存在的多肽的序列。接頭具有確保兩個通過接頭連接的組件可以正確折疊并由于空間和自由旋轉而正確呈遞的功能。在一個實施方案中，接頭是設計為富含甘氨酸、谷氨酰胺和/或絲氨酸殘基的“合成的肽接頭”。這些殘基按例如至多5個氨基酸的小重復單元排列，例如(g)gggs、(q)qqqg或(s)sssg(seqidno:14、15和16)。這些小重復單元可以重復2至5次，形成多體單元。其他合成的肽接頭包括重復10至20次的單個氨基酸，例如接頭中的絲氨酸gsssssssssssssssg(seqidno:17)。在一個實施方案中，接頭選自[gq4]3gnn(seqidno：18)，lslspgk(seqidno：19)，lspnrgec(seqidno：20)，lslsgg(seqidno：21)，lslspgg(seqidno：22)，g3[sg4]2sg(seqidno：23)或g3[sg4]2sg2(seqidno：24)。
在一個實施方案中，接頭具有4至20個氨基酸殘基。在一個實施方案中，接頭在重復基序分子之間是相同的，在另一個實施方案中，綴合物含有具有兩個或多個不同的氨基酸序列的接頭。在另一實施方案中，接頭選自(g3s)、(g3s)2、(g3s)3，(g3s)4，(g3s)5，(g4s)，(g4s)2，(g4s)3，(g4s)4，(g4s)5(seqidno：14和25至33)，優(yōu)選選自(g4s)3和(g4s)4(seqidno:31和seqidno:32)。
在一個實施方案中，本文報道的綴合物包括一個重復基序分子和一個非重復基序分子，和任選的在這些分子之間的肽接頭。重復基序分子與非重復基序分子的c端或n端共價連接，或與形成非重復基序分子的多肽的一個c端或一個n端共價連接。
在圖3至5中，顯示了第二個變體的實施方案的示例性綴合物。在圖3中，顯示了一個重復基序分子與不同的單個抗體結構域的n端和c端的綴合物。在圖4中，顯示了一個重復基序分子與2、3或4個抗體結構域的組合的n端和c端的綴合物。在圖5中，顯示了一個重復基序分子與二硫鍵連接的抗體結構域(cl-ch1或鉸鏈-鉸鏈)的n端和c端的綴合物，任選的，這些綴合物還可包括除可變結構域以外的其他抗體結構域。
在另一個實施方案中，本文報道的綴合物包括兩個重復基序分子和一個非重復基序分子，和任選的至多兩個肽接頭。一個重復基序分子與非重復基序分子的c端共價連接，一個與非重復基序分子的n端共價連接，或者兩個都與形成非重復基序分子的多肽的c端或n端共價連接，或者重復基序分子之一與形成非重復基序分子的多肽的c端共價連接，一個與形成非重復基序分子的多肽的n端共價連接。其中，c端和n端是相同多肽或不同多肽的末端。在圖6至8中，顯示了這些實施方案的示例性綴合物。在圖6中，顯示了兩個重復基序分子與僅包括一個c端和一個n端的非重復基序分子綴合，其中，非重復基序分子可包括一個或多個抗體結構域。在圖7和8中，顯示了兩個重復基序分子與包括二硫鍵連接的抗體結構域的非重復基序分子綴合，任選的，這些綴合物還可包括除可變結構域以外的其他抗體結構域。
在另一實施方案中，綴合物包括四個重復基序分子和一個非重復基序分子，和任選的至多四個肽接頭。在該實施方案中，非重復基序分子包括至少兩個共價連接在一起的多肽，在一個實施方案中，是通過一個或多個二硫鍵。在一個實施方案中，重復基序分子與非重復基序分子的相應數(shù)量的c端和n端共價連接。在另一個實施方案中，兩個重復基序分子彼此綴合形成二聚的重復基序分子，而二聚的重復基序分子反過來與非重復基序分子綴合。在圖9至11中，顯示了該實施方案的示例性綴合物。在圖9中，四個重復基序分子與包含兩個c端和兩個n端的非重復基序分子綴合，其中非重復基序分子可以包括一個或多個抗體結構域。在圖10和11中，四個重復基序分子與包括二硫鍵連接的抗體結構域的非重復基序分子綴合，任選的這些綴合物還包括除可變結構域以外的其他抗體結構域。
在仍然另一個實施方案中，綴合物包括六個重復基序分子和一個非重復基序分子，和任選的至多六個肽接頭。在該實施方案中，非重復基序分子包括至少兩個共價關聯(lián)在一起的多肽，在一個實施方案中，通過一個或多個二硫鍵。在一個實施方案中，重復基序分子與非重復基序分子的相應數(shù)量(respectivenumber)的c端和n端共價連接。在另一個實施方案中，四個重復基序分子彼此綴合，形成二聚的重復基序分子，而二聚的重復基序分子反過來與非重復基序分子綴合，而兩個重復基序分子不彼此綴合，而各自與非重復基序分子的單個末端綴合。在圖12中，顯示了這些實施方案的示例性綴合物。
在另一實施方案中，綴合物包括八個重復基序分子和一個非重復基序分子，和任選的至多八個肽接頭。在該實施方案中，非重復基序分子包括至少兩個共價關聯(lián)在一起的多肽，在一個實施方案中，通過一個或多個二硫鍵。在一個實施方案中，重復基序分子與非重復基序分子的相應數(shù)量的c端和n端共價連接。在另一個實施方案中，兩至八個重復基序分子彼此綴合，形成二聚的重復基序分子，而二聚的重復基序分子反過來與非重復基序分子綴合，而剩余數(shù)量的重復基序分子不彼此綴合，而各自與非重復基序分子的單個末端綴合。
重復基序分子可以是支架的衍生物，所述支架選自ctla-4(evibody)、脂籠蛋白(lipocalin)、蛋白質a衍生分子例如蛋白質a的z-結構域(affibody，spa)、a-結構域(avimer，maxibody)、熱激蛋白例如groel和groes、轉鐵蛋白(transbody)、肽適體、c-型凝聚素結構域(四連接素(tetranectin))、人y-晶狀體球蛋白(y-crystallin)和人泛素(affilins)、pdz結構域、蝎毒素、人蛋白酶抑制劑的kunitz型結構域和纖連蛋白(adnectin)、源自src同源結構域的重復基序分子(例如，sh2或sh3結構域)、源自pdz結構域的重復基序分子、源自β-內酰胺酶的重復基序分子、源自高親和力蛋白酶抑制劑的重復基序分子、源自小二硫鍵結合蛋白支架的重復基序分子例如蝎毒素、包括重復結合結構域的重復基序分子例如egf-樣結構域、kringle-結構域、pan結構域、gla結構域、srcr結構域、kunitz結構域、牛胰腺胰蛋白酶抑制劑結構域、kazal-型絲氨酸蛋白酶抑制劑結構域、trefoil(p-型)結構域、vonwillebrand因子c型結構域、anhaphylatoxin-樣結構域、cub結構域、甲狀腺球蛋白i型重復、ldl-受體a類結構域、sushi結構域、link結構域、血小板反應蛋白i型結構域、免疫球蛋白-樣結構域、c-型凝聚素結構域、mam結構域、vonwillebrand因子a型結構域、生長調節(jié)素b結構域、wap-型四個二硫鍵核心結構域、f518c型結構域、血液結合素結構域、層粘連蛋白-型egf-樣結構域、c2結構域、源自avimers的重復基序分子、源自telobodies的重復基序分子、源自evibodies的重復基序分子、源自microbodies的重復基序分子(參見例如，jeong,k.j.和silverman,j.,nat.biotechnol.23(2005)1493-1494；panni,s.等人，j.biol.chem.277(2002)21666-21674；schneider,s.等人，nat.biotechnol.17(1999)170-175；legendre,d.等人，proteinsci.11(2002)1506-1518；stoop,a.a.等人，nat.biotechnol.21(2003)1063-1068；vita,c.等人，proc.natl.acad.sci.usa92(1995)6404-6408；wo2006/055689；us2006/0234299)。
在一個實施方案中，gemoc包括綴合部分，所述綴合部分選自抗體亞結構、小體(minibody)、adnectin、anticalin、affibody、affilin、knottin、glybody、c-型凝聚素-樣結構域蛋白、設計的錨蛋白-重復蛋白(darpin)、四連接素、kunitz結構域蛋白、硫氧還蛋白、細胞色素b562、鋅指支架、葡萄球菌核酶支架、纖連蛋白或纖連蛋白二體、粘蛋白(tenascin)、n-鈣粘蛋白、e-鈣粘蛋白、icam、titin、gcsf-受體、細胞因子受體、糖苷酶抑制劑、抗生素的有色蛋白、髓鞘膜粘附分子po、cd8、cd4、cd2、i類mhc、t-細胞抗原受體、cd1、vcam-1的c2和i-類結構域、肌球蛋白結合蛋白c的1-類免疫球蛋白結構域、肌球蛋白結合蛋白h的1-類免疫球蛋白結構域、端蛋白的i-類免疫球蛋白結構域、ncam、顫搐蛋白(twitchin)、神經膠質蛋白、生長激素受體、促紅細胞生成素受體、泌乳刺激素受體、干擾素-γ受體、β-半乳糖苷酶/葡糖醛酸糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、轉谷氨酰胺酶、t-細胞抗原受體、超氧化物歧化酶、組織因子結構域、細胞色素f、綠色熒光蛋白、groel和奇異果糖蛋白。
