本申請是申請日為2013年10月12日、申請?zhí)枮?01310490925.4和發(fā)明名稱為“大豆gmcib1基因和gmcry2基因及其調(diào)控開花及衰老的作用”的發(fā)明專利申請的分案申請。

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及大豆gmcib1基因和gmcry2基因及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

自然界中，植物衰老研究已成為植物生命科學(xué)研究的重要問題之一。thimann等人1978年提出，植物衰老是生長發(fā)育過程中一系列的衰退過程(thimann,1978)。十幾年后roach提出衰老是隨著植物年齡的增長，生存和生殖能力逐漸降低的生理過程(roach等,1993)。1997年，nooden對這一概念進行了完善，提出衰老是植物體細胞程序性死亡的有序降解過程(nooden等,1997)。與植物其他衰老事件一樣，葉片衰老是發(fā)育的最后階段，最終葉片死亡，因此限制了葉片的生命周期和壽命。

葉片衰老調(diào)控進程的闡明有助于我們了解衰老現(xiàn)象和植物生命周期的生物學(xué)原理。植物葉片衰老的分子機制的探索在生物工程應(yīng)用中影響重大，例如提高植物產(chǎn)量，收后貯藏，逆境耐受性。

迄今為止，通過芯片分析在不同物種中發(fā)現(xiàn)大量的sags。很多基因可能編碼調(diào)控因子，這些調(diào)控因子可能是信號感應(yīng)器和傳導(dǎo)器的組成部分，例如轉(zhuǎn)錄因子和類受體激酶。這些調(diào)控基因的進一步研究可是一些重要的衰老調(diào)控基因被發(fā)現(xiàn)同時也為葉片衰老調(diào)控機制研究提供依據(jù)。wrky家族中，wrky53和wrky6與葉片衰老相關(guān)的功能被深入研究。wrky53在衰老早期表達上調(diào)但在后期表達量下降，表明wrky53在衰老早期起調(diào)控作用(hinderhoferk,2001)。wrky53包括其他sags的靶基因是脅迫相關(guān)基因以及轉(zhuǎn)錄因子包括其他wrky因子。wrky53敲除突變體的衰老被延遲，而誘導(dǎo)wrky53過表達則產(chǎn)生早衰，這表明wrky53是衰老的正調(diào)控子(miaoy,2004)。通過對wrky53介導(dǎo)的衰老調(diào)控通路的研究來探索wrky53的直接下游作用靶基因。另一個wrky家族轉(zhuǎn)錄因子wrky6，在葉片衰老和病原菌侵染中其表達量大幅上調(diào)(robatzeks,2002)。wrky6通過與啟動區(qū)的w-box結(jié)合來調(diào)控基因。很多wrky6相關(guān)基因包括衰老誘導(dǎo)的類受體激酶基因sirk與衰老和病原體響應(yīng)有關(guān)。雖然wrky6在病原菌防衛(wèi)和衰老中都起作用，但sirk僅在衰老階段表達。wrky6敲除突變會改變sags的表達但對衰老的影響不明顯。這是因為敲除突變體中sags表達的改變可能不足以對葉片衰老變化起到明顯作用。也可能是由于wrky家族成員而產(chǎn)生的功能冗余。

nac蛋白是植物特有的最大轉(zhuǎn)錄因子家族之一，擬南芥中該家族就有100多個成員。nac家族基因在胚芽和幼芽的分生組織發(fā)育，側(cè)根的形成，生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和防御響應(yīng)中起作用。20個nac轉(zhuǎn)錄因子的表達水平在自然衰老和黑暗誘導(dǎo)的衰老中顯著增加(guoy,2006)。nap編碼一個nac家族轉(zhuǎn)錄因子，t-dna敲除突變體atnap表現(xiàn)出衰老延遲表型?？梢奱tnap是葉片衰老的正調(diào)控子。水稻中atnap的同源基因在衰老葉片中也上調(diào)表達。nac家族成員間同源二聚化和異源二聚化是該轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控發(fā)育過程的重要分子機制，而這些機制也參與了nac轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的葉片衰老調(diào)控。這些基因的功能特點包括它們參與的信號通路以及調(diào)控基因的研究對于葉片衰老復(fù)雜分子通路的詮釋十分有價值。

另一個典型的sags是自噬基因，其功能在體內(nèi)已被研究。擬南芥自噬基因t-dna插入突變體，atapg7、atapg8、atapg18a表現(xiàn)出早衰現(xiàn)象(doellingjh,2002；hanaokah,2002；xiongy,2005)。這些突變體中衰老過程中營養(yǎng)的利用率比較低或者衰老所需的組分沒有被有效的提供，從而導(dǎo)致衰老提前。

植物開花調(diào)控途徑研究已有一百余年的歷史，目前至少有四條開花調(diào)控的信號途徑被確定，即光周期途徑、春化途徑、自主途徑和赤霉素途徑(amasino，1996；bernier,2005)。

植物生長過程中受很多外界環(huán)境影響，光是重要的環(huán)境因素之一。植物中主要有兩種光受體分別感受紅光/遠紅光和藍光的信號。擬南芥中的光受體研究進展較為突出，目前擬南芥中已發(fā)現(xiàn)的光受體：(1)吸收紅光/遠紅光(波長為600～750nm)的光受體即光敏色素(phya，phyb，phyc，phyd，phye)；(2)吸收藍光/uv-a(波長為320～500nm)的隱花色素(cry1，cry2)、向光素(phot1，phot2)以及l(fā)ov/f-box/kelchdomain蛋白(ztl，fkf，lkp2)；(3)uv-b(波長為282～320nm)受體uvr8。這些光受體、共同感受光信號，并與光合色素協(xié)同調(diào)控植物發(fā)育和能量產(chǎn)生。

植物響應(yīng)藍光早在兩個世紀前就有報道，1993年ahmad和ashmore在擬南芥中利用t-dna插入得到一類藍光不敏感突變體hy4。后來篩選cdna文庫最先分離到第一個藍光受體-隱花色素1(cry1)。1996年，擬南芥隱花色素2(cry2)也被分離得到。在擬南芥中還發(fā)現(xiàn)了無光形態(tài)建成功能的cry3(kleine等,2003；huang等,2006)。

