本發(fā)明涉及生物工程與
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體的說是涉及一種生物催化生產(chǎn)2-苯乙醇的方法。
背景技術(shù)：
：2-苯乙醇(2-penylenthanol,2-pe)又稱β-苯乙醇(β-penylenthanol)，化學(xué)名2-苯基乙醇(2-penylenthylalcohol,2-pea),分子式為c8h10o，分子量122.16，結(jié)構(gòu)式如下：2-苯乙醇是一種具有清甜的玫瑰樣花香的芳香醇，無色粘稠液體，沸點(diǎn)219℃，相對密度1.0230，折光率1.5310～1.5340，溶于乙醇、乙醚、甘油，略溶于水，微溶于礦物油。2-苯乙醇天然存在于許多花和植物的精油中，如玫瑰、風(fēng)信子、茉莉、水仙、百合等，同時(shí)也是一些發(fā)酵食品如茶葉、咖啡、面包、白酒、果酒、干酪和醬油的自然風(fēng)味物質(zhì)。2-苯乙醇香氣輕柔甜和，不僅是所有玫瑰香型香氣的基本組分，還具有協(xié)合及增效作用，是多種香型配方所需的組分，作為香料添加劑，其使用量僅次于香蘭素，是第二大香料成分，廣泛應(yīng)用于食品、日化用品、化妝品和煙草行業(yè)。目前，全球2-苯乙醇的年產(chǎn)量超過萬噸，主要通過化學(xué)合成生產(chǎn)，僅有很少一部分是從玫瑰花或玫瑰精油中提取得來的。若從玫瑰花中提取天然2-苯乙醇，每5噸玫瑰鮮花僅能萃取玫瑰精油1kg，生產(chǎn)成本極其昂貴，產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了市場的需求?；瘜W(xué)合成2-苯乙醇基本上是采用廉價(jià)的化工原料苯、或苯乙烯，通過化學(xué)合成方法生產(chǎn)，其工藝過程存在諸如原料毒性高、產(chǎn)品純度低、合成過程污染大等弊端。產(chǎn)品中常殘留有副產(chǎn)物，如聯(lián)二苯、β-氯代乙苯、氯乙醇等，產(chǎn)生不良?xì)馕?，影?-苯乙醇產(chǎn)品的品質(zhì)。2-苯乙醇的另一個(gè)重要的生產(chǎn)途徑是采用微生物發(fā)酵或者生物轉(zhuǎn)化，該途徑原料和合成過程綠色環(huán)保、反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)物安全、生產(chǎn)周期短、可大規(guī)模生產(chǎn)，該途徑制備的2-苯乙醇能滿足人們對“綠色、天然”的時(shí)尚追求。國際上以微生物轉(zhuǎn)化l-苯丙氨酸法生產(chǎn)天然2-苯乙醇，主要集中在法國、德國、日本等發(fā)達(dá)國家，其當(dāng)前的生產(chǎn)量遠(yuǎn)不能滿足消費(fèi)需求。該方法具有條件溫和、環(huán)境友好、產(chǎn)品綠色天然等優(yōu)點(diǎn)。目前，已報(bào)道的微生物或酶生物轉(zhuǎn)化l-苯丙氨酸生產(chǎn)2-苯乙醇主要有三條途徑:第一條途徑是從頭合成的苯丙酮酸途徑，該途徑從葡萄糖出發(fā)，通過合成芳香族氨基酸的莽草酸途徑形成分支酸后，在分支酸變位酶作用下，轉(zhuǎn)變成預(yù)苯酸，經(jīng)過脫水、脫羧后形成苯丙酮酸，相繼形成苯乙醛，并還原為2-苯乙醇，該代謝途徑長、支路多、存在多種抑制，2-苯乙醇產(chǎn)量不高。如中國專利cn102851253a公開了一種產(chǎn)2-苯乙醇的大腸桿菌工程菌株及其應(yīng)用，其將畢赤酵母的苯丙酮酸脫羧酶以及釀酒酵母的乙醇脫氫酶兩個(gè)編碼基因通過基因工程技術(shù)，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，從而獲得產(chǎn)2-苯乙醇的重組大腸桿菌，以葡萄糖為原料，從頭合成2-苯乙醇。但是，該重組大腸桿菌的最高產(chǎn)量僅為130mg/l，依然處于較低的水平。第二條途徑是從l-苯丙氨酸出發(fā)，經(jīng)過脫羧酶作用下，脫羧生成苯乙胺，再經(jīng)過胺氧化酶作用下形成苯乙醛，進(jìn)而還原生成2-苯乙醇，此途徑較少發(fā)生。第三條途徑是從l-苯丙氨酸出發(fā)，經(jīng)過轉(zhuǎn)移氨基作用生成苯丙酮酸、再脫羧形成苯乙醛、最后還原生成2-苯乙醇，依次涉及芳香氨基轉(zhuǎn)氨酶、苯丙酮酸脫羧酶和醇脫氫酶3種。該路線中(見路線1)，芳香氨基轉(zhuǎn)氨酶催化l-苯丙氨酸轉(zhuǎn)移氨基作用生成苯丙酮酸，需要提供額外的酮酸如草酰乙酸原料作為l-苯丙氨酸轉(zhuǎn)移氨基的受體，增加了成本，同時(shí)還額外產(chǎn)生l-天冬氨酸，增加后處理的產(chǎn)物分離難度和成本，同時(shí)增加廢水處理的環(huán)保成本。如要維持草酰乙酸和l-天冬氨酸的循環(huán)，可以采用添加另外一種酮酸如丙酮酸及另外一種轉(zhuǎn)氨基酶(ata)，同樣額外產(chǎn)生l-丙氨酸，增加后處理的產(chǎn)物分離難度和成本，同時(shí)增加廢水處理的環(huán)保成本。此外，該路線(見路線1)中，醇脫氫酶催化苯乙醛還原生成2-苯乙醇必須持續(xù)加入足量價(jià)格昂貴的輔酶nadh，反應(yīng)才能保證反應(yīng)的順利進(jìn)行，如果采用輔酶再循環(huán)，需要提供額外的氫源如葡萄糖及葡萄糖脫氫酶，這樣又增加了原料成本，同時(shí)還額外產(chǎn)生了葡萄糖酸，再一次增加后處理的產(chǎn)物分離難度和成本，同時(shí)增加廢水處理的環(huán)保成本。如中國專利cn201610464256.7公開了一種2-苯乙醇的非細(xì)胞合成生物學(xué)制備方法及應(yīng)用，見路線2，其實(shí)質(zhì)是和路線1相同的：該專利將重組轉(zhuǎn)氨酶ar08、苯丙酮酸脫羧酶ar010、醇脫氫酶adh組成的共同催化體系催化轉(zhuǎn)化l-苯丙氨酸和草酰乙酸，在輔酶nadh參與下，合成2-苯乙醇及l(fā)-天冬氨酸。該專利除了存在前面所說的一些缺陷外，其多酶催化體系存在中間體性質(zhì)不穩(wěn)定所至產(chǎn)率不高的難題，而選用固定化方法，制備固定化酶進(jìn)一步增大了酶制備的成本。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種生物催化生產(chǎn)2-苯乙醇的方法，使得所述方法避免持續(xù)加入輔酶nadh，通過特異性生物催化劑的選擇、組合，原位實(shí)現(xiàn)一次添加輔酶nad即可再循環(huán)利用，并無額外酮酸添加及額外氨基酸副產(chǎn)物產(chǎn)生，而以l-苯丙氨酸為底物催化制備2-苯乙醇，提高底物轉(zhuǎn)化率，最高達(dá)到99％，且苯乙醇產(chǎn)量得到顯著提高。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種生物催化生產(chǎn)2-苯乙醇的方法，將經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)的e.coli/pdh、e.coli/kdc和e.coli/adh的濕菌體加入到以l-苯丙氨酸為底物的生物催化體系中進(jìn)行催化反應(yīng)，反應(yīng)完畢后離心，上清液經(jīng)過萃取獲得2-苯乙醇。其中，所述e.coli/pdh為轉(zhuǎn)化有包含苯丙氨酸脫氫酶編碼基因的質(zhì)粒的大腸桿菌；所述e.coli/kdc為轉(zhuǎn)化有包含2-酮酸脫羧酶編碼基因的質(zhì)粒的大腸桿菌；所述e.coli/adh為轉(zhuǎn)化有包含醇脫氫酶編碼基因的質(zhì)粒的大腸桿菌。