在一個實施方案中，綴合部分是anticalin。在另一實施方案中，anticalin是anticalina-44。在一個實施方案中，綴合物包括seqidno:64，和/或seqidno:65，和/或seqidno:66的氨基酸序列。已發(fā)現(xiàn)相比包含darpin的gemocs，包含anticalin的gemocs可以以更高的產量表達。在一個實施方案中，anticalin與抗體fc部分融合。在另一個實施方案中，fc部分是有或無突變的人igg1或人igg4的fc部分。示例性的突變是igg1的氨基酸改變l234a和l235a，和igg4的s228p和l235e。
已發(fā)現(xiàn)，鉸鏈區(qū)包括三個鏈間二硫鍵對于生產這樣的gemocs是有利的，所述gemocs包含與抗體fc部分的n端融合的重復基序分子，例如有或無上述鑒別的氨基酸改變的人igg1的fc部分或人igg4的fc部分。相比在鉸鏈區(qū)含有兩個鏈間二硫鍵橋的綴合物，在鉸鏈區(qū)含有三個鏈間二硫鍵橋的綴合物可以以降低的副產物含量(尤其是關于碎片化)而生產。
在本文中，之前報道的包含兩個或多個重復基序分子的gemoc為雙特異性、三特異性或四特異性的靶分子結合構建體提供了可能性。術語“雙特異性”表示gemoc包括至少兩個與兩種不同的靶分子結合的重復基序分子。術語“三特異性”表示gemoc包括至少三個與三種不同的靶分子結合的重復基序分子。術語“四特異性”表示gemoc包括至少四個與四種不同的靶分子結合的重復基序分子。
在gemoc包括抗體結構域的情況下，為了實現(xiàn)可接受的產量以及避免需要進行復雜的純化程序，應該規(guī)避或者至少最小化錯配的副產物以及片段的生產。規(guī)避錯配副產物問題的方法(稱為“knobs-into-holes”)的目標是通過向ch3結構域中導入突變來修飾接觸的界面，迫使各包括抗體重鏈ch3結構域的兩個不同的綴合物配對。一條鏈上大量的氨基酸被含短側鏈的氨基酸取代，產生“孔”。同時，將含大側鏈的氨基酸導入另一ch3結構域中，產生“突起(knob)”。通過共表達這兩種修飾后的綴合物，觀察到與同二聚體(“孔-孔”或“突起-突起”)形成相對應的高產量的異二聚體形成(“突起-孔”)(參見例如，ridgway,j.b.,proteineng.9(1996)617-621；wo96/027011)。明顯降低錯配副產物形成的另一方法是使用被稱為“結構域交換”或“交叉”的技術。其中開發(fā)了在抗體cl和ch1結構域之間的特異性相互作用。在一個實施方案中，本文報道的gemoc中的綴合部分包括兩個多肽，其中一個包括抗體輕鏈恒定結構域(cl)，另一個包括抗體重鏈第一恒定結構域(ch1)。圖13中顯示了示例性的雙特異性gemoc。
術語“靶分子”表示與重復基序分子互補并提供與重復基序分子相互作用的相互作用位點的分子。在一個實施方案中，靶分子選自細胞表面分子、可溶性細胞表面分子、細胞因子、激素、酶、免疫球蛋白、毒素、病毒顆粒蛋白、斑塊蛋白(plaqueprotein)和斑塊前體蛋白或納米顆粒。
本文報道的gemoc包括為展示重復基序分子提供支架的綴合部分。該綴合部分可以額外提供其他功能，例如受體結合功能。在一個實施方案中，綴合部分選自抗體結構域，在一個實施方案中，它包括抗體ch2結構域。抗體ch2結構域提供了adcc或cdc需要的fc受體結合功能。在另一個實施方案中，綴合部分是可以與包括相同綴合部分或相應互補關聯(lián)部分的其他gemoc多聚化或關聯(lián)的分子。在一個實施方案中，此類多聚化的綴合部分或綴合部分和互補關聯(lián)部分的對選自亮氨酸拉鏈，包括camp依賴性蛋白激酶a(pka)的調控亞基和激酶錨蛋白(aka)的錨定結構域的對。
gemoc中使用的綴合部分應該是人來源的，對于折疊和降解高度穩(wěn)定、“惰性的”，即沒有細胞因子或信號功能、生產方便和經濟、允許進一步加工(例如，蛋白水解切割、肽的化學修飾、翻譯后修飾)、具有恰當?shù)拇笮?無腎過濾或其他系統(tǒng)性排出)，且不是免疫原性的。
術語“多聚化綴合部分”指能夠共價或非共價的關聯(lián)兩個或多個單獨的gemoc的分子。在一個實施方案中，多聚化綴合部分選自亮氨酸拉鏈結構域(kostelny,s.a.等人，j.immunol.148(1992)1547-1553；dekruif,j.等人，j.biol.chem.271(1996)7630-7634)、酵母gcn4亮氨酸拉鏈、異亮氨酸拉鏈結構域、螺旋-轉角-螺旋基序(pack,p.等人，biotechnol.11(1993)1271-1277)、最大相互作用蛋白和相關分子(us5,512,473)、多聚谷氨酸-多聚賴氨酸結構域(us5,582,996)、天然或改造的成對重鏈ch2-ch3結構域、天然或改造的成對重鏈ch1-輕鏈恒定結構域(mueller,k.m.等人，febslett.422(1998)259-264)、tata結合蛋白的180個氨基酸的羧基端結構域(colemen,r.a.等人，j.biol.chem.270(1995)13842-13849)、vcam和vla-4、整聯(lián)蛋白和胞外基質蛋白、整聯(lián)蛋白和細胞表面分子(例如，cd54或cd102)、alcam、谷胱甘肽轉移酶、srcr結構域、受體二聚體對(例如，白介素-8受體(il-8r))、整聯(lián)蛋白異二聚體(例如lfa-1和gpiiib/iiia)、或僅其二聚化區(qū)域、二聚化配體多肽(例如，神經生長因子(ngf)、神經營養(yǎng)蛋白-3(nt-3)、白介素-8(il-8)、血管內皮生長因子(vegf)和腦源性神經營養(yǎng)因子(bdnf)(參見例如，arakawa,t.等人，j.biol.chem.269(1994)27833-27839；radziejewski,c.等人，biochem.32(1993)13350-6))、或僅其二聚化區(qū)域、一般是能夠形成二硫鍵的成對半胱氨酸殘基，成對的肽或多肽，每個包括至少一個半胱氨酸殘基(例如，從約1個、2個或3個至約10個半胱氨酸殘基)使得在肽或多肽之間可以形成二硫鍵，一般是卷曲-卷曲結構域(coiled-coildomain)(參見例如，lupas,a.等人，science252(1991)1162-1164)、p53的四聚化結構域、軟骨寡聚基質蛋白(comp)的n端殘基(氨基酸20-80)、α-螺旋序列(參見例如，eisenberg,d.等人，protein1(1986)16-22；ho,s.p.和degrado,w.f.,j.am.chem.soc.109(1987)6751-6758；regan,l.和degrado,w.f.,science241(1988)976-978；hill,c.p.等人，science249(1990)543-546；plückthun,a.和pack,p.,immunotechnol.3(1997)83-105)。在一個實施方案中，多聚化的綴合部分選自天然的或改造的成對重鏈ch2和ch3結構域、天然或改造的成對重鏈ch1結構域和輕鏈恒定結構域、天然或改造的重鏈鉸鏈區(qū)。在另一實施方案中，多聚化的綴合部分選自天然的或改造的成對重鏈ch2和ch3結構域、天然或改造的成對重鏈ch1結構域和輕鏈恒定結構域、重鏈鉸鏈區(qū)和ch2和ch3結構域的天然或改造的序列。在另一個實施方案中，多聚化的綴合部分選自天然的或改造的成對重鏈ch2和ch3結構域、天然或改造的成對重鏈ch1結構域和輕鏈恒定結構域。
可以通過木瓜蛋白酶在靠近每個鉸鏈區(qū)的n端側蛋白水解切割抗體，獲得兩個抗原結合片段(fab)和一個恒定區(qū)片段(fc)。fab片段由完整的輕鏈和重鏈的n端片段組成，所述重鏈的n端片段包括vh和ch1結構域。fc部分依次包括通過鉸鏈區(qū)內的二硫鍵連接的兩條重鏈的其余結構域。