隨后隱花色素在其他植物和其他物種如細菌、動物甚至人體內(nèi)被鑒定到。不同物種間隱花色素的同源性雖然有差別，但其功能與擬南芥很相似。即其n端序列與dna光解酶高度同源，大都行使光受體的功能。隱花色素可分為：cpd光裂解酶，6-4光裂解酶，植物隱花色素，動物隱花色素和cry-dash五個亞家族。cpd光裂解酶、6-4光裂解酶分別修復(fù)環(huán)丁烷嘧啶二聚體、嘧啶-嘧啶酮光產(chǎn)物(sancara,2003)。目前研究認為植物與動物隱花色素均沒有光裂解酶活性。cry-dash蛋白能夠直接綁定dna或rna，但是沒有光裂解酶的活性，可通過調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄來調(diào)控發(fā)育過程(hitomik,2000；brudlerr,2003；worthingtonen,2003)。但也有報道說體外的cry-dash蛋白，包括擬南芥cry3，能夠修復(fù)單鏈dna中的嘧啶二聚體(huangy,2006；selbycp,2006；klart,2007)。

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定其功能。隱花色素有兩個主要的結(jié)構(gòu)域，n端的類似于光解酶的phr區(qū)和c端不同氨基酸長度的延伸區(qū)cct。phr結(jié)構(gòu)域與光解酶相似性很高，能綁定隱花色素中的生色團且參與同源二聚化反應(yīng)中(cashmore等,1999；lin和shalitin,2003；lin和todo,2005)，cct結(jié)構(gòu)域可通過與蛋白質(zhì)的相互作用來傳遞光信號，是隱花色素的效應(yīng)區(qū)。

隱花色素被認為是由光解酶進化而來(sancara,2003)。光裂解酶是一類大的黃素蛋白家族能夠修復(fù)嘧啶二聚體(todo等,1996)。由于其作用底物的不同又可分為：修復(fù)環(huán)丁烷嘧啶二聚體的cpd光解酶(即光解酶)和修復(fù)6-4嘧啶-嘧啶光產(chǎn)物的6-4光解酶。

目前發(fā)現(xiàn)的光解酶均含兩個發(fā)色基團即催化基團-核黃素(fad)和捕光基團-四氫葉酸mthf或8-hdf。光裂解酶能結(jié)合到dna嘧啶二聚體上，這種結(jié)合不依賴于光。吸收一個光子后，光解酶啟動光修復(fù)反應(yīng)。

雖然隱花色素的phr域序列與光解酶在一級結(jié)構(gòu)上非常相似，均由兩部分結(jié)構(gòu)域構(gòu)成：n端α/β結(jié)構(gòu)域和c端α螺旋域，這兩個結(jié)構(gòu)域通過loop環(huán)相連。但兩者的高級結(jié)構(gòu)差異很大，因此在功能存在很大差別(brautigam等,2004；huang等,2006)，光解酶具有光修復(fù)功能，隱花色素不能與dna結(jié)合也沒有修復(fù)嘧啶二聚體的功能。

隱花色素與光解酶結(jié)構(gòu)間的差別主要體現(xiàn)在以下幾個方面：(1)atp結(jié)合能力。光解酶的fad結(jié)合區(qū)能結(jié)合dna，而隱花色素卻結(jié)合atp，前者主要行使修復(fù)嘧啶二聚體的功能，而后者atp滲入到fad通道的巢穴中，而磷酸基團靠近phr表面，這樣的構(gòu)象有利于隱花色素藍光依賴的磷酸化反應(yīng)。(2)表面所帶電荷不同。隱花色素表面多帶負電荷，而光解酶多帶正電荷，因而后者能結(jié)合帶負電荷的dna(huang等,2006)，表面電勢的差異恰好解釋了隱花色素為何不具備光裂解酶修復(fù)dna的活性。隱花色素負電荷的表面進一步支持了這樣一個假說，光照后磷酸化的隱花色素cct域會與phr域分開，導(dǎo)致構(gòu)象的改變，特異位點的暴露，使得依賴藍光的蛋白-蛋白相互作用產(chǎn)生，從而傳遞光信號。此外，phr區(qū)除了能捕捉光信號(能量)外還能形成同源二聚體，這對隱花色素正常行使功能至關(guān)重要(sang等,2005；yu等,2007a)。

隱花色素在c端有一個延伸區(qū)即cct結(jié)構(gòu)域。不同物種隱花色素cct序列上差別較大，但它們含有一個共同的基序-das基序(dqxvp-adidic-staesss)，此基序也是一個識別隱花色素的重要標識(lin和shalitin,2003)。cct結(jié)構(gòu)域是植物和動物隱花色素的功能效應(yīng)區(qū)，它們可為信號蛋白提供了結(jié)構(gòu)的可塑性，變化的結(jié)構(gòu)可提供更多的蛋白作用位點，或作用的特異性或親和性，能識別不同的信號成員或被不同調(diào)節(jié)蛋白識別，因此在細胞定位和蛋白相互作用中起到非常重要的作用(ahmad等,1998b；yang等,2000；wang等,2001；lin和todo,2005)。

植物隱花色素藍光依賴的磷酸化和降解途徑具體描述如下：

(1)擬南芥隱花色素藍光依賴的磷酸化過程

擬南芥隱花色素cry1和cry2都會被磷酸化，其主要有以下幾個特點：

1)藍光特異的磷酸化過程。將擬南芥黃化苗從黑暗轉(zhuǎn)移到藍光(>15μmolm-2s-1)下在短時間內(nèi)可檢測到隱花色素的磷酸化，而磷酸化活性在黃化苗中檢測不到。隱花色素藍光特異的磷酸化，隨著藍光強度和光照時間的增加磷酸化程度而隨之增加。轉(zhuǎn)移到紅光或遠紅光下的黃化苗中檢測不到磷酸化活性，黃化苗藍光處理后再轉(zhuǎn)到紅光或遠紅光下也會很快去磷酸化(shalitin等，2002,2003；yu等,2007b)。