本發(fā)明針對利用大腸桿菌生物催化l-苯丙氨酸制備2-苯乙醇產(chǎn)量較低的問題，通過選擇特定組合的特異性生物催化劑進(jìn)行一系列反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了較高的l-苯丙氨酸轉(zhuǎn)化率和2-苯乙醇產(chǎn)量；所述特異性生物催化劑為e.coli/pdh、e.coli/kdc和e.coli/adh三者產(chǎn)生的苯丙氨酸脫氫酶(簡寫為pdh，能夠催化苯丙氨酸脫氨的酶)、2-酮酸脫羧酶(簡寫為kdc，能夠催化苯丙酮酸脫羧的酶，在本發(fā)明中具體為2-酮酸脫羧酶)、醇脫氫酶(簡寫為adh，能夠催化苯乙醛還原的酶)，催化反應(yīng)路線如下：其中，作為優(yōu)選，所述e.coli/pdh為e.coli/pdhbb或e.coli/pdhti；e.coli/pdhbb為轉(zhuǎn)化有包含來源于bacillusbadiusiam11059苯丙氨酸脫氫酶編碼基因(在ncbi數(shù)據(jù)庫中核酸序列登錄號為d45211)的質(zhì)粒的大腸桿菌，e.coli/pdhti為轉(zhuǎn)化有包含來源于thermoactinomycesintermediusifo14230苯丙氨酸脫氫酶編碼基因(在ncbi數(shù)據(jù)庫中核酸序列登錄號為d00631)的質(zhì)粒的大腸桿菌。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述來源于bacillusbadiusiam11059的苯丙氨酸脫氫酶編碼基因和來源于thermoactinomycesintermediusifo14230的苯丙氨酸脫氫酶編碼基因均根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性進(jìn)行密碼子優(yōu)化。在本發(fā)明具體實(shí)施方式中，所述來源于bacillusbadiusiam11059的苯丙氨酸脫氫酶編碼基因根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性進(jìn)行密碼子優(yōu)化后的序列如seqidno:1所示；所述來源于thermoactinomycesintermediusifo14230的苯丙氨酸脫氫酶編碼基因根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性進(jìn)行密碼子優(yōu)化后的序列如seqidno:4所示。作為優(yōu)選，所述e.coli/kdc為e.coli/kdca或e.coli/kdcpsy；e.coli/kdca為轉(zhuǎn)化有包含來源于lactococcuslactis2-酮酸脫羧酶編碼基因(在ncbi數(shù)據(jù)庫中核酸序列登錄號為ay548760)的質(zhì)粒的大腸桿菌，e.coli/kdcpsy為轉(zhuǎn)化有包含來源于psychrobactercryohalolentisk52-酮酸脫羧酶編碼基因(在ncbi數(shù)據(jù)庫中核酸序列登錄號為yp_580229)的質(zhì)粒的大腸桿菌。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述來源于lactococcuslactis的2-酮酸脫羧酶編碼基因和來源于psychrobactercryohalolentisk5的2-酮酸脫羧酶編碼基因均根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性進(jìn)行密碼子優(yōu)化。在本發(fā)明具體實(shí)施方式中，所述來源于lactococcuslactis的2-酮酸脫羧酶編碼基因根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性進(jìn)行密碼子優(yōu)化后的序列如seqidno:2所示；所述來源于psychrobactercryohalolentisk5的2-酮酸脫羧酶編碼基因根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性進(jìn)行密碼子優(yōu)化后的序列如seqidno:5所示。作為優(yōu)選，所述e.coli/adh為e.coli/yahk或e.coli/sfa1；e.coli/yahk為轉(zhuǎn)化有包含來源于escherichiacolibw25113醇脫氫酶yahk編碼基因(在ncbi數(shù)據(jù)庫中核酸序列登錄號為944975)的質(zhì)粒的大腸桿菌，e.coli/sfa1為轉(zhuǎn)化有包含來源于saccharomycescerevisiaes288c醇脫氫酶sfa1編碼基因(在ncbi數(shù)據(jù)庫中核酸序列登錄號為nm_001180228)的質(zhì)粒的大腸桿菌。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述來源于escherichiacolibw25113的醇脫氫酶yahk編碼基因和來源于saccharomycescerevisiaes288c的醇脫氫酶sfa1編碼基因均根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性進(jìn)行密碼子優(yōu)化。在本發(fā)明具體實(shí)施方式中，所述來源于escherichiacolibw25113的醇脫氫酶yahk編碼基因根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性進(jìn)行密碼子優(yōu)化后的序列如seqidno:3所示；所述來源于saccharomycescerevisiaes288c的醇脫氫酶sfa1編碼基因根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性進(jìn)行密碼子優(yōu)化后的序列如seqidno:6所示。所述e.coli/pdh、e.coli/kdc和e.coli/adh三者濕菌體在生物催化體系中的濃度均為10-30g/l；在本發(fā)明具體實(shí)施過程中，所述e.coli/pdh、e.coli/kdc和e.coli/adh三者濕菌體在生物催化體系中的濃度依次為30g/l、20g/l、10g/l。同時(shí)，所述e.coli/pdh、e.coli/kdc和e.coli/adh三者濕菌體的質(zhì)量比為(1-3.2)：(1-3.2)：(1-3.2)；在本發(fā)明具體實(shí)施方式中，所述e.coli/pdh、e.coli/kdc和e.coli/adh三者濕菌體的質(zhì)量比為3:2:1或3.2:2:1.2(濃度為30g/l、20g/l、10g/l或32g/l、20g/l、12g/l，本發(fā)明中其他類似配比均可以轉(zhuǎn)化成g/l)。本發(fā)明所述e.coli/pdh、e.coli/kdc和e.coli/adh均為轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒的大腸桿菌，所述質(zhì)粒和大腸桿菌根據(jù)本發(fā)明所需要嵌入的三個(gè)外源基因，可選擇本領(lǐng)域常用的質(zhì)粒和大腸桿菌，在本發(fā)明具體實(shí)施方式中所述大腸桿菌選擇為e.colibl21(de3)，而質(zhì)粒為商品化質(zhì)粒pet28a載體質(zhì)粒。本發(fā)明所述生物催化體系一般為包括l-苯丙氨酸底物的反應(yīng)體系，在本發(fā)明中包括l-苯丙氨酸、nad和tpp，ph6.0-10.5的緩沖溶液；具體地，包括l-苯丙氨酸、1-10mm的nad和1-10mm的tpp，4-120mmph6.0-10.5的緩沖溶液；更具體地，包括5-50g/l的l-苯丙氨酸、3-8mm的nad、2-5mm的tpp和4-120mmph值6.0-10.5的緩沖溶液，所述ph值進(jìn)一步優(yōu)選為7.4-8.5。其中，所述緩沖溶液為pbs緩沖溶液、tris-hcl緩沖溶液、glycine-naoh緩沖液中的一種或兩種以上。在實(shí)際的制備過程中，本發(fā)明所述濕菌體可直接獨(dú)立選用所述緩沖溶液重懸后加入到生物催化體系。