抗體的fc部分與免疫系統(tǒng)的組分相互作用，例如補體級聯(lián)(補體依賴性細胞毒性(cdc))或通過結合fc-γ受體(抗體依賴性細胞的細胞毒性(adcc))或細胞毒性效應子細胞。為了改變fc部分的效應子功能，可以進行氨基酸殘基的取代(us5,648,260；us5,624,821)。fc部分負責調節(jié)效應子功能，例如細胞因子誘導、adcc、吞噬作用、補體依賴性細胞毒性(cdc)和抗體和抗原-抗體復合物的半衰期/清除率。fc部分一般在226位(cys)或230位(pro)開始，并延伸至抗體重鏈的c端。
本文報道的gemoc是包括一個或多個碳水化合物殘基的糖基化蛋白質。體內的蛋白質生產包括翻譯后修飾步驟，尤其是糖基化。糖殘基(糖基)酶促添加到蛋白質氨基酸序列的n或o-糖基化基序上。例如，抗體是在fc部分以及可變結構域中含一個或多個碳水化合物部分的糖基化蛋白質。fc部分的碳水化合物部分是至少部分對效應子功能負責的，而對抗體的抗原結合或半衰期較較不重要(jefferis,r.,biotechnol.prog.21(2005)11-16)。
根據(jù)重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，抗體(免疫球蛋白)分為以下類別：iga、igd、ige、igg和igm。一些這些類別進一步分為亞類(同種型)，即，igg分為igg1、igg2、igg3和igg4，或iga分為iga1和iga2。根據(jù)抗體所屬的免疫球蛋白類別，免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)分別被稱為α(iga)、δ(igd)、ε(ige)、γ(igg)和μ(igm)。根據(jù)恒定區(qū)的氨基酸序列，抗體輕鏈被標注為kappa(κ)或lambda(λ)輕鏈。
術語“糖基化”表示寡糖與至少一個氨基酸殘基連接。由于細胞內(即，體內)的翻譯后糖基化涉及多個酶，因而所獲得的重組生產的多肽根據(jù)表達多肽的細胞而具有糖基化模式，即，糖基化異質性。因此，重組生產的多肽不僅包括在特定氨基酸殘基處的一種確定的n-或o-連接寡糖，而且是具有相同氨基酸序列但在該特定氨基酸位置處包括不同的寡糖(即，具有糖基化模式)的各種多肽的混合物。因此，糖基化emoc包括各自具有相同氨基酸序列但在特定氨基酸位置連接不同的寡糖的一組綴合物。術語“寡糖”在本申請中用于表示包括兩個或多個共價連接的單糖單元的多聚糖。在一個實施方案中，與糖基化位點連接的寡糖是通過在cho細胞或hek293細胞中表達綴合物而獲得的寡糖的混合物，即，寡糖是通過表達綴合物的細胞的翻譯后修飾而獲得的寡糖的混合物，即，對于表達綴合物的細胞而言是特征性的。通過表達多肽的細胞(即，體內)獲得的糖基化和糖基化模式完全不同于在體外獲得的糖基化或糖基化模式。
本發(fā)明的另一個方面是通過在哺乳動物細胞中表達相應的編碼核酸，生產本文報道的gemoc的方法。
詳細而言，本文報道了在哺乳動物細胞中生產糖基化重復基序分子綴合物的方法，包括：
-提供包含編碼重復基序分子綴合物的核酸的哺乳動物細胞，
-在適合表達重復基序分子的條件下培養(yǎng)細胞，
-從細胞或培養(yǎng)基中回收糖基化重復基序分子，從而生產糖基化重復基序分子，
-任選的純化所回收的糖基化重復基序分子。
可以在哺乳動物細胞中生產本文報道的gemoc，即，作為體內的糖基化重復基序分子綴合物。在本文中報道了用于生產糖基化形式的重復基序分子綴合物的方法，在一個實施方案中，以體內的糖基化形式生產。此類體內的糖基化(即，在也表達重復基序分子綴合物的相同細胞中的糖基化)是細胞特異性的翻譯后修飾?？梢栽隗w外糖基化重組生產的多肽，即，在從生產細胞中分離之后(關于抗體參見例如，leung,s.等人，j.immunol.154(1995)5919-5926；us5,443,953)。
用于純化多肽和免疫球蛋白的方法是普遍建立和廣泛使用的，是單獨或者組合使用的。此類方法是例如在某些實施方案中，使用微生物來源蛋白質的親和層析(例如，蛋白質a或蛋白質g親和層析)、離子交換層析(例如，陽離子交換(羧甲基樹脂)、陰離子交換(氨基乙基樹脂)和混合型交換層析)、嗜硫吸附(例如，用β巰基乙醇和其他sh配體)、疏水性相互作用或芳香族吸附層析(例如，含苯基-瓊脂糖、aza-arenophilic樹脂或間-氨基苯基硼酸)、金屬螯合劑親和層析(例如，含ni(ii)-和cu(ii)-的親和材料)、尺寸排阻層析和預制的電泳方法(例如，凝膠電泳、毛細管電泳)(vijayalakshmi,m.a.,appl.biochem.biotech.75(1998)93-102)。在一個實施方案中，層析柱裝填物是選自親和層析材料、或離子交換層析材料、或嗜硫吸附層析材料、或疏水相互作用層析材料、或芳香族吸附層析材料、或金屬螯合劑親和層析材料、或尺寸排阻層析材料的層析材料。
為了生產分泌性多肽，目標結構基因還可包括編碼信號序列/前導肽的dna片段。信號序列指導新合成的多肽到達和通過內質網(er)的膜，多肽可以在內質網被導向分泌。在蛋白質跨過er膜的過程中，通過信號肽酶切去信號序列。宿主細胞的分泌機制的識別對于信號序列的功能是關鍵性的。因此，所使用的信號序列必須被宿主細胞的分泌機制的蛋白質和酶識別。
翻譯調控元件包括翻譯起始(aug)和終止密碼子(taa、tag或tga)。一些構建體中可以包括內在的核糖體進入位點(ires)。
因而，本文報道的另一個方面是用于在哺乳動物細胞中表達重復基序分子綴合物的核酸，包括下列元件：
-人巨細胞病毒的立即早期增強子和啟動子，
-抗體種系基因的5’-非翻譯區(qū)，
-免疫球蛋白重鏈信號序列，
-重復基序分子綴合物的編碼序列，
-多聚腺苷酸(“polya“)信號序列。
在一個實施方案中，抗體種系基因的5’-非翻譯區(qū)是人抗體種系基因。在另一個實施方案中，免疫球蛋白重鏈信號序列是小鼠或人的免疫球蛋白重鏈信號序列。在另一實施方案中，免疫球蛋白重鏈信號序列包括信號序列內含子(信號序列1、內含子、信號序列2[l1-內含子-l2])。
在下文中，將通過兩個結合her2的模型重復基序分子(darpinh10-2-g3，支架n2c(2個重復)，zahnd,c.等人，j.mol.biol.369(2007)1015-1028；darpin9-26，支架n3c(3個重復)，steiner,d.等人，j.mol.biol.382(2008)1211-1227)，來示例本文展示的對象。測試了用于在hek293細胞中表達這些gemoc的四種表達構建體(按n至c端的方向)：
1)前導肽–重復基序分子-六組氨酸標簽，
2)前導肽–重復基序分子-免疫球蛋白fc片段，
3)前導肽-免疫球蛋白fc片段-重復基序分子，
4)前導肽-免疫球蛋白fc片段-重復基序分子。
因而，本文報道的其他方面是seqidno:10、11、12、13、34、35、36、37、38、39、40、41、42的gemoc，包括seqidno:11和11、seqidno:13和13、seqidno:11和13、seqidno:34和34、seqidno:35和35、seqidno:34和35、seqidno:36和37、seqidno:39和39的gemoc，以及編碼這些的相應核酸，以及含有這些編碼核酸序列和序列組合的相應核酸，以及生產這些gemoc的方法。
下列實施例、序列表和附圖供幫助理解本發(fā)明，其真實的范圍提及在所附權利要求中。應理解，在不脫離本發(fā)明的精神的范圍內，可以對所提及的規(guī)程進行修飾。
序列表的說明
seqidno:01錨蛋白-重復基序分子氨基酸共同序列1。
seqidno:02錨蛋白-重復基序分子氨基酸共同序列2。
seqidno:03錨蛋白-重復基序分子氨基酸共同序列3。
seqidno:04錨蛋白-重復基序分子氨基酸共同序列4。
seqidno:05錨蛋白-重復基序分子氨基酸共同序列5。
seqidno:06錨蛋白-重復基序分子氨基酸共同序列6。
seqidno:07錨蛋白-重復基序分子氨基酸共同序列7。
seqidno:08錨蛋白-重復基序分子氨基酸共同序列8。
seqidno:09錨蛋白-重復基序分子氨基酸共同序列9。
seqidno:10c端綴合了六組氨酸標簽氨基酸序列的模型重復基序分子h10-2-g3。
seqidno:11c端綴合了igg1fc-部分的模型重復基序分子h10-2-g3。
seqidno:12c端綴合了六組氨酸標簽氨基酸序列的模型重復基序分子9-26。
seqidno:13c端綴合了igg1fc-部分的模型重復基序分子9-26。
seqidno:14至33肽接頭序列。
seqidno:34c端綴合了在鉸鏈區(qū)含兩個二硫鍵的igg1fc-部分的模型重復基序分子h10-2-g3。