2)磷酸化過程發(fā)生在隱花色素c端。體外實驗顯示，從大腸桿菌中表達的擬南芥cry1n端和c端蛋白經(jīng)純化后進行體外磷酸化檢測，結(jié)果顯示c端有明顯的磷酸化信號，而n端沒有；全長cry1的c端突變后磷酸化也會減少(ahmad等,1998b)。體內(nèi)試驗顯示，轉(zhuǎn)基因表達gus-cct融合蛋白引起擬南芥持續(xù)性光響應(yīng)，而gus-cct也是被持續(xù)磷酸化的轉(zhuǎn)基因表達gus-cct融合蛋白引起擬南芥持續(xù)性光響應(yīng)，而gus-cct也是被持續(xù)磷酸化的(ahmad等,1998a；yu等,2007b)。轉(zhuǎn)基因過表達gfp-cry2融合蛋白在擬南芥體內(nèi)具有依賴藍光的磷酸化現(xiàn)象，與內(nèi)源cry2一致。過表達cry2-gfp的擬南芥則具有持續(xù)性光響應(yīng)，同時該蛋白也擁有持續(xù)性的磷酸化過程。轉(zhuǎn)基因cry2-gr蛋白在沒有地塞米松的情況下定位于胞質(zhì)中，cry2-gr不被磷酸化，過表達的cry2不能恢復(fù)突變體的表型，加了地塞米松處理后，在gr的帶領(lǐng)下cry2定位到細胞核內(nèi)，能夠被磷酸化，且具有生理活性，恢復(fù)了突變體的正常表型(tessadorif,2007)。

學(xué)者們推測磷酸化的隱花色素cct表面負電荷打破了與phr的相互作用，從而影響了隱花色素與信號成員的互作(yu等,2007b；yang等,2000；liu等,2008；yu等,2009b)。

3)自主磷酸化。擬南芥隱花色素cry1與蛋白激酶沒有序列同源性，但是在體外顯示出自磷酸化活性。目前對于擬南芥隱花色素cry1體外自磷酸化的研究存在相反的結(jié)果，有研究報道它是藍光依賴的、藍光加強的，也有研究報道它是不依賴于藍光的(shalitind,2003；boulyjp,2003；ozgurs,2006)。撇開是否依賴藍光，至少這些實驗結(jié)果都證明了擬南芥cry1在體外具有自磷酸化活性。擬南芥cry1的自磷酸化是否足夠影響cry1的磷酸化，或cry1依賴藍光的磷酸化還需要其他激酶的輔助還不是很清楚。目前沒有關(guān)于擬南芥cry2自磷酸化的報道。

(2)擬南芥cry2蛋白依賴藍光的降解活性信號蛋白的一個重要特征就是蛋白的快速代謝從而使生物體恢復(fù)到信號刺激前的狀態(tài)。與光敏素phya經(jīng)歷依賴紅光的快速降解類似，隱花色素cry2也經(jīng)歷依賴藍光的快速降解，且是通過泛素化/26s蛋白酶體途徑(shalitin等,2002；yu等,2007b)，而隱花色素cry1不具備依賴藍光的降解活性(lin,1998；ahmadm,1998)。有研究顯示，在大豆中隱花色素cry1的降解依賴于藍光，而隱花色素cry2在藍光下不降解(zhang等,2008)。擬南芥cry2的降解依賴于fad，當cry2突變(cry2d387a)喪失結(jié)合fad的能力后，該突變的蛋白不再經(jīng)歷藍光誘導(dǎo)的降解過程(liu等,2008)。cry2的降解需要持續(xù)的高光強的藍光照射，cry2依賴藍光的降解活性同時需要phr域和cct域(ahmadm,1998)。與此結(jié)論一致，持續(xù)磷酸化的gus-cct2在藍光下不降解(yu,2007)。cry2的降解與e3連接酶cop1有關(guān)(wang,2001)，但是cop1不是cry2唯一的e3連接酶，因為cry2的降解在cop1功能降低的突變體cop1-4和cop1-6中被部分削弱，而在cop1無效等位基因突變體cop1-5中并沒有完全消失(shalitind,2002)。這些結(jié)果暗示cry2的降解有可能還牽涉到其他e3連接酶。

擬南芥隱花色素cry2的磷酸化和降解都是在核內(nèi)發(fā)生，cry2的磷酸化是cry2降解所必須的，cry2介導(dǎo)藍光對下胚軸生長的調(diào)控和光周期控制的開花也是在核內(nèi)，說明光受體cry2在核內(nèi)完成了它的整個翻譯后生活周期，從蛋白修飾到行使功能再到蛋白降解(yu,2009)。

從隱花色素cry1被發(fā)現(xiàn)起，cry1、它在擬南芥中的同源基因cry2、其他物種的同源基因cry廣泛的功能被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。擬南芥隱花色素的功能鑒定主要是通過遺傳學(xué)方法，分析cry1或cry2基因缺失型突變體cry1、cry2，以及過表達轉(zhuǎn)基因植株cry1、cry2的表型。這些研究證明擬南芥隱花色素cry1、cry2分別主要介導(dǎo)了藍光促進光形態(tài)的建成以及光周期控制的開花。當然，它們還介導(dǎo)了其他藍光響應(yīng),究竟隱花色素是如何協(xié)調(diào)體內(nèi)扮演的不同角色，其調(diào)控機理都需要進一步研究與闡明。隱花色素cry3t-dna插入突變體cry3沒有明顯的表型改變，其具體的生理功能還不是很清楚。目前的研究主要知道cry3具有修復(fù)單鏈dna的生化活性，有可能參與了細胞器基因組的保護。除了擬南芥，大部分物種(從細菌到人類)都發(fā)現(xiàn)了隱花色素的存在。隱花色素與生物鐘密切相關(guān)，最近的研究還表明，隱花色素與生物鐘不僅僅與農(nóng)作物產(chǎn)量有關(guān)，還影響了人類健康，包括癌癥、睡眠紊亂以及許多生理上的失調(diào)。了解隱花色素和藍光反應(yīng)的分子機制，不僅對初步了解生命的基本過程具有重大的意義，而且在農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥方面也具有一定的實用價值。