更具體地，可選擇ph為7.4的pbs緩沖溶液分別重懸三種濕菌體加入到生物催化反應(yīng)體系，終濃度為24-120mm(包括24、60、120mm)，或選擇ph為8.0的tris-hcl緩沖溶液分別重懸三種濕菌體加入到生物催化反應(yīng)體系，終濃度為24-120mm(包括24、60、120mm)；也可以將e.coli/pdh、e.coli/kdc和e.coli/adh濕菌體依次分別采用ph10.5glycine-naoh(終濃度12、30或60mm)、ph6.0pbs(終濃度8、20或40mm)、ph[7.0pbs(終濃度4、10或20mm)重懸，然后加入到生物催化體系中。在具體實(shí)施過程中，所述生物催化體系包括：(1)5-50g/l的l-苯丙氨酸、3mm的nad、2mm的tpp和ph6.0-10.5的緩沖溶液；(2)5-50g/l的l-苯丙氨酸、6mm的nad、4.4mm的tpp和ph6.0-10.5的緩沖溶液；(3)5g/l的l-苯丙氨酸、8mm的nad和4.4mm的tpp，ph6.0-10.5的緩沖溶液；或(4)5-50g/l的l-苯丙氨酸、3mm的nad、2.2mm的tpp和ph6.0-10.5的緩沖溶液；此外，上述生物催化體系可以包括所記載的組分，也可僅由所記載的組分組成。在本發(fā)明所述生物催化體系基礎(chǔ)上可進(jìn)一步包括金屬離子化合物，濃度可選擇為0.1-1mm，所述金屬離子化合物為mg2+、fe2+、ca2+或zn2+化合物，在具體實(shí)施過程中本發(fā)明選擇0.4mm的mg2+化合物，可通過加入mgso4來添加mg2+化合物。所述催化反應(yīng)在25-40℃/25-38℃/30-38℃、150-250r/min下進(jìn)行2-24h，其中溫度可具體選擇為30℃或35℃。本發(fā)明催化反應(yīng)在需要終止時(shí)可加入乙酸乙酯，同時(shí)乙酸乙酯也可用來萃取目標(biāo)產(chǎn)物。更為優(yōu)選地，本發(fā)明方法還包括在催化反應(yīng)過程中添加酸，維持催化反應(yīng)體系ph值為7-8。其中所述酸可選自稀硫酸、鹽酸、醋酸、草酸、檸檬酸等。采用本發(fā)明所述方法對l-苯丙氨酸進(jìn)行生物催化制備2-苯乙醇，結(jié)果顯示，不同配比不同反應(yīng)時(shí)間下的2-苯乙醇產(chǎn)量介于0.15-3.42g/l，其中，在e.coli/pdhbb、e.coli/kdca和e.coli/yahk質(zhì)量比為3:2:1條件下，5g/ll-phe在反應(yīng)24h能夠生成3.28g/l苯乙醇，且hplc測定結(jié)果顯示底物l-phe消耗完畢，底物l-phe的轉(zhuǎn)化率達(dá)到99％，苯乙醇的摩爾產(chǎn)率約89％。而不同的濕菌體組合也表現(xiàn)出不同的較高產(chǎn)量。同時(shí)，通過增加nad濃度、底物濃度、反應(yīng)溫度以及控制反應(yīng)ph和改變緩沖溶液，均可以在上述高產(chǎn)量的基礎(chǔ)上大幅度增加苯乙醇的產(chǎn)量，在本發(fā)明較佳的反應(yīng)體系中，苯乙醇的產(chǎn)量可高達(dá)15g/l以上。通過調(diào)整本發(fā)明采用的三種濕菌體配比，可在最低輔酶濃度下實(shí)現(xiàn)最高的苯乙醇產(chǎn)量，達(dá)到效益的最大化。此外，在添加有金屬離子化合物的情況下，其對催化反應(yīng)有一定促進(jìn)作用，可進(jìn)一步提高底物轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物產(chǎn)量?；谏鲜龅脑囼?yàn)結(jié)果，本發(fā)明提出了所述e.coli/pdh、e.coli/kdc和e.coli/adh在生物催化l-苯丙氨酸生成2-苯乙醇中的應(yīng)用，以及所述苯丙氨酸脫氫酶編碼基因、2-酮酸脫羧酶編碼基因和醇脫氫酶編碼基因在生物催化l-苯丙氨酸生成2-苯乙醇中的應(yīng)用。由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明以l-苯丙氨酸為底物，在反應(yīng)體系中通過添加轉(zhuǎn)化有苯丙氨酸脫氫酶基因、2-酮酸脫羧酶基因和醇脫氫酶基因的重組大腸桿菌，進(jìn)行生物脫氨、脫羧、還原三步催化反應(yīng)，生成產(chǎn)物苯乙醇，一次添加輔酶nad即可再循環(huán)利用，且無需額外添加多余酮酸和氫源，無多余副產(chǎn)物，達(dá)到較高的底物轉(zhuǎn)化率，顯著提高了苯乙醇的產(chǎn)量。附圖說明圖1所示為重組大腸桿菌異源表達(dá)苯丙氨酸脫氫酶(e.coli/pdhbb)的sds-page圖；其中，泳道“未”表示未添加iptg誘導(dǎo)劑時(shí)的全細(xì)胞蛋白，泳道“沉”表示添加iptg誘導(dǎo)后，菌體全細(xì)胞經(jīng)過超聲破碎后的沉淀蛋白，泳道“上”表示添加iptg誘導(dǎo)后，菌體全細(xì)胞經(jīng)過超聲破碎后的可溶蛋白；箭頭所指為目標(biāo)蛋白條帶。圖2所示為重組大腸桿菌異源表達(dá)2-酮酸脫羧酶(e.coli/kdca)的sds-page圖；其中，泳道“未”表示未添加iptg誘導(dǎo)劑時(shí)的全細(xì)胞蛋白，泳道“沉”表示添加iptg誘導(dǎo)后，菌體全細(xì)胞經(jīng)過超聲破碎后的沉淀蛋白，泳道“上”表示添加iptg誘導(dǎo)后，菌體全細(xì)胞經(jīng)過超聲破碎后的可溶蛋白，箭頭所指為目標(biāo)蛋白條帶。圖3所示重組大腸桿菌異源表達(dá)醇脫氫酶基因(e.coli/yahk)的sds-page圖；其中，泳道“未”表示未添加iptg誘導(dǎo)劑時(shí)的全細(xì)胞蛋白，泳道“沉”表示添加iptg誘導(dǎo)后，菌體全細(xì)胞經(jīng)過超聲破碎后的沉淀蛋白，泳道“上”表示添加iptg誘導(dǎo)后，菌體全細(xì)胞經(jīng)過超聲破碎后的可溶蛋白，箭頭所指為目標(biāo)蛋白條帶。圖4所示為重組大腸桿菌異源表達(dá)苯丙氨酸脫氫酶(e.coli/pdhti)的sds-page圖；其中，泳道“未”表示未添加iptg誘導(dǎo)劑時(shí)的全細(xì)胞蛋白，泳道“沉”表示添加iptg誘導(dǎo)后，菌體全細(xì)胞經(jīng)過超聲破碎后的沉淀蛋白，泳道“上”表示添加iptg誘導(dǎo)后，菌體全細(xì)胞經(jīng)過超聲破碎后的可溶蛋白；箭頭所指為目標(biāo)蛋白條帶。圖5所示為重組大腸桿菌異源表達(dá)2-酮酸脫羧酶(e.coli/kdcpsy)的sds-page圖；其中，泳道“未”表示未添加iptg誘導(dǎo)劑時(shí)的全細(xì)胞蛋白，泳道“沉”表示添加iptg誘導(dǎo)后，菌體全細(xì)胞經(jīng)過超聲破碎后的沉淀蛋白，泳道“上”表示添加iptg誘導(dǎo)后，菌體全細(xì)胞經(jīng)過超聲破碎后的可溶蛋白，箭頭所指為目標(biāo)蛋白條帶。圖6所示重組大腸桿菌異源表達(dá)醇脫氫酶基因(e.coli/sfa1)的sds-page圖；其中，泳道“未”表示未添加iptg誘導(dǎo)劑時(shí)的全細(xì)胞蛋白，泳道“沉”表示添加iptg誘導(dǎo)后，菌體全細(xì)胞經(jīng)過超聲破碎后的沉淀蛋白，泳道“上”表示添加iptg誘導(dǎo)后，菌體全細(xì)胞經(jīng)過超聲破碎后的可溶蛋白，箭頭所指為目標(biāo)蛋白條帶。具體實(shí)施方式本發(fā)明公開了一種生物催化生產(chǎn)2-苯乙醇的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明所述方法、基因、載體、重組菌株和相關(guān)應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的各技術(shù)方案進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。