seqidno:35c端綴合了在鉸鏈區(qū)含兩個二硫鍵的igg1fc-部分的模型重復基序分子9-26。
seqidno:36c端綴合了含ch3-突起-結構域的igg1fc-部分的模型重復基序分子h10-2-g3。
seqidno:37c端綴合了含ch3-孔-結構域的igg1fc-部分的模型重復基序分子9-26。
seqidno:38c端綴合了模型重復基序分子9-26的模型重復基序分子h10-2-g3。
seqidno:39含c端綴合了在鉸鏈區(qū)含二個二硫鍵的igg1fc-部分(c端綴合了模型重復基序分子9-26)的模型重復基序分子h10-2-g3。
seqidno:40c端綴合了模型重復基序分子9-26(c端綴合了六組氨酸標簽)的模型重復基序分子h10-2-g3。
seqidno:41c端綴合了模型重復基序分子h10-2-g3(c端綴合了六組氨酸標簽)的模型重復基序分子9-26。
seqidno:42c端綴合了六組氨酸標簽的二聚模型重復基序分子9-26。
seqidno:43人igg1恒定區(qū)。
seqidno:44人igg4恒定區(qū)。
seqidno:45人κ恒定區(qū)。
seqidno:46人λ恒定區(qū)。
seqidno:47n-端加帽重復。
seqidno:48c-端加帽重復。
seqidno:49cmv啟動子序列。
seqidno:50抗-aβ抗體可變重鏈結構域氨基酸序列。
seqidno:51抗-aβ抗體可變重鏈結構域氨基酸序列。
seqidno:52抗-aβ抗體可變重鏈結構域氨基酸序列。
seqidno:53抗-aβ抗體可變輕鏈結構域氨基酸序列。
seqidno:54抗-aβ抗體可變輕鏈結構域氨基酸序列。
seqidno:55抗-aβ抗體可變輕鏈結構域氨基酸序列。
seqidno:56c端綴合了六組氨酸標簽氨基酸序列和在c-加帽重復起始處導入改造的糖基化位點的模型重復基序分子h10-2-g3。
seqidno:57c端綴合了igg1fc-部分及其c端綴合了膜錨定結構域的模型重復基序分子h10-2-g3。
seqidno:58c端綴合了六組氨酸標簽氨基酸序列和在c-加帽重復起始處導入改造的糖基化位點的模型重復基序分子9-26。
seqidno:59c端綴合了igg1fc-部分及其c端綴合了膜錨定結構域的模型重復基序分子9-26。
seqidno:60c端綴合了六組氨酸標簽氨基酸序列和c端區(qū)域的糖基化標簽的模型重復基序分子h10-2-g3。
seqidno:61c端綴合了六組氨酸標簽氨基酸序列和c端區(qū)域的糖基化標簽的模型重復基序分子9-26。
seqidno:62c端綴合了六組氨酸標簽氨基酸序列和糖基化標簽的模型重復基序分子h10-2-g3。
seqidno:63c端綴合了六組氨酸標簽氨基酸序列和糖基化標簽的模型重復基序分子9-26。
seqidno:64包括含六組氨酸標簽的anticalina-44的模型綴合物。
seqidno:65含fc標簽和在鉸鏈區(qū)含三個二硫鍵橋的模型anticalina-44。
seqidno:66含fc標簽和在鉸鏈區(qū)含兩個二硫鍵橋的模型anticalina-44。
附圖描述
圖1抗體的結構域構架的示意性展示圖和用于其他附圖的符號標記。
圖2包括兩個或多個重復基序分子的示例性綴合物。
圖3與不同的單個抗體結構域的n端和c端結合的一個重復基序分子的示例性綴合物。
圖4與兩、三或四個抗體結構域的組合的n端和c端結合的一個重復基序分子的示例性綴合物。
圖5與二硫鍵連接的抗體結構域的n端和c端結合的一個重復基序分子的示例性綴合物。
圖6兩個重復基序分子與只包括一個c端和一個n端的非重復基序分子綴合的示例性綴合物。
圖7兩個重復基序分子與包括二硫鍵連接的抗體結構域(部分1)的非重復基序分子綴合的示例性綴合物。
圖8兩個重復基序分子與包括二硫鍵連接的抗體結構域(部分2)的非重復基序分子綴合的示例性綴合物。
圖9四個重復基序分子與包括兩個c端和兩個n端的非重復基序分子綴合的示例性綴合物。
圖10四個重復基序分子與包括二硫鍵連接的抗體結構域(部分1)的非重復基序分子綴合的示例性綴合物。
圖11四個重復基序分子與包括二硫鍵連接的抗體結構域(部分2)的非重復基序分子綴合的示例性綴合物。
圖12六個重復基序分子與一個非重復基序分子的示例性綴合物。
圖13示例性的結構域交換的gemoc。
圖14表達質粒9800的質粒圖。
圖15表達質粒9801的質粒圖。
圖16重鏈-多肽-綴合物表達質粒9807的質粒圖。
圖17抗體輕鏈表達載體5170的質粒圖。
圖18第7天，瞬時轉染的hek23細胞的上清液中表達的錨蛋白-重復基序分子綴合物的sds-page凝膠；構建體1＝seqidno:10的蛋白質，構建體2＝seqidno:12的蛋白質，構建體3＝seqidno:11的蛋白質，構建體4＝seqidno:13的蛋白質。
圖19根據(jù)本發(fā)明的gemoc與可溶性her2結合的biacore分析。
實施例1
質粒構建
用于操作dna的標準方法描述在sambrook,j.等人，molecularcloning:alaboratorymanual；coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,newyork,1989中。根據(jù)生產商的說明使用分子生物學試劑。通過基因合成制備所需的基因片段。將合成的基因片段克隆到特定的表達載體中。通過dna測序驗證亞克隆基因片段的dna序列。
表達質粒9800和9803
通過唯一的限制性酶切位點bsmi和bpu10i，將編碼seqidno:10或seqidno:12的綴合物的基因片段克隆到特定的表達質粒中。將表達質粒設計為組合了綴合物的編碼序列與c端的六組氨酸標簽，用于例如在hek293細胞中表達和之后的純化。除綴合物的表達盒外，質粒還包括：
-載體puc18的復制起點，其允許該質粒在e.coli中復制，和
-在e.coli中產生氨芐青霉素抗性的β-內酰胺酶基因。
綴合物編碼序列的轉錄單元包括下列元件：
-人巨細胞病毒的立即早期增強子和啟動子，
-人抗體種系基因的5’-非翻譯區(qū)，
-包括信號序列內含子和在l2的3’末端唯一的限制性酶切位點bsmi的小鼠免疫球蛋白重鏈信號序列(信號序列1、內含子、信號序列2[l1-內含子-l2])，
-綴合物的編碼序列，
-與綴合物的編碼序列讀碼框連續(xù)的，在綴合物的編碼序列的3’末端編碼唯一的bpu10i的gsg接頭，
-在gsg接頭的3’末端的六組氨酸標簽，與綴合物的編碼序列和gsg接頭讀碼框連續(xù)，
-多聚腺苷酸(“polya“)信號序列，和
-在表達序列的3’末端的唯一的限制性酶切位點nhei和eagi。
表達質粒9800和9803的質粒圖相應的顯示在圖14中。成熟綴合物的氨基酸序列(不含信號序列)標注在seqidno:10和12中。
表達質粒9801和9804
通過唯一的限制性酶切位點hindiii和pmli，將編碼seqidno:11或seqidno:13的綴合物的基因片段克隆到特定的表達質粒中。將表達質粒設計為在igg1類免疫球蛋白的鉸鏈區(qū)的n端綴合了綴合物，從而替換天然存在的vh和ch1結構域。所獲得的表達質粒可分別用于表達seqidno:11和13的綴合物，例如在hek293細胞中。除與igg1鉸鏈、-ch2和-ch3序列綴合的重復基序分子的表達盒外，質粒還包括：
-載體puc18的復制起點，其允許該質粒在e.coli中復制，和
-在e.coli中產生氨芐青霉素抗性的β-內酰胺酶基因。
重復基序分子-鉸鏈-ch2-ch3綴合物的轉錄單元包括下列元件：
-人巨細胞病毒的立即早期增強子和啟動子，
-人巨細胞病毒的內含子a序列，
-人抗體種系基因的5’-非翻譯區(qū)，
-包括信號序列內含子和在l2的3’末端唯一的限制性酶切位點bsmi的小鼠免疫球蛋白重鏈信號序列(信號序列1、內含子、信號序列2[l1-內含子-l2])，
-綴合物的編碼序列，
-編碼人igg1的鉸鏈區(qū)、ch2-和ch3-結構域的序列，在鉸鏈區(qū)具有唯一的pmli限制性酶切位點，允許克隆綴合物的編碼序列，和
-多聚腺苷酸(“polya“)信號序列。
表達質粒9801和9804的質粒圖相應的顯示在圖15中。成熟綴合物的氨基酸序列(不含信號序列)標注在seqidno:11和13中。
表達質粒9807和9808