基因的功能往往與其亞細胞定位密切相關(guān)。擬南芥隱花色素cry1和cry2基因在被檢測過的所有細胞類型和所有細胞器中都有表達(ahmadm,1993；lin,1996；tothr,2001)。隱花色素全方位的表達與其調(diào)控多種信號途徑相關(guān)。用隱花色素內(nèi)源啟動子啟動熒光素酶報告基因的表達，結(jié)果顯示隱花色素mrna的表達幾乎不受藍光影響，但受生物鐘的調(diào)控，表達量在光下達到最高值，在暗中降到最低值(tothr,2001)。隱花色素cry1的蛋白水平不受光影響,cry2的蛋白水平則在藍光下降低(lin,1996)。蛋白水平的變化也與隱花色素依賴光強的活性相關(guān)。在細胞質(zhì)與細胞核中均能檢測到cry1的表達，其細胞中的表達量不受光的影響(wug,2007)。有報道稱核內(nèi)的cry1介導(dǎo)藍光促進膜的去極化、抑制下胚軸的生長，胞質(zhì)中的cry1介導(dǎo)藍光促進子葉的張開和根的生長(wug,2007)。與cry1不一樣，隱花色素cry2主要在核內(nèi)完成它的整個轉(zhuǎn)錄后過程，包括依賴藍光的磷酸化與降解(yu,2007)。核定位的cry2主要介導(dǎo)了對開花的誘導(dǎo)和對下胚軸生長的抑制(yu,2007)。也有報道稱核定位的cry2參與了基因的轉(zhuǎn)錄和細胞分裂間期染色質(zhì)的濃縮(tessadorif,2007；charronjb,2009)。由此可見，基因的定位為其功能提供了線索。

植物的光形態(tài)建成(又叫去黃化)包括幾個形態(tài)學(xué)改變：下胚軸生長抑制、子葉擴張和葉綠體發(fā)育。光抑制下胚軸的生長，刺激子葉的擴張，促進質(zhì)體到葉綠體的轉(zhuǎn)變(nemhauserj,2002)。擬南芥光受體隱花色素和光敏素介導(dǎo)了去黃化過程，主要是依賴于對基因轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控來促進光形態(tài)建成(jiaoy,2007)。對削弱了去黃化響應(yīng)的基因突變體進行遺傳學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)很多基因(如cop1，spa1，hy5/hyh，hfr1，pp7，hrb1，sub1，obp3，shb1，bit1，atab2等)參與了隱花色素調(diào)控的去黃化響應(yīng)。除了cop1，spa1，hy5/hyh，對于這些基因是如何參與隱花色素的功能還不是很清楚。

光抑制下胚軸生長是研究去黃化的表征之一。隱花色素cry1的發(fā)現(xiàn)正是源于對藍光下下胚軸生長去抑制的突變體hy4的分析(koornneefm,1980)。cry1過表達植株呈現(xiàn)對藍光的高度敏感性，與野生型相比，在持續(xù)藍光下出現(xiàn)短的下胚軸(lin,1995)。cry2也參與了藍光對下胚軸生長的調(diào)節(jié)，但是其作用相對于cry1較弱，且主要是介導(dǎo)低強度藍光(<10μmm-2s-1)對下胚軸生長的抑制，有可能與cry2在高強度藍光下快速降解有關(guān)。雙缺失突變體cry1cry2在持續(xù)藍光下呈現(xiàn)出比隱花色素單缺失突變體cry1、cry2更長的下胚軸，說明這兩個隱花色素在介導(dǎo)藍光抑制下胚軸生長中存在功能冗余(mocklertc,1999)。通過對野生型、雙缺失突變體cry1cry2、cry1過表達植株的分析，發(fā)現(xiàn)cry1主要介導(dǎo)390-480nmuv-a和藍光范圍內(nèi)的光響應(yīng)(ahmadm,2002)。

對于隱花色素介導(dǎo)藍光抑制下胚軸生長的細胞機制，spalding與他的同事做了大量研究，提出隱花色素激活了離子通道，導(dǎo)致質(zhì)膜去極化，從而抑制細胞伸長(spaldinge,1988；chomh,1996)。他們進一步提出核定位的cry1介導(dǎo)了下胚軸生長和膜去極化的過程。依賴核cry1的質(zhì)膜去極化在光照后的數(shù)秒內(nèi)便發(fā)生，暗示其反應(yīng)機制要遠遠快于轉(zhuǎn)錄調(diào)控或者蛋白降解調(diào)控。另外，缺失突變體cry1、cry2、phya和phot1都呈現(xiàn)出減弱的藍光誘導(dǎo)的質(zhì)膜去極化響應(yīng)(parksbm,1999；foltakm,2001)。但是phot1在藍光下并沒有出現(xiàn)伸長的下胚軸。有可能phot1在介導(dǎo)藍光對細胞伸長的影響中處于光響應(yīng)的起始階段，而cry1的功能在于保持藍光對下胚軸生長的抑制(parksbm,2001；foltakm,2003)。

光對下胚軸生長的調(diào)控主要還是通過基因調(diào)控的方式。大量研究表明，隱花色素cry1能抑制cop1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子的降解，如hy5/hyh、hfr1(osterlundmt,2000；duekpd,2004)。這一類轉(zhuǎn)錄因子在黑暗中被降解，見光后，光受體(隱花色素或光敏素)抑制cop1的活性，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子的累積，從而改變代謝酶類或信號蛋白的表達水平，如生長素、油菜素類固醇、赤霉素、催化合成和降解細胞壁的代謝酶等等，能在一定程度上解釋光對下胚軸生長的影響。