在本發(fā)明方法實(shí)施過程中，所述e.coli/pdhbb、e.coli/pdhti、e.coli/kdca、e.coli/kdcpsy、e.coli/yahk和e.coli/sfa1的濕菌體加入前，可通過lb培養(yǎng)基培養(yǎng)至od600為0.8-1.0之間時(shí)，在培養(yǎng)液中添加iptg誘導(dǎo)表達(dá)，添加量為0.1-1.0mm，誘導(dǎo)溫度20-38度。lb培養(yǎng)基成分為：10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/l氯化鈉，培養(yǎng)溫度為36-38℃下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。實(shí)施例1：e.coli/pdhbb菌株的構(gòu)建1、pdhbb基因序列合成及表達(dá)載體構(gòu)建本實(shí)施例中涉及的pdhbb基因，其序列長度為1143bp，ncbi數(shù)據(jù)庫中的登錄號為d45211，來源于bacillusbadiusiam11059，該序列由蘇州金唯智生物科技有限公司全基因序列合成。全合成pdhbb基因5’端添加核酸限制性內(nèi)切酶ecori識別位點(diǎn)(5’-gaattc-3’)，3’端添加核酸限制性內(nèi)切酶noti識別位點(diǎn)(5’-gcggccgc-3’)，并克隆到載體puc57上得到載體puc57-pdhbb。pdhbb基因目標(biāo)片段產(chǎn)物回收：質(zhì)粒puc57-pdhbb用限制性內(nèi)切酶ecor1和not1酶切處理2h，經(jīng)過1％瓊脂糖凝膠電泳后，切下目標(biāo)條帶，用tiangen普通瓊脂糖凝膠dna回收試劑盒回收。pdhbb基因目標(biāo)片段連接：限制性內(nèi)切酶ecor1和not1酶切處理后pdhbb基因目標(biāo)片段，回收后連接至同樣酶處理的pet28a載體。限制性內(nèi)切酶、dna連接酶購自thermofisher。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化：采用cacl2法制備感受態(tài)細(xì)胞。42℃熱擊法轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物至e.colidh5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取單克隆，培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒，測序驗(yàn)證正確的質(zhì)粒熱擊轉(zhuǎn)化至e.colibl21(de3)中。再次挑取單克隆，抽取質(zhì)粒驗(yàn)證陽性克隆，e.coli/pdhbb菌株保存在終濃度20％-25％的甘油中，-80℃冰箱保存。2、pdhbb基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)將含有重組質(zhì)粒的e.coli/pdhbb菌液以1％接種量接入含50μg/ml硫酸卡那霉素(kan)的lb液體培養(yǎng)基(0.5％酵母提取物，1％胰蛋白胨，1％nacl，ph7.0，121℃滅菌20min)，36-38℃，250rpm培養(yǎng)至od600為0.8～1.0，加入不同濃度的iptg，在20～38℃不同溫度條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。采用sds-page檢測目的蛋白表達(dá)量。3、pdhbb蛋白表達(dá)的檢測本發(fā)明中sds-page采用12％凝膠的電泳方案，具體操作步驟參照標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行?？捡R斯亮藍(lán)染色、脫色實(shí)驗(yàn)按照標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行，結(jié)果見圖1，圖1結(jié)果說明重組的苯丙氨酸脫氫酶pdhbb在大腸桿菌中以可溶的形式成功表達(dá)，不可溶的部分應(yīng)為細(xì)胞破碎不完全所致，不影響本發(fā)明中所述實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例2：e.coli/kdca菌株的構(gòu)建本實(shí)施例中涉及的kdca基因，其序列長度為1644bp，ncbi數(shù)據(jù)庫中的登錄號為ay548760，來源于lactococcuslactis，該序列由蘇州金唯智生物科技有限公司全基因序列合成。全合成kdca基因5’端添加核酸限制性內(nèi)切酶ecori識別位點(diǎn)(5’-gaattc-3’)，3’端添加核酸限制性內(nèi)切酶noti識別位點(diǎn)(5’-gcggccgc-3’)，并克隆到載體puc57上得到載體puc57-kdca。kdca基因表達(dá)載體構(gòu)建：kdca目標(biāo)基因酶切處理、產(chǎn)物回收、連接轉(zhuǎn)化等參照實(shí)施例1。iptg誘導(dǎo)表達(dá)，sds-page蛋白表達(dá)鑒定，實(shí)驗(yàn)操作參照實(shí)施例1，結(jié)果見圖2。圖2結(jié)果說明重組的2-酮酸脫羧酶kdca在大腸桿菌中以可溶的形式成功表達(dá)，不可溶的部分應(yīng)為細(xì)胞破碎不完全所致，不影響本發(fā)明中所述實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例3：e.coli/yahk菌株的構(gòu)建本實(shí)施例中涉及的yahk基因，其序列長度為1638bp，ncbi數(shù)據(jù)庫中的登錄號為944975，來源于escherichiacolibw25113，該序列由蘇州金唯智生物科技有限公司全基因序列合成。全合成yahk基因5’端添加核酸限制性內(nèi)切酶ecori識別位點(diǎn)(5’-gaattc-3’)，3’端添加核酸限制性內(nèi)切酶noti識別位點(diǎn)(5’-gcggccgc-3’)，并克隆到載體puc57上得到載體puc57-yahk。yahk基因表達(dá)載體構(gòu)建：yahk目標(biāo)基因酶切處理、產(chǎn)物回收、連接轉(zhuǎn)化等參照實(shí)施例1。iptg誘導(dǎo)表達(dá)，sds-page蛋白表達(dá)鑒定，實(shí)驗(yàn)操作參照實(shí)施例1，結(jié)果見圖3。圖3結(jié)果說明重組的醇脫氫酶yahk大腸桿菌中以可溶的形式成功表達(dá)，不可溶的部分應(yīng)為細(xì)胞破碎不完全所致，不影響本發(fā)明中所述實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例4：e.coli/pdhti菌株的構(gòu)建本實(shí)施例中涉及的pdhti基因，其序列長度為1101bp，ncbi數(shù)據(jù)庫中的登錄號為d00631，來源于thermoactinomycesintermediusifo14230，該序列由蘇州金唯智生物科技有限公司全基因序列合成。全合成pdhti基因5’端添加核酸限制性內(nèi)切酶ecori識別位點(diǎn)(5’-gaattc-3’)，3’端添加核酸限制性內(nèi)切酶noti識別位點(diǎn)(5’-gcggccgc-3’)，并克隆到載體puc57上得到載體puc57-pdhti。pdhti基因表達(dá)載體構(gòu)建：pdhti目標(biāo)基因酶切處理、產(chǎn)物回收、連接轉(zhuǎn)化等參照實(shí)施例1。iptg誘導(dǎo)表達(dá)，sds-page蛋白表達(dá)鑒定，實(shí)驗(yàn)操作參照實(shí)施例1，結(jié)果見圖4。