不含六組氨酸標簽的seqidno:10和12的重復基序分子可以綴合的抗體實例是抗淀粉體β-a4肽(抗-aβ抗體)的抗體。此類抗體和相應的核酸序列報道在例如wo2003/070760或us2005/0169925中。通過唯一的限制性酶切位點mroi和nhei，將編碼綴合物的基因片段克隆到特定的表達質粒中。將表達質粒設計為在igg1亞類人免疫球蛋白重鏈c端綴合多肽(基因組有序的表達盒；外顯子-內含子排列)。所獲得的表達質?？捎糜诒磉_綴合物，例如在hek293細胞中。除單克隆抗體重鏈-重復基序分子綴合物的表達盒外，質粒還包括：
-載體puc18的復制起點，其允許該質粒在e.coli中復制，和
-在e.coli中產生氨芐青霉素抗性的β-內酰胺酶基因。
重鏈-重復基序分子綴合物的轉錄單元包括下列元件：
-人巨細胞病毒的立即早期增強子和啟動子，
-人抗體種系基因的5’-非翻譯區(qū)，
-包括信號序列內含子的小鼠免疫球蛋白重鏈信號序列(信號序列1、內含子、信號序列2[l1-內含子-l2])，
-抗-ab抗體可變重鏈結構域編碼片段，在3’末端安排了剪切供體位點和唯一的bamhi限制性酶切位點，
-編碼由內含子分開的人γ1恒定結構域ch1、鉸鏈、ch2和ch3的核酸，
-與ch3結構域的3’末端讀碼框連續(xù)的融合的(g4s)3接頭，
-在接頭的3’末端的唯一的限制性酶切位點mroi和nhei，允許與接頭的c端讀碼框連續(xù)的克隆多肽，和
-多聚腺苷酸(“polya“)信號序列。
重鏈-重復基序分子綴合物的表達質粒9807和9808的質粒圖相應的顯示在圖15中。
表達質粒5170
為了表達抗體輕鏈，使用質粒5170。質粒5170是表達質粒，用于例如在hek293細胞中瞬時表達抗體輕鏈(基因組有序的表達盒；外顯子-內含子排列)。
除抗體κ輕鏈表達盒外，該質粒還包括：
-作為可選擇標志物的新霉素抗性基因
-載體puc18的復制起點，其允許該質粒在e.coli中復制，和
-在e.coli中產生氨芐青霉素抗性的β-內酰胺酶基因。
抗體κ輕鏈基因的轉錄單元包括下列元件：
-人巨細胞病毒的立即早期增強子和啟動子，
-人抗體種系基因的5’-非翻譯區(qū)，
-包括信號序列內含子的小鼠免疫球蛋白重鏈信號序列(信號序列1、內含子、信號序列2[l1-內含子-l2])，
-抗-aβ抗體可變輕鏈結構域編碼片段，在3’末端安排了剪切供體位點和唯一的bamhi限制性酶切位點，截短的人κ輕鏈內含子2，
-人κ輕鏈基因恒定結構域，
-多聚腺苷酸(“polya“)信號序列，和
-在3’末端的唯一的限制性酶切位點asci和sgrai。
抗體κ輕鏈表達載體5170的質粒圖顯示在圖17中。
實施例2
瞬時轉染和表達
通過瞬時轉染懸浮培養(yǎng)的hek293-freestyle細胞(人胚腎細胞系293，invitrogen)獲得如實施例1中示例的根據(jù)本發(fā)明的重組綴合物。轉染的細胞按30ml至250ml培養(yǎng)基的規(guī)模，在37℃，8％co2中搖瓶培養(yǎng)在f17培養(yǎng)基(gibco)或freestyle293培養(yǎng)基(invitrogen)中，所述培養(yǎng)基補充了6mm谷氨酰胺(ultra-谷氨酰胺(biowhittake/lonza)或l-谷氨酰胺(sigma))。為了轉染，fectin(invitrogen)按試劑(μl)與dna(μg)的比例為4:3使用。在與抗體重鏈c端綴合的情況下，從兩種不同的質粒表達輕鏈和重鏈，分別使用輕鏈比重鏈編碼質粒為1:2至2:1的摩爾比。在轉染后6至8天收獲含綴合物的細胞培養(yǎng)上清液。meissner,p.等人，biotechnol.bioeng.75(2001)197-203中給出了關于在例如hek293細胞中重組表達人免疫球蛋白的一般信息。
實施例3
使用sds-page的表達分析
lds樣品緩沖液，四倍濃度(4xlds)：4g甘油，0.682gtris(tris-(羥甲基)-氨基甲烷)，0.666gtris-hcl(tris-(羥甲基)-氨基甲烷-鹽酸)，0.8glds(十二烷基磺酸鋰)，0.006gedta(乙二胺四乙酸)，0.75ml的servablueg250的按重量計1％(w/w)水溶液，0.75ml的酚紅的按重量計1％(w/w)溶液，加水至總體積10ml。
離心含有分泌的綴合物的培養(yǎng)肉湯，去除細胞和細胞殘片。將等份的澄清上清液與1/4體積(v/v)的4xlds樣品緩沖液和1/10體積(v/v)的0.5m1,4-二硫蘇糖醇(dtt)混合。然后，樣品在75℃孵育10min，通過sds-page分離蛋白質。根據(jù)生產商的說明使用
實施例4
通過親和層析和凝膠過濾層析純化蛋白質
fc-和抗體-綴合物
使用蛋白質a親和材料mabselectsure(gehealthcare)，通過親和層析純化表達和分泌的fc-和抗體-綴合物。簡而言之，在離心(10,000g，10分鐘)和通過0.45μm濾器過濾后，將含有綴合物的澄清培養(yǎng)上清液應用于用pbs緩沖液(10mmna2hpo4，1mmkh2po4，137mmnacl和2.7mmkcl，ph7.4)平衡過的mabselectsure柱子。通過用平衡緩沖液洗滌，去除未結合的蛋白質。用0.1m檸檬酸緩沖液，ph3.3洗脫綴合物，用1mtrisph9.0中和含有產物的級分。之后，在4℃用pbs緩沖液透析溶液，用amiconcentricon濃縮裝置濃縮，并儲存在0℃的冰水浴中。通過分析性尺寸排阻層析分析fc-和抗體-綴合物的聚集。將表現(xiàn)出高分子量聚集物的級分用于預制的尺寸排阻層析。簡而言之，通過在centricon裝置(amicon)中重復濃縮和稀釋，將綴合物的緩沖液交換為組氨酸緩沖液(20mm組氨酸，140mmnacl，ph6.0)。在濃縮至1-4ml后，將含有綴合物的溶液應用于用相同的組氨酸緩沖液平衡過的superdex200highload柱子(gehealthcare)上。收集1ml的級分。通過分析性sec(superdex200，gehealthcare)分析所有的級分，混合含純的單體聚合物的級分。如前文所述，在存在和缺少還原劑的條件下，通過sds-page和考馬斯亮藍染色，分析綴合物的完整性。
seqidno:10和12的綴合物
根據(jù)已知的方法，使用鎳螯合的親和材料ni-sepharosehphightrap(gehealthcare)通過親和層析純化包括六組氨酸標簽的表達和分泌綴合物(seqidno:10和12)。簡而言之，在離心(10,000g，10分鐘)和通過0.45μm濾器過濾后，將含有綴合物的澄清培養(yǎng)上清液應用于用磷酸鹽緩沖液(50mmna3po4，300mmnacl，ph8.0)平衡過的ni-sepharose柱子。通過用含20mm咪唑的磷酸鹽平衡緩沖液洗滌，去除未結合的蛋白質。用電導梯度洗脫綴合物。之后，在4℃用組氨酸緩沖液(20mm組氨酸，140mmnacl，ph6.0)充分透析含綴合物的溶液，用amiconcentricon濃縮裝置濃縮，并儲存在0℃的冰水浴中。通過分析性尺寸排阻層析分析fc-和抗體-綴合物的聚集。根據(jù)已知的方法，將表現(xiàn)出高分子量聚集物的級分用于預制的尺寸排阻層析。簡而言之，如前所報道的，將濃縮的含綴合物的溶液應用于用相同的組氨酸緩沖液平衡過的superdex200highload柱子(gehealthcare)上。收集1ml的級分。通過分析性sec(superdex200，gehealthcare)分析所有的的級分，混合含純的單體聚合物的級分。如前文所述，在存在和缺少還原劑的條件下，通過sds-page和考馬斯亮藍染色，分析綴合物的完整性。
實施例5
biacore結合測定
在25℃下，在biacore3000儀器(gehealthcarebiosciencesab,sweden)上實施所有的表面等離子體共振測量。走樣和稀釋緩沖液是pbs(1mmkh2po4，10mmna2hpo4，105mmnacl，2.7mmkcl)，ph6.0，0.005％(v/v)tween20。將可溶性蛋白a稀釋在10mm醋酸鈉緩沖液ph5.0中，并使用標準的氨偶聯(lián)試劑盒(gehealthcarebiosciencesab，sweden)固定在cm5生物傳感芯片上，獲得約1000ru的蛋白質a表面密度。使用hbs-p(10mmhepes，ph7.4，118mmnacl，0.005％表面活性劑p20；gehealthcarebiosciencesab，sweden)作為固定過程中的走樣緩沖液。用pbs，0.005％(v/v)tween20，ph6.0稀釋所討論的fc-和抗體-綴合物至450nm濃度，并以30μl/分鐘的流速注射3分鐘。然后，將可溶性配體稀釋在相同緩沖液中以獲得70至680nm之間的不同濃度，并以30μl/分鐘的流速注射3分鐘。之后，用pbs，ph8.0，0.005％(v/v)tween20再生傳感芯片1分鐘。用biaevaluation軟件(biacore，sweden)實施數(shù)據(jù)分析(參見圖19)。