與光抑制下胚軸生長相反，光能促進子葉的闊張，促進子葉細胞的伸長。隱花色素cry1和cry2共同介導(dǎo)了藍光對子葉生長的影響，不同的是，胞質(zhì)定位的cry1介導(dǎo)這一應(yīng)答，而核內(nèi)的cry2參與了這一光響應(yīng)(wug,2007)，不同位置的cry介導(dǎo)同一響應(yīng)讓人費解。隱花色素cry1介導(dǎo)了高低強度的藍光對子葉闊張的影響，而cry2則主要介導(dǎo)低強度藍光的響應(yīng)，與抑制下胚軸生長情況類似(lin,1998)。過表達cry1或cry2的轉(zhuǎn)基因幼苗在持續(xù)藍光下呈現(xiàn)出比野生型更大的子葉，說明細胞內(nèi)隱花色素的濃度影響了子葉闊張程度。隱花色素介導(dǎo)藍光抑制下胚軸生長，卻又介導(dǎo)藍光促進子葉闊張，說明隱花色素不同的功能間存在不同的調(diào)控機制，或不同器官或組織的隱花色素具有不同的功能。

除了對下胚軸和子葉的影響，隱花色素還能介導(dǎo)藍光調(diào)節(jié)質(zhì)體的發(fā)育、葉綠體的生成，主要依賴對基因表達水平的調(diào)控，包括對編碼質(zhì)體蛋白的核基因及質(zhì)體轉(zhuǎn)錄組的誘導(dǎo)(jiaoy,2007；fuglevandg,1996；thumke,2001)，如psii反應(yīng)中心的蛋白d1，d2編碼基因psba、psbd受核基因sig5的調(diào)控，而sig5的表達受cry1的介導(dǎo)在藍光下增加。因此，隱花色素通過調(diào)控質(zhì)體轉(zhuǎn)錄需要的核基因的表達，從而調(diào)節(jié)葉綠體的發(fā)育。

隱花色素除了促進擬南芥幼苗光形態(tài)建成，在植物的生長過程中還調(diào)控了光周期控制的開花。cry2突變體在長日照條件下開花時間遠遠晚于野生型，但是在短日照下開花時間不受影響，說明隱花色素cry2參與了對光周期控制的開花途徑的調(diào)控(guoh,1998)。另外，有研究發(fā)現(xiàn)cry2正是早先篩選到的晚花突變體fha的等位基因，結(jié)合這些研究結(jié)果：cry與co、ft、gi一樣，通過光周期途徑調(diào)控開花(guoh,1998；koornneefm,1998)。通過轉(zhuǎn)基因擬南芥和大豆瞬時表達研究證明：大豆中的隱花色素gmcry1a和gmcry2a均參與光形態(tài)成過程，gmcry1a的作用更明顯；暗示了gmcry1a對大豆光周期調(diào)控的開花途徑起到重要的作用(zhang,2008)。

隱花色素cry2蛋白水平在短日照下呈現(xiàn)出依賴藍光的晝夜節(jié)律，而在長日照下沒有該現(xiàn)象，說明cry2蛋白水平的變化有可能解釋它參與光周期信號的機理(mocklert,2003)。對cry2等位基因edi的分析，更支持了這一說法。edi是在赤道附近熱帶群島內(nèi)擬南芥cvi生態(tài)型中篩選到的光周期不敏感早花數(shù)量性狀基因座(alonso-blancoc,1998)。qtl圖譜定位將edi定位到了cry2基因，從而發(fā)現(xiàn)v367m的點突變是造成edi不依賴光周期早花的原因，細胞內(nèi)cry2v367m蛋白比cry2更為穩(wěn)定。cry2v367m蛋白的穩(wěn)定性與不受光周期的調(diào)節(jié)有可能解釋了它不依賴于光周期的早花表型。

隱花色素cry1有可能也影響擬南芥開花時間。一些實驗條件下，cry1突變體呈現(xiàn)出晚花的表型，但是也有一些實驗條件下，cry1突變體開花時間與野生型沒有差異(bruggemanne,1996；blazquezma,2003)。有可能是實驗條件的略微差異造成的這種不一致。因為藍光下cry1cry2雙缺失突變體開花晚于單突變體和野生型，說明cry1與cry2功能冗余，均能促進開花(liu,2008)。另外，cry2突變體抑制了phyb突變體早花的表型，暗示cry2與phyb在介導(dǎo)紅光抑制開花中起相反的作用(mocklertc,2002)。

生物鐘是生物體生命活動的內(nèi)在節(jié)律性，它使生物體能夠適應(yīng)地球環(huán)境的變化，保持大約24小時的晝夜循環(huán)以及一年的光周期循環(huán)(harmersl,2009)。生物鐘調(diào)控了植物的生長發(fā)育，促進了植物的適應(yīng)性。生物鐘同時受到環(huán)境的影響，光是其中之一，光信號能夠促進生物體的生物鐘、生理活性與周圍環(huán)境晝夜循環(huán)同步(sancara,2000)?？茖W(xué)家們在擬南芥、果蠅和老鼠中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)隱花色素在生物鐘中扮演重要角色，隱花色素被認為是一個主要的光受體或生物鐘的內(nèi)部成員促進光信號的傳遞(emeryp,1998；somersde,1998)。擬南芥隱花色素突變體削弱了生物鐘對其下游基因的調(diào)控(somersde,1998)。擬南芥cry1突變體在藍光下呈現(xiàn)加長的生物鐘周期，cry2突變體僅在低強度藍光下呈現(xiàn)略微縮短的生物周期，cry1cry2雙突變體在藍光下呈現(xiàn)出加長的生物周期。除了生物周期的改變，cry1cry2并不影響節(jié)律，暗示擬南芥隱花色素并不是生物鐘振蕩器的內(nèi)在成員(devlinpf,2000)。

對于擬南芥隱花色素如何介導(dǎo)光對生物鐘的影響還不是很清楚。有報道稱隱花色素有可能通過抑制cop1的活性從而影響elf3和gi，進而調(diào)節(jié)光對鐘的影響(yujw,2008)。另外，已報道的光受體間的相互作用cry1-phya,cry2-phyb,cry1-ztl和phyb-ztl有利于整合光信號共同影響生物鐘(jarilloja,2001)。光受體介導(dǎo)光對生物鐘的調(diào)控機理還需要進一步研究。