圖4結(jié)果說明重組的醇脫氫酶pdhti大腸桿菌中以可溶的形式成功表達(dá)，不可溶的部分應(yīng)為細(xì)胞破碎不完全所致，不影響本發(fā)明中所述實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例5：e.coli/kdcpsy菌株的構(gòu)建本實(shí)施例中涉及的kdcpsy基因，其序列長度為1671bp，ncbi數(shù)據(jù)庫中的登錄號為yp_580229，來源于escherichiacolibw25113，該序列由蘇州金唯智生物科技有限公司全基因序列合成。全合成kdcpsy基因5’端添加核酸限制性內(nèi)切酶ecori識別位點(diǎn)(5’-gaattc-3’)，3’端添加核酸限制性內(nèi)切酶noti識別位點(diǎn)(5’-gcggccgc-3’)，并克隆到載體puc57上得到載體puc57-kdcpsy。kdcpsy基因表達(dá)載體構(gòu)建：kdcpsy目標(biāo)基因酶切處理、產(chǎn)物回收、連接轉(zhuǎn)化等參照實(shí)施例1。iptg誘導(dǎo)表達(dá)，sds-page蛋白表達(dá)鑒定，實(shí)驗(yàn)操作參照實(shí)施例1，結(jié)果見圖5。圖5結(jié)果說明重組的醇脫氫酶kdcpsy大腸桿菌中以可溶的形式成功表達(dá)，不可溶的部分應(yīng)為細(xì)胞破碎不完全所致，不影響本發(fā)明中所述實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例6：e.coli/sfa1菌株的構(gòu)建本實(shí)施例中涉及的sfa1基因，其序列長度為1161bp，ncbi數(shù)據(jù)庫中的登錄號為nm_001180228，來源于saccharomycescerevisiaes288c，該序列由蘇州金唯智生物科技有限公司全基因序列合成。全合成sfa1基因5’端添加核酸限制性內(nèi)切酶ecori識別位點(diǎn)(5’-gaattc-3’)，3’端添加核酸限制性內(nèi)切酶noti識別位點(diǎn)(5’-gcggccgc-3’)，并克隆到載體puc57上得到載體puc57-sfa1。sfa1基因表達(dá)載體構(gòu)建：sfa1目標(biāo)基因酶切處理、產(chǎn)物回收、連接轉(zhuǎn)化等參照實(shí)施例1。iptg誘導(dǎo)表達(dá)，sds-page蛋白表達(dá)鑒定，實(shí)驗(yàn)操作參照實(shí)施例1，結(jié)果見圖6。圖6結(jié)果說明重組的醇脫氫酶sfa1大腸桿菌中以可溶的形式成功表達(dá)，不可溶的部分應(yīng)為細(xì)胞破碎不完全所致，不影響本發(fā)明中所述實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例7：本發(fā)明所述方法搖瓶試驗(yàn)將重組大腸桿菌e.coli/pdhbb、e.coli/pdhti、e.coli/kdca、e.coli/kdcpsy、e.coli/yahk、e.coli/sfa1經(jīng)過iptg誘導(dǎo)表達(dá)、離心收集的菌沉備用；底物l-phe現(xiàn)用現(xiàn)配；nad(配置30mm母液，現(xiàn)用現(xiàn)配)；tpp(配置20mm母液，現(xiàn)用現(xiàn)配)；glycine-naoh100mmph10.5，磷酸鹽緩沖液100mmph6.0和ph7.0。操作過程如下：(1)收集重組大腸桿菌，按下表按照100g/l菌體濃度添加適量的緩沖液；表3重組大腸桿菌重懸所用緩沖液e.coli/pdhbb、e.coli/pdhti100mmglycine-naohph10.5e.coli/kdca、e.coli/kdcpsy100mmph6.0磷酸鹽緩沖液e.coli/yahk、e.coli/sfa1100mmph7.0磷酸鹽緩沖液(2)反應(yīng)體系配置配置不同體積的反應(yīng)體系，各組分的終濃度如下表所示，10ml、25ml、50ml的反應(yīng)體系配置方法如下表所示。表4(3)反應(yīng)體系混勻后，25-38℃，100-250rpm，搖床反應(yīng)，反應(yīng)過程不控ph，反應(yīng)結(jié)束后檢測反應(yīng)液ph值為8～9。(4)反應(yīng)的檢測與監(jiān)控反應(yīng)液10000g離心5min，hplc液相檢測苯乙醇含量。反應(yīng)兩個(gè)小時(shí)后苯乙醇的產(chǎn)量及摩爾產(chǎn)率如下表所示：表5實(shí)施例8：e.coli/pdhbb、e.coli/kdca、e.coli/yahk不同配比催化制備苯乙醇生物催化反應(yīng)體系配置過程參照實(shí)施例7中25ml催化反應(yīng)體系。因e.coli/pdhbb、e.coli/kdca、e.coli/yahk各自的催化劑pdhbb、kdca和yahk的催化效率不一致，因此設(shè)計(jì)了不同菌體細(xì)胞投入量的多個(gè)配比。選擇3個(gè)取樣點(diǎn)，分別是2h、19h和24h，hplc測定苯乙醇含量如下表所示。表6根據(jù)表6結(jié)果可知，按照本發(fā)明方法進(jìn)行催化反應(yīng)，所制備的苯乙醇產(chǎn)量較高；其中在e.coli/pdhbb、e.coli/kdca、e.coli/yahk質(zhì)量比為3:2:1條件下，5g/ll-phe在反應(yīng)24h能夠生成3.28g/l苯乙醇，hplc鑒定結(jié)果顯示l-phe已消耗完畢，底物的轉(zhuǎn)化率達(dá)到99％，苯乙醇的摩爾產(chǎn)率約89％。實(shí)施例9：e.coli/pdhbb、e.coli/kdca、e.coli/yahk的比例及輔酶nad的用量苯乙醇產(chǎn)量的影響25ml反應(yīng)體系，緩沖液配置同實(shí)例7，三種酶采用不同緩沖液，緩沖液用量同實(shí)例7的25ml體系，苯丙氨酸用量30g/l。反應(yīng)溫度30℃，反應(yīng)過程不控ph，反應(yīng)結(jié)束后檢測反應(yīng)液ph值為8～9。反應(yīng)中控?cái)?shù)據(jù)見下表。表7根據(jù)表7結(jié)果可知，按照本發(fā)明方法進(jìn)行催化反應(yīng)，通過增加e.coli/pdhbb、e.coli/yahk的比例及輔酶nad的用量，所制備的苯乙醇產(chǎn)量提高到7.0～8.4g/l；實(shí)施例10：改變不同底物量進(jìn)行酶催化制備苯乙醇。10ml反應(yīng)體系，緩沖液配置同實(shí)例7，三種濕菌體(e.coli/pdhbb、e.coli/kdca、e.coli/yahk)采用不同緩沖液，緩沖液用量同實(shí)例7的10ml體系，反應(yīng)溫度30℃，反應(yīng)過程不控ph，反應(yīng)結(jié)束后檢測反應(yīng)液ph值為8～9。反應(yīng)中控?cái)?shù)據(jù)見下表。表8根據(jù)表8結(jié)果可知，按照本發(fā)明方法進(jìn)行催化反應(yīng)，通過增加底物苯丙氨酸用量，可提高苯乙醇產(chǎn)量，達(dá)到7g/l。實(shí)施例11：通過改變緩沖液的不同種類進(jìn)行酶催化制備苯乙醇采用實(shí)施例7的10ml反應(yīng)體系,苯丙氨酸用量30g/l。反應(yīng)溫度30℃，反應(yīng)過程不控ph，反應(yīng)結(jié)束后檢測反應(yīng)液ph值為8～9，緩沖液終濃度與實(shí)施例7中10ml反應(yīng)體系相同。反應(yīng)中控?cái)?shù)據(jù)見下表。