實施例6
使用elisa的結合測定
通過elisa測試(酶聯(lián)免疫吸附測定)的手段，確定fc-和抗體-綴合物的結合。本文中使用基于鏈霉抗生物素/生物素技術的夾心測定。將鏈霉抗生物素包被的微滴度板用于測定。
實施例7
使用facs的結合測定
在補充了10％胎牛血清(fcs)和2mml-谷氨酰胺的mccoy’s5a培養(yǎng)基(pan)中培養(yǎng)穩(wěn)定過表達her2的細胞系sk-br-3(atcc#htb-30)。為了通過根據(jù)本發(fā)明的綴合物檢測細胞表面的her2，用補充了1％fcs作為封閉試劑的pbs洗滌細胞。綴合物與細胞在4℃下，在pbs/1％fcs中孵育15min，洗滌并用恰當?shù)臋z測綴合物的熒光標記的二抗孵育。根據(jù)細胞上結合的綴合物，通過熒光輔助的細胞分選(facs)來分選標記的細胞。
序列表
<110>弗·哈夫曼-拉羅切有限公司
<120>糖基化重復基序分子綴合物
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<212>prt
<213>人工序列
<220>
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202530
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hishishis
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<213>人工序列
<220>
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<400>13
aspleuglylyslysleuleuglualaalaargalaglyglnaspasp
151015
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202530
phetyrglyilethrproleuhisleualaalaalatyrglyhisleu
354045
gluilevalgluvalleuleulyshisglyalaaspvalasnalahis
505560
asptrpasnglytrpthrproleuhisleualaalalystyrglyhis
65707580
leugluilevalgluvalleuleulyshisglyalaaspvalasnala
859095
ileaspasnalaglylysthrproleuhisleualaalaalahisgly
100105110
hisleugluilevalgluvalleuleulystyrglyalaaspvalasn
115120125
alaglnasplyspheglylysthralapheaspileserileaspasn
130135140
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145150155160
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225230235240
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260265270
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275280285
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290295300
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<210>15
<211>5
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<213>人工序列
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glyserserserserserserserserserserserserserserser
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gly
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<211>18
<212>prt
<213>人工序列
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<400>24
glyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyserglygly
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<213>人工序列
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151015
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glyglyglyglyserglyglyglyglyser
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glyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyser
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<212>prt
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<220>
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glyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglysergly
151015
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<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>接頭20
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glyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglysergly
151015
glyglyglyserglyglyglyglyser
2025
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<212>prt
<213>人工序列
<220>
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lyscyslysvalserasnlysalaleuproalaproileglulysthr
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ileserlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyrthrleu
245250255
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aspleuglylyslysleuleuglualaalaargalaglyglnaspasp
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gluvalargileleumetalaasnglyalaaspvalasnalalysasp
202530
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gluilevalgluvalleuleulyshisglyalaaspvalasnalahis