光影響保衛(wèi)細胞的發(fā)育和氣孔的開放。光對保衛(wèi)細胞發(fā)育的影響是一個比較復(fù)雜的過程，包括不對稱細胞分裂的起始，前體細胞的增值，氣孔保衛(wèi)細胞的分化，氣孔的形成。研究表明藍光、紅光和遠紅光都能刺激保衛(wèi)細胞的發(fā)育(kangcy,2009)。遺傳學(xué)分析表明隱花色素介導(dǎo)了藍光刺激氣孔的發(fā)育，且其調(diào)控途徑不同于已知的lrr受體激酶、mapk和縱多轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(kangcy,2009)。

除了對氣孔發(fā)育的影響，隱花色素還能介導(dǎo)光調(diào)節(jié)氣孔的開放。我們知道光能夠促進氣孔的開放，允許氣體交換進行光合作用或蒸騰作用(zeigere,1977)。而向光素是調(diào)控氣孔開放的主要光受體，介導(dǎo)藍光調(diào)節(jié)保衛(wèi)細胞膜電位的去極化，導(dǎo)致水的流動和氣孔的開放(schroederji,2001)。最近的一些研究結(jié)果報道cry1cry2雙缺失突變體增加了植物的干旱耐受力，是歸于藍光促使氣孔的開放(maoj,2005)。隱花色素的缺失降低了藍光下氣孔的開放，而過表達cry1增加了氣孔的開放。在向光素雙缺失突變體中殘留的氣孔開放現(xiàn)象，在隱花色素和向光素四缺突變體中被消除了，并且，過表達cry1于向光素雙缺失突變體中能夠恢復(fù)氣孔開放對藍光的響應(yīng)，暗示隱花色素確實參與了藍光誘導(dǎo)氣孔開放的信號途徑(maoj,2005)。與去黃化響應(yīng)一樣，隱花色素對氣孔的發(fā)育和開放的影響也依賴于cop1，但是隱花色素/cop1、向光素調(diào)控途徑間的相互關(guān)系、隱花色素/cop1與mapk途徑的相互關(guān)系目前還不是很清楚。

早在1998年，ahmad研究組發(fā)現(xiàn)隱花色素cry1cry2雙缺失突變體缺乏依賴藍光的向光性，而cry1過表達則加強向光性響應(yīng)(ahmadm,1998)。但隨后有研究發(fā)現(xiàn)向光素而非隱花色素主要介導(dǎo)了植物向光性(christiejm,1998)。隱花色素cry1cry2雙缺失突變體、光敏素phyaphyb雙缺失突變體降低了向光性，但是向光性的重要參數(shù)并沒有很明顯的變化(tsuchida-mayamat,2010)。由此研究者們認為向光素介導(dǎo)了藍光對向光性的影響，促進氣孔的開放、葉綠體的運動。隱花色素和光敏素有可能參與或協(xié)助了向光素的某些調(diào)控(whippocw,2003)。最近有報道稱隱花色素cry1、cry2和光敏素phya正向調(diào)節(jié)rpt2蛋白的積累、向光素依賴的生長素梯度的形成，促進向光性生長，同時也負調(diào)控依賴ga的向光性抑制途徑(tsuchida-mayamat,2010)。

除了向光性，光還影響植物的向地性(hangarterrp,1997)。紅光會影響擬南芥下胚軸向地性生長，主要是通過光敏素介導(dǎo)(robsonpr,1996)。然而，藍光對向地性的影響往往會被向光性掩蓋，因此這類實驗分析需要在向光素突變的背景下進行。將隱花色素cry1或cry2過表達到cry1cry2phot1phot2四缺突變體中，在藍光下會出現(xiàn)隨機的下胚軸彎曲，而在黑暗下沒有。這項實驗證明，類似于光敏素介導(dǎo)紅光抑制向地性，隱花色素介導(dǎo)了藍光對向地性的抑制(ohgishim,2004)。光受體介導(dǎo)的向地性有可能主要是通過光受體調(diào)節(jié)荷爾蒙代謝、轉(zhuǎn)運、信號傳導(dǎo)基因的表達實現(xiàn)。例如，隱花色素介導(dǎo)藍光抑制pgp19/absb9基因的表達。pgp19/absb9基因編碼了一個abc型的生長素轉(zhuǎn)運子，該轉(zhuǎn)運子參與了生長素的運輸和向地性生長。遺傳學(xué)分析表明pgp19在隱花色素上位(nagashimaa,2008)。由此，隱花色素介導(dǎo)藍光對pgp19基因表達的抑制解釋了藍光對向地性的影響。隱花色素對向地性的響應(yīng)也牽涉到cop1信號途徑，cop1突變體呈現(xiàn)出持續(xù)性光形態(tài)建成和背地性表型(caod,2000；yang,2000)。

光能夠調(diào)節(jié)根的發(fā)育，包括根的延伸、側(cè)根的產(chǎn)生、質(zhì)體發(fā)育和向性生長(feldmanlj,1984)。據(jù)報道藍光刺激根的延伸，而隱花色素cry1介導(dǎo)了這一響應(yīng)(canamerorc,2006)。cry2在對根的生長調(diào)節(jié)中與cry1的功能相反。另外，有研究表明胞質(zhì)和核cry1有可能分別促進或抑制根的延伸(wug,2007)。除了對根細胞延伸的影響，藍光還會影響根葉綠體的發(fā)育，主要是通過cry1介導(dǎo)(usamit,2004)。

遷徙動物如鳥類和昆蟲類被認為能夠感受地球磁場，由此能夠辨別遷徙的方向。動物的磁場感應(yīng)依賴于光，目前研究認為光誘導(dǎo)光受體產(chǎn)生磁場響應(yīng)的質(zhì)子對，轉(zhuǎn)移到神經(jīng)系統(tǒng)，使動物感受磁場的方向(ritzt,2000)。在果蠅中該光受體被認為是隱花色素，且隱花色素介導(dǎo)磁場感應(yīng)的光化學(xué)機制不依賴于蛋白內(nèi)色氨酸三聯(lián)體電子傳遞和fad光還原反應(yīng)(gegearrj,2010)?？茖W(xué)家們也研究了植物對磁場的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)磁場能夠促進擬南芥隱花色素cry1介導(dǎo)藍光抑制下胚軸的生長、促進花青素的累積和依賴藍光的cry2的降解，并且該反應(yīng)依賴于fad光還原光激活機制(solov'yovia,2007)。也有研究報道下胚軸的生長、花青素的積累、相關(guān)基因的表達并不受到磁場強度的影響(harrissr,2009)。磁場對隱花色素介導(dǎo)藍光響應(yīng)的影響還需要進一步核實。