表8根據(jù)表8結(jié)果可知，按照本發(fā)明方法進(jìn)行催化反應(yīng)，通過改變反應(yīng)體系緩沖溶液，選用單一的pbs緩沖溶液或tris-hcl緩沖溶液重懸濕菌體加入到反應(yīng)體系，苯乙醇產(chǎn)量有適當(dāng)提高，達(dá)到7.0-8.6g/l；實(shí)施例12：通過改變酶催化過程中ph值制備苯乙醇10ml反應(yīng)體系，緩沖液配置同實(shí)施例7，三種酶采用不同緩沖液，緩沖液用量同實(shí)施例7的10ml體系,苯丙氨酸用量30g/l。反應(yīng)溫度30℃，反應(yīng)過程通過補(bǔ)加酸調(diào)節(jié)ph至7～8，本實(shí)施例采用10％檸檬酸，但不限制其它種類酸：稀硫酸、鹽酸、醋酸、草酸等。反應(yīng)中控?cái)?shù)據(jù)見下表。表9根據(jù)表9結(jié)果可知，按照本發(fā)明方法進(jìn)行催化反應(yīng)，通過調(diào)節(jié)催化過程中ph值至7～8,所制備的苯乙醇產(chǎn)量提高到9.6-11.1g/l；按照本實(shí)施例方法采用其他酸來控制ph值為7-8，結(jié)果苯乙醇產(chǎn)量同樣得到大幅度提升。實(shí)施例13：通過改變酶催化過程中的溫度制備苯乙醇10ml反應(yīng)體系，緩沖液配置同實(shí)例7，三種濕菌體(e.coli/pdhbb、e.coli/kdca、e.coli/yahk)采用不同緩沖液，緩沖液用量同實(shí)例7的10ml體系,苯丙氨酸用量30g/l。改變不同反應(yīng)溫度，反應(yīng)過程通過補(bǔ)加10％檸檬酸酸調(diào)節(jié)ph至7～8。反應(yīng)中控?cái)?shù)據(jù)見下表。表10根據(jù)表10結(jié)果可知，按照本發(fā)明方法進(jìn)行催化反應(yīng)，提高反應(yīng)溫度至35℃，補(bǔ)加檸檬酸來調(diào)節(jié)酶催化過程中ph值至7～8,所制備的苯乙醇產(chǎn)量提高到15.5g/l。實(shí)施例14：添加金屬離子mg2+對催化反應(yīng)的影響生物催化反應(yīng)體系配置過程參照實(shí)施例7中25ml催化反應(yīng)體系，在e.coli/pdhbb、e.coli/kdca、e.coli/yahk比例3:2:1反應(yīng)條件下，添加不同濃度的mgso4，考察對反應(yīng)的影響，結(jié)果如下表：表11由表11可知，添加0.4mm的mgso4對本發(fā)明中的生物催化反應(yīng)有一定的促進(jìn)作用。實(shí)施例15：添加氨吸附劑對催化反應(yīng)的影響生物催化反應(yīng)體系配置過程參照實(shí)施例7中25ml催化反應(yīng)體系，在反應(yīng)體系中添加0.3g沸石，補(bǔ)加檸檬酸來調(diào)節(jié)酶催化過程中ph值至7～8。反應(yīng)中控?cái)?shù)據(jù)見下表。表12由表12可知，添加添加0.3g的沸石對本發(fā)明中的生物催化反應(yīng)未見明顯促進(jìn)作用，可能原因是反應(yīng)體系小，產(chǎn)生的氨已揮發(fā)，剩余的氨不足以影響酶催化過程，對于更大的反應(yīng)體系有待進(jìn)一步研究。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。sequencelisting<110>波頓（上海）生物技術(shù)有限公司<120>一種生物催化生產(chǎn)2-苯乙醇的方法<130>mp1622949<160>6<170>patentinversion3.3<210>1<211>1143<212>dna<213>人工序列<400>1atgagcttagtagaaaaaacatccatcataaaagatttcactctttttgaaaaaatgtct60gaacatgaacaagttgttttttgcaacgatccggcgacaggactaagggccattatcgct120attcatgacaccacactcggacctgcgctcggcggctgccgcatgcagccttataacagt180gtggaagaagcattggaagatgctcttcgcctttccaaaggaatgacttacaaatgcgcg240gcgtccgatgtcgactttggcggcggaaaagcagtcattatcggtgatccgcagaaagat300aaatctccagaactgttccgcgcgtttggccaatttgttgattcgcttggcggccgtttc360tatacaggtactgatatgggaacgaatatggaagatttcattcacgccatgaaagaaaca420aactgcattgttggggtgccggaagcttacggcggcggcggagattcctctattccaact480gccatgggtgtcctgtacggcattaaagcaaccaacaaaatgttgtttggcaaggacgat540cttggcggcgtcacttatgccattcaaggacttggcaaagtaggctacaaagtagcggaa600gggctgctcgaagaaggtgctcatttatttgtaacggatattaacgagcaaacgttggag660gctatccaggaaaaagcaaaaacaacatccggttctgtcacggtagtagcgagcgatgaa720atttattcccaggaagccgatgtgttcgttccgtgtgcatttggcggcgttgttaatgat780gaaacgatgaagcagttcaaggtgaaagcaatcgccggttcagccaacaatcagctgctt840acggaggatcacggcagacaccttgcagacaaaggcattctgtatgctccggattatatt900gttaactctggcggtctgatccaagtagccgacgaattgtatgaggtgaacaaagaacgc960gtgcttgcgaagacgaagcatatttacgacgcaattcttgaagtgtaccagcaagcggaa1020ttagatcaaatcaccacaatggaagcagccaacagaatgtgtgagcaaagaatggcggca1080agaggccgacgcaacagcttctttacttcttctgttaagccaaaatgggatattcgcaac1140taa1143<210>2<211>1644<212>dna<213>人工序列<400>2atgtatacagtaggagattacctgttagaccgattacacgagttgggaattgaagaaatt60tttggagttcctggtgactataacttacaatttttagatcaaattatttcacgcgaagat120atgaaatggattggaaatgctaatgaattaaatgcttcttatatggctgatggttatgct180cgtactaaaaaagctgccgcatttctcaccacatttggagtcggcgaattgagtgcgatc240aatggactggcaggaagttatgccgaaaatttaccagtagtagaaattgttggttcacca300acttcaaaagtacaaaatgacggaaaatttgtccatcatacactagcagatggtgatttt360aaacactttatgaagatgcatgaacctgttacagcagcgcggactttactgacagcagaa420aatgccacatatgaaattgaccgagtactttctcaattactaaaagaaagaaaaccagtc480tatattaacttaccagtcgatgttgctgcagcaaaagcagagaagcctgcattatcttta540gaaaaagaaagctctacaacaaatacaactgaacaagtgattttgagtaagattgaagaa600agtttgaaaaatgcccaaaaaccagtagtgattgcaggacacgaagtaattagttttggt660ttagaaaaaacggtaactcagtttgtttcagaaacaaaactaccgattacgacactaaat720