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leugluilevalgluvalleuleulyshisglyalaaspvalasnala
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100105110
hisleugluilevalgluvalleuleulystyrglyalaaspvalasn
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180185190
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195200205
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serasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrproprovalleu
325330335
aspseraspglyserphepheleutyrserlysleuthrvalasplys
340345350
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355360365
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370375380
lys
385
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202530
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505560
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65707580
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100105110
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115120125
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130135140
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145150155160
thrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisgluasppro
165170175
gluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnala
180185190
lysthrlysproargglugluglntyrasnserthrtyrargvalval
195200205
servalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglutyr
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lyscyslysvalserasnlysalaleuproalaproileglulysthr
225230235240
ileserlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyrthrleu
245250255
proprocysargaspgluleuthrlysasnglnvalserleutrpcys
260265270
leuvallysglyphetyrproseraspilealavalglutrpgluser
275280285
asnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrproprovalleuasp
290295300
seraspglyserphepheleutyrserlysleuthrvalasplysser
305310315320
argtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmethisgluala
325330335
leuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserproglylys
340345350
<210>37
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<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>模型重復基序分子9-26，c末端綴合了有ch3-孔結構域的igg1fc-部分
<400>37
aspleuglylyslysleuleuglualaalaargalaglyglnaspasp
151015
gluvalargileleumetalaasnglyalaaspvalasnalalysasp
202530
phetyrglyilethrproleuhisleualaalaalatyrglyhisleu
354045
gluilevalgluvalleuleulyshisglyalaaspvalasnalahis
505560
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65707580
leugluilevalgluvalleuleulyshisglyalaaspvalasnala
859095
ileaspasnalaglylysthrproleuhisleualaalaalahisgly
100105110
hisleugluilevalgluvalleuleulystyrglyalaaspvalasn
115120125
alaglnasplyspheglylysthralapheaspileserileaspasn
130135140
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145150155160
thrhisthrcysproprocysproalaprogluleuleuglyglypro
165170175
servalpheleupheproprolysprolysaspthrleumetileser
180185190
argthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisgluasp
195200205
progluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasn
210215220
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valservalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglu
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thrileserlysalalysglyglnproarggluproglnvalcysthr
275280285
leuproproserargaspgluleuthrlysasnglnvalserleuser
290295300
cysalavallysglyphetyrproseraspilealavalglutrpglu
305310315320
serasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrproprovalleu
325330335
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lys
385
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<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>模型重復基序分子h10-2-g3，c末端綴合了模型重復基序分子9-26.
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aspleuglylyslysleuleuglualaalaargalaglyglnaspasp
151015
gluvalargileleumetalaasnglyalaaspvalasnalalysasp
202530
glutyrglyleuthrproleutyrleualathralahisglyhisleu
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gluilevalgluvalleuleulysasnglyalaaspvalasnalaval
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valpheleupheproprolysprolysaspthrleumetileserarg
145150155160
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165170175
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servalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglutyr
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lyscyslysvalserasnlysalaleuproalaproileglulysthr
225230235240
ileserlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyrthrleu
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leuvallysglyphetyrproseraspilealavalglutrpgluser
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asnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrproprovalleuasp
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seraspglyserphepheleutyrserlysleuthrvalasplysser
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argtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmethisgluala
325330335
leuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserproglylys
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glyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglysergly
355360365
glyglyglyseraspleuglylyslysleuleuglualaalaargala
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glyglnaspaspgluvalargileleumetalaasnglyalaaspval
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aspvalasnalaileaspasnalaglylysthrproleuhisleuala
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alaaspvalasnalaglnasplyspheglylysthralapheaspile
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serileaspasnglyasngluaspleualagluileleugln
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<210>39
<211>526
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>模型重復基序分子h10-2-g3，c末端綴合了在鉸鏈區(qū)具有兩個二硫鍵的igg1fc-部分，其c末端綴合了模型重復基序分子9-26
<400>39
aspleuglylyslysleuleuglualaalaargalaglyglnaspasp
151015
gluvalargileleumetalaasnglyalaaspvalasnalalysasp
202530
glutyrglyleuthrproleutyrleualathralahisglyhisleu
354045
gluilevalgluvalleuleulysasnglyalaaspvalasnalaval
505560
aspalaileglyphethrproleuhisleualaalapheileglyhis
65707580
leugluilealagluvalleuleulyshisglyalaaspvalasnala
859095
glnasplyspheglylysthralapheaspileserileglyasngly
100105110
asngluaspleualagluileleuglnprolysserserasplysthr
115120125
histhrcysproprocysproalaprogluleuleuglyglyproser
130135140
valpheleupheproprolysprolysaspthrleumetileserarg
145150155160
thrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisgluasppro
165170175
gluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnala
180185190
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195200205
servalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglutyr
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gluilevalgluvalleuleulystyrglyalaaspvalasnalagln
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asplyspheglylysthralapheaspileserileaspasnglyasn
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<211>28
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151015
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atcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccg300
cctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacg360
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aaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctccgtttagtgaac600
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seralaileserglyserglyglyserthrtyrtyralaaspserval
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glnvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly
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serleuargleusercysalaalaserglyphethrphesersertyr
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glyserglyserglythraspphethrleuthrileserserleuglu
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tyrleualatrptyrglnglnlysproglyglnalaproargleuleu
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iletyrglyalaserserargalathrglyvalproalaargpheser
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glyserglyserglythraspphethrleuthrileserserleuglu
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progluaspphealathrtyrtyrcysglnglnleuserserphepro
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prothrpheglyglnglythrlysvalgluilelysargthr
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gluilevalgluvalleuleulysasnglyalaaspvalasnalaval
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aspalaileglyphethrproleuhisleualaalapheileglyhis
65707580
leugluilealagluvalleuleulyshisglyalaaspvalasnala
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thrasplyspheglylysthralapheaspileserileglyasngly
100105110
asngluaspleualagluileleuglnglyserglyhishishishis
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hishis
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<212>prt
<213>人工序列
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aspleuglylyslysleuleuglualaalaargalaglyglnaspasp
151015
gluvalargileleumetalaasnglyalaaspvalasnalalysasp
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glutyrglyleuthrproleutyrleualathralahisglyhisleu
354045
gluilevalgluvalleuleulysasnglyalaaspvalasnalaval
505560
aspalaileglyphethrproleuhisleualaalapheileglyhis
65707580
leugluilealagluvalleuleulyshisglyalaaspvalasnala
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glnasplyspheglylysthralapheaspileserileglyasngly
100105110
asngluaspleualagluileleuglnprolyssercysasplysthr
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valpheleupheproprolysprolysaspthrleumetileserarg
145150155160
thrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisgluasppro
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420
<210>58
<211>163
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>模型重復基序分子9-26，c末端綴合了六-組氨酸-標簽氨基酸序列，并且在c加帽重復的開始位置處引入了改造的糖基化位點
<400>58
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<213>人工序列
<220>
<223>模型重復基序分子9-26，c末端綴合了igg1fc-部分，并且在其c末端綴合了膜錨定結構域
<400>59
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<213>人工序列
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<223>具有在c端綴合的六組氨酸標簽氨基酸序列和含有c端區(qū)域的糖基化標簽的模型重復基序分子h10-2-g3
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<213>人工序列
<220>
<223>具有在c端綴合的六組氨酸標簽氨基酸序列和c端區(qū)域的糖基化標簽的模型重復基序分子9-26
<400>61
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<213>人工序列
<220>
<223>具有在c端綴合的六組氨酸標簽氨基酸序列和c端區(qū)的糖基化標簽的模型重復基序分子h10-2-g3
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<213>人工序列
<220>
<223>具有c末端綴合的六-組氨酸-標簽氨基酸序列和在c端區(qū)的糖基化標簽的模型重復基序分子9-26
<400>63
aspleuglylyslysleuleuglualaalaargalaglyglnaspasp
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180
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<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>anticalina-44，具有六組氨酸標簽
<400>64
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<213>人工序列
<220>
<223>anticalina-44，含fc標簽(3ss鍵)
<400>65
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lys
385
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