研究發(fā)現(xiàn)在flu突變體背景下，擬南芥cry1突變體抑制依賴藍光、ros的細胞程序性死亡(pcd)(danona,2006)。flu突變體是在光合成色素和光敏素生色團葉綠素和藍藻膽素生物合成途徑的研究中發(fā)現(xiàn)的(meskauskiener,2001)。當flu缺失后，光下生長的突變體轉(zhuǎn)移到黑暗下會積累更多的原葉綠素酸脂，當將此突變體重新放回到光下時，原葉綠素酸脂分子會將光能轉(zhuǎn)移到基態(tài)的氧促使氧到激發(fā)態(tài)。作為ros的重要來源，氧促進了pcd，引起了經(jīng)歷光到黑暗再到光下的突變體flu的死亡(opdencamprg,2003)。flu突變體pcd表型僅依賴于藍光而非紅光，由此科學(xué)家們想到了隱花色素有可能參與了pcd的調(diào)控。cry1突變能夠拯救flu突變體的pcd表型，暗示cry1介導(dǎo)了依賴藍光的pcd過程，有可能是通過誘導(dǎo)脅迫響應(yīng)基因的表達從而放大pcd過程(danona,2006)。

除了以上依賴藍光的功能，隱花色素還擁有藍光非依賴的活性，例如介導(dǎo)紅光和遠紅光響應(yīng)。cry2突變體幼苗在紅光下呈現(xiàn)加長的生物鐘周期，在遠紅光下出現(xiàn)下胚軸延伸缺陷(masp,2000)。cry1cry2雙缺失突變體在其他光照條件下也呈現(xiàn)降低的子葉張開度，cry2cvi生態(tài)型等位基因cry2v367m在遠紅光下呈現(xiàn)加強的子葉張開(bottojf,2003)。一般認為隱花色素不吸收長波長的光，但是隱花色素包含的生色團fad擁有不同的氧化還原態(tài)，它有可能吸收大于600nm的光(henbestkb,2008；ozturkn等,2008)。因此，不能排除其他光波長對隱花色素結(jié)構(gòu)和功能的影響。另外，光受體之間的相互作用也解釋了光受體在不同光下的響應(yīng)。

擬南芥隱花色素cry經(jīng)歷了一系列生理生化反應(yīng)，包括電子傳遞、磷酸化、泛素化，改變蛋白構(gòu)象傳遞藍光信號。對于隱花色素光信號的傳導(dǎo)途徑，目前的研究主要提出了兩種方式：一種方式是隱花色素通過與轉(zhuǎn)錄因子cib相互作用調(diào)控基因表達；另一種是隱花色素通過與spa1/cop1復(fù)合體相互作用調(diào)節(jié)蛋白穩(wěn)定性。以上兩種信號傳導(dǎo)途徑都依賴于藍光依賴的蛋白相互作用調(diào)控基因表達，從而影響植物生長發(fā)育。

擬南芥隱花色素傳導(dǎo)途徑中的信號蛋白包括：

(1)轉(zhuǎn)錄因子cib

2008年通過藍光下的酵母雙雜交篩選到第一個藍光特異的隱花色素互作蛋白，定義為cib1(cry-interactingbhlh1)。在酵母中，cib1與cry2的互作是藍光波長特異的，相互作用的強度依賴于藍光強度，且依賴于生色團fad。在暴露于藍光下的擬南芥幼苗細胞中可以檢測到cib1-cry2復(fù)合體，而在紅光下檢測不到。在瞬時轉(zhuǎn)錄因子試驗中cib1行使轉(zhuǎn)錄因子的功能依賴于隱花色素和藍光。擬南芥cib1在體外能夠結(jié)合g-box(cacgtg)，在體內(nèi)能夠影響g-box和e-box(canntg)的轉(zhuǎn)錄，說明cib1體外結(jié)合dna的活性以及體內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性存在差異。一種可能的解釋就是在體內(nèi)cib1與其他同家族基因(cib3,4,5等)形成異源二聚體，從而改變了它對不同dna的親和性。事實證明，至少有四個cib1相關(guān)基因能夠與cib1或cry2相互作用，包括cib1、cib3、cib4、cib5，而其中一些能與cib1形成異源二聚體，共同影響cry2調(diào)控基因的表達。與此論點一致的是，單缺失突變體cib1在實驗條件下沒有任何表型，而雙缺失突變體cbi1cib5開花要稍晚于野生型，說明cib蛋白間存在功能冗余。將cib1過表達到野生型背景能夠引起早花，而在cry1cry2突變體背景下沒有表型，說明cib1對開花的促進依賴于隱花色素。對cib1啟動子的檢測，發(fā)現(xiàn)它在所有細胞器和細胞類型中均有活性，說明cib1除了在維管束細胞中與cry2相互作用調(diào)節(jié)開花以外，cib1蛋白還有可能在其他細胞中與cry相互作用調(diào)控其他光響應(yīng)基因的表達。當然，目前已有的檢測暗示cib1有可能不參與cry對去黃化的調(diào)節(jié)，因為cib蛋白單缺失或多缺失都沒有去黃化響應(yīng)的異常表現(xiàn)(liu和lin，未發(fā)表結(jié)果)。