tttggtaaaagtgctgttgatgaatctttgccctcatttttaggaatatataacgggaaa780ctttcagaaatcagtcttaaaaattttgtggagtccgcagactttatcctaatgcttgga840gtgaagcttacggactcctcaacaggtgcattcacacatcatttagatgaaaataaaatg900atttcactaaacatagatgaaggaataattttcaataaagtggtagaagattttgatttt960agagcagtggtttcttctttatcagaattaaaaggaatagaatatgaaggacaatatatt1020gataagcaatatgaagaatttattccatcaagtgctcccttatcacaagaccgtctatgg1080caggcagttgaaagtttgactcaaagcaatgaaacaatcgttgctgaacaaggaacctca1140ttttttggagcttcaacaattttcttaaaatcaaatagtcgttttattggacaaccttta1200tggggttctattggatatacttttccagcggctttaggaagccaaattgcggataaagag1260agcagacaccttttatttattggtgatggttcacttcaacttaccgtacaagaattagga1320ctatcaatcagagaaaaactcaatccaatttgttttatcataaataatgatggttataca1380gttgaaagagaaatccacggacctactcaaagttataacgacattccaatgtggaattac1440tcgaaattaccagaaacatttggagcaacagaagatcgtgtagtatcaaaaattgttaga1500acagagaatgaatttgtgtctgtcatgaaagaagcccaagcagatgtcaatagaatgtat1560tggatagaactagttttggaaaaagaagatgcgccaaaattactgaaaaaaatgggtaaa1620ttatttgctgagcaaaataaatag1644<210>3<211>1638<212>dna<213>人工序列<400>3atgaagctggccgaagccttgctgcgcgcgctgaaggatcgcggcgcacaggccatgttc60gggattccgggcgatttcgccttgcccttcttcaaggtggcggaggaaacgcagatcctg120ccgctccacacgctgagccacgagccggcggtgggcttcgcggcggacgcggcggcgcgc180tacagctccactctaggggtggcggcggtcacctacggggcgggcgccttcaacatggtg240aatgcggtggccggcgcctacgccgagaagtcgccggtcgtcgtcatctccggcgcgccg300ggcacgacggagggcaacgccggcctgctgctggaccaccagggccgcacgctggacacg360cagttccaggtgttcaaggagatcaccgtggcccaggcccggctggacgacccggccaag420gccccggcggagatcgcccgcgtgctgggggccgcccgctccctgtcgcgcccggtctat480ctggaaatcccccgcaacatggtcaacgccgaggtcgagccggtgggcgacgaccccgcc540tggccggtggaccgcgacgcgctggccgcctgcgcggacgaggtgctggcggccatgcgc600tcggccacgtccccggtgctgatggtctgcgtgaggtccgccgctacggggctggaggcc660aaggtggcggacgtggcgcacgggctgggcgtgccggtggtcaccaccttcatggggcgc720ggcctgctggccgacgcgccgaccccgccgctcggcacctacatcggcgttgccggcgac780gcggagatcacccggctggtcgaggagtcggacgggctgttcctgctcggcgccatcctc840agcgacacaaacttcgcggtgtcccagcgcaagatcgacctgcgcaagaccatccacgcc900ttcgaccgggcggtgacgctgggctatcacacctacgccgacatcccgctggacgggctg960gtggacgcgctgctggagcggctgccgccgtccgaccgcacgacgcgcggcaaggaaccc1020cacgcctacccgaccggccttcaggccgacgacggccccatcgcaccgatggacatcgcc1080cgtgccgtcaacgaccgcgtgcgcgccgggcaggagccgctgctgatcgcggcggacatg1140ggcgactgcctgttcaccgccatggacatgatcgaccgcgggctgatggcgccgggctat1200tacgcgggcatgggcttcggcgtgccggcgggcatcggggcgcagtgcgtgtcgggcggc1260aagcgcatcctgacggtggtcggcgacggcgccttccagatgaccgggtgggagcttggc1320aactgccgacggctgggcatcgaccccatcgtgatcctgttcaacaacgccagttgggag1380atcgtgcgcaccttccagcccgaatccgccttcaatgacctggacgactggcggttcgcc1440gagatggcggcgggcatgggcggcgacggtgtccgtgtgcgcacgcgggcggagctgaag1500gcggcgctggacaaggccttcgccacgcgcgggcgcttccagctgatcgaggcgatgatc1560ccccgcggcgtgctgtccgacacgctggcccgcttcgtccaggggcagaagcgcctgcac1620gccgcgccccgggaataa1638<210>4<211>1101<212>dna<213>人工序列<400>4atgcgtgatgttttcgagatgatggaccgctacggtcatgagcaggtgatcttttgccgt60catcctcaaaccggcctgaaggccattatcgccctgcataataccaccgcaggtccggcc120ctgggtggttgccgtatgatcccgtacgccagcaccgacgaggcactggaagatgtgctg180cgcctgagcaaaggtatgacctacaaatgcagcctggccgacgtggattttggcggtggc240aagatggtgatcatcggcgacccgaagaaagacaaaagcccggaactgttccgcgttatc300ggtcgcttcgtgggtggtctgaacggtcgcttctataccggcacagatatgggcaccaat360ccggaggattttgtgcatgccgcccgcgagagcaaaagttttgccggcctgccgaagagc420tatggcggtaaaggtgataccagcattccgaccgccctgggcgtgtttcacggcatgcgt480gcaaccgcccgtttcctgtggggtaccgatcaactgaaaggccgtgtggtggccatccag540ggtgttggcaaagtgggcgaacgcctgctgcagctgttagtggaggttggcgcctactgt600aagattgcagatattgatagcgtgcgctgcgagcagctgaaagagaaatacggcgacaag660gtgcaactggttgacgtgaaccgtatccacaaggagagttgcgacatctttagcccttgc720gcaaaaggtggcgtggttaacgatgacaccatcgacgagttccgctgcctggccatcgtg780ggtagcgcaaacaatcagctggtggaagatcgtcacggtgccctgctgcagaaacgcagc840atttgctatgccccggattatctggtgaacgcaggcggcctgattcaggttgccgatgaa900ctggaaggctttcacgaggaacgcgtgctggccaaaaccgaagccatctatgacatggtg960ctggacatcttccatcgcgccaagaacgagaacattaccacctgtgaggccgccgatcgt1020attgtgatggagcgcctgaagaagctgaccgatattcgccgcattctgctggaggaccct1080cgtaacagcgcacgtcgctaa1101<210>5<211>1671<212>dna<213>人工序列<400>5atgagtcaacaatataccattgccgactacctgtttgaccgcgttgcagaagccggcgca60agcgaagtgtttggcgtgccgggcgacttcaacctgacctttctggacaacgtgctggca120agcgacaaactgcgctgggtgggtaatacaaacgaactgaacgccggttatgcagccgat180ggctatgcccgtgagcgtggctttgccgcaatggtgaccacatttggcgttggtgaactg240agcgcaatcaatgccacagccggcagttttgccgagtatgcaccggtgctgcacatcgtt300ggtgcaccgagtaccgccctgcaggatagtaagcgtcgcattcaccacagcctgggtgac360ggtgttttcaatcacttcatcaagatggtggaacctgtgaccgttgcccgtgcacaaatc420acaccggaaaacgcagcaagcgagatcgaccgcgtgatccgcgttatcctgaaaaaacac480cgcccgggttacttactgctgagcccggacgtggccaaaacaccgatttatccgccgacc540accaagctgatcgacagtgaggaagacatcaccagccaggccgcactggccgatttcaaa600caggccctgattgagttcctgccgaataaaaccacaaccctgatggcagatctgatggtg660caccgtctgggcctgcagaatcagctgaaagcactgattgccgacacagacatcccgtat720accaccctgagttggggtaagaccctgctggacgagaatagcgaacgttgggccggtacc780tatgccggtgtggccagccgcccggtggttaaagatatggtggaaaattgtgaatgctta840atcaaaattggcgtgcagtatacagacaccaccacagccggtttcagccaagacatcgat900gagaacgtggttgtggatctgcactacgaacgtgccagcattgccggcaaaaatttcgcc960ccgatcgcactgaaagatgccctgaaaaccctgcatgaagtgatgaccagcgatatcaac1020atcgtgccgaagcagttctgcgaggaagtgaaacagcacgaacaacatggtaaagacaat1080gaagccatccgccaggacgatctgtggcacatcattgcagacgccctggatgataaaaat1140ctggtttttagcgaacagggtaccgcctacttcggcattagcgatgttcgtctgccggaa1200ggtgttaccagctatggtcagccgatgtggggtagcatcggttataccctgcctgcaagc1260ctgggtggcgccattgccagccctcacaaacgcagcatcctgctgatcggtgatggtagc1320gccctgctgaccatccaggagatcgccgtgatgattcaagaacgcattaatccggtgatt1380gtgctgattaacaacgacggctataccgtggagcgtgcaatccacggcgaaaatcagtac1440tacaatgatatcccgaaatgcgactggcagctgatgccgaaagcctttggtgccaatgcc1500aacaatagtctgctgctgaaagccgaaaccgccggcgaactgaaagacgccctgaagcag1560gccgcagccgcaaaagataaactggtgatgctggaagtgattgccggcaagcacgatatt1620ccgccgctgctggccgatatcagcgcagccctgaaacctaagaacgattaa1671<210>6<211>1161<212>dna<213>人工序列<400>6atgtccgccgctactgttggtaaacctattaagtgcattgctgctgttgcgtatgatgcg60aagaaaccattaagtgttgaagaaatcacggtagacgccccaaaagcgcacgaagtacgt120atcaaaattgaatatactgctgtatgccacactgatgcgtacactttatcaggctctgat180ccagaaggacttttcccttgcgttctgggccacgaaggagccggtatcgtagaatctgta240ggcgatgatgtcataacagttaagcctggtgatcatgttattgctttgtacactgctgag300tgtggcaaatgtaagttctgtacttccggtaaaaccaacttatgtggtgctgttagagct360actcaagggaaaggtgtaatgcctgatgggaccacaagatttcataatgcgaaaggtgaa420gatatataccatttcatgggttgctctactttttccgaatatactgtggtggcagatgtc480tctgtggttgccatcgatccaaaagctcccttggatgctgcctgtttactgggttgtggt540gttactactggttttggggcggctcttaagacagctaatgtgcaaaaaggcgataccgtt600gcagtatttggctgcgggactgtaggactctccgttatccaaggtgcaaagttaaggggc660gcttccaagatcattgccattgacattaacaataagaaaaaacaatattgttctcaattt720ggtgccacggattttgttaatcccaaggaagatttggccaaagatcaaactatcgttgaa780aagttaattgaaatgactgatgggggtctggattttacttttgactgtactggtaatacc840aaaattatgagagatgctttggaagcctgtcataaaggttggggtcaatctattatcatt900ggtgtggctgccgctggtgaagaaatttctacaaggccgttccagctggtcactggtaga960gtgtggaaaggctctgcttttggtggcatcaaaggtagatccgaaatgggcggtttaatt1020aaagactatcaaaaaggtgccttaaaagtcgaagaatttatcactcacaggagaccattc1080aaagaaatcaatcaagcctttgaagatttgcataacggtgattgcttaagaaccgtcttg1140aagtctgatgaaataaaatag1161當(dāng)前第1頁12