(2)泛素化e3連接酶cop1

泛素化連接酶cop1在植物光形態(tài)響應(yīng)和光受體功能中扮演著重要角色(dengxw,1992)。功能缺失突變體cop1呈現(xiàn)出持續(xù)性光形態(tài)建成表型，在黑暗下出現(xiàn)短的下胚軸、張開的子葉、增加的花青素表達以及光誘導(dǎo)基因的錯誤表達。過表達gus-cct1和gus-cct2呈現(xiàn)出cop1表型，dna芯片分析，在cop1中表達改變的基因有80％在gus-cct1和gus-cct2中的表達也受到影響，相似的表型暗示了功能上的關(guān)系，使科學(xué)家們開始了對隱花色素和cop1關(guān)系的探討。在酵母雙雜交系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)cct1和cct2能夠與cop1相互作用，在擬南芥細胞中通過免疫共沉淀鑒定了cry2與cop1相互作用，gfp-cct1與cop1共定位于細胞核核體中(wangh,2001)。對蛋白穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)是光形態(tài)建成調(diào)控的一個關(guān)鍵點，有研究表明cop1介導(dǎo)了眾多光信號蛋白光依賴的降解，包括hy5/hyh、laf1、hfr1、cry2、phya、co、gi(duekpd,2004；liu,2008；shalitind,2002；hardtkecs,2000；jangs,2008)。由此假設(shè)光激活的隱花色素有可能直接或間接與cop1相互作用，抑制它的e3連接酶活性，改變cop1底物蛋白的穩(wěn)定性，最終調(diào)節(jié)植物的發(fā)育(yang,2000；wangh,2001)。另外，隱花色素與cop1的相互作用是不依賴于藍光的(liu,2008；yang,2000；wangh,2001)，這就提出一個疑問，cry2是如何介導(dǎo)光對cop1活性的影響呢？一種可能就是光照后cry改變自身生化活性或cop1的核質(zhì)分配，另一種可能就是cry通過光依賴的方式與cop1互作的蛋白相互作用，來共同影響cop1的活性。

(3)coiled-coil/wdrepeat蛋白spas

spa1是光敏素phya特異的信號介導(dǎo)蛋白，在擬南芥中抑制光形態(tài)的建成。它包含wd重復(fù)域，序列上高度類似于cop1的wd重復(fù)域。spa1能夠與cop1互作，其coiled-coil域是與cop1互作必須的。spa1與cop1的互作促進了cop1對hy5、hfr1的泛素化，介導(dǎo)了phya信號傳導(dǎo)(duekpd,2004；saijoy,2003)。spa1與cop1的互作是光敏感的，光能夠抑制他們的相互作用，抑制cop1的e3泛素化酶活性(saijoy,2003,2008)。但是，究竟光是如何抑制spa1與cop1的互作，又如何抑制cop1的活性目前還不清楚。

最近的研究顯示spa1能夠與cry1和cry2相互作用，且是依賴于藍光和生色團fad的，作用強度隨藍光光強的增加而增加。除了spa1，擬南芥還有三個spa1相關(guān)基因spa2、spa3、spa4。spa4在藍光下與cry1和cry2互作。spas基因間有可能存在功能冗余，共同參與隱花色素調(diào)控的藍光信號途徑。研究者們從遺傳學(xué)角度進一步證實了spas基因在隱花色素調(diào)控藍光信號途徑中的角色。在持續(xù)藍光下，突變體cry1呈現(xiàn)出長的下胚軸，而spa1spa4下胚軸短于野生型，spa1spa4cry1的下胚軸略長于野生型但是遠短于cry1，說明spas參與了隱花色素調(diào)控的下胚軸生長抑制，且位于cry1的上位。spa1也參與了cry2依賴的光周期控制的開花途徑。長日照下cry2開花晚于野生型，而spa1無明顯開花表型，雙缺失突變體cry2spa1開花時間與spa1一致，說明spa1在cry2調(diào)控光周期控制的開花途徑中位于cry2的下游。crys還介導(dǎo)了藍光調(diào)節(jié)spas基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(sellaror,2009)。

藍光響應(yīng)途徑具體描述如下

(1)cry2-cib1途徑

擬南芥隱花色素cry2與bhlh轉(zhuǎn)錄因子cib1經(jīng)歷了依賴藍光的互作。cib1能夠結(jié)合ft基因啟動子中的e-box，cry2通過與cib1的互作，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)ft的表達，促進光周期控制的開花。ft編碼一個可移動的轉(zhuǎn)錄因子，從葉子移動到頂端分生組織促進開花基因的表達。cry2還與cib1的同源基因互作，體外實驗證明cib1與其他同源基因(cib3，cib4，cib5)形成異源二聚體，結(jié)合到ft啟動子的e-box。cib蛋白共同參與了cry2的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促進依賴光周期的花蕾的形成。

對于cry2-cibs調(diào)控途徑還有一些問題需要進一步探討。例如：cry2是否影響cib1結(jié)合dna的親和力？隱花色素是如何介導(dǎo)藍光影響cib1的轉(zhuǎn)錄活性的？另外，cib蛋白在沒有藍光的條件下經(jīng)歷泛素化-26s蛋白酶體降解途徑，藍光是如何促進cib蛋白的穩(wěn)定性的呢？如何解釋cib蛋白在藍光下的特異積累與隱花色素cry2藍光下的降解現(xiàn)象？除了促進光周期控制的開花，隱花色素還調(diào)控了許多其他響應(yīng)，cib是否介入了這些響應(yīng)途徑？是否也存在與cry1互作的轉(zhuǎn)錄因子，使得隱花色素cry1從轉(zhuǎn)錄水平直接調(diào)控基因的表達來傳遞光信號？

(2)cry-spa1/cop1途徑除了通過與轉(zhuǎn)錄因子的互作從轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)基因的表達，隱花色素還通過轉(zhuǎn)錄后機制間接調(diào)控基因的表達。隱花色素介導(dǎo)了藍光對e3連接酶cop1活性的抑制，例如cry1介導(dǎo)藍光抑制了cop1依賴的轉(zhuǎn)錄因子hy5(longhypocotyl5)、hyh(hy5homologue)、hfr1(longhypocotylinfar-red1)蛋白的降解，這些轉(zhuǎn)錄因子在去黃化響應(yīng)中調(diào)節(jié)基因的表達，如生長素、油菜素類固醇、赤霉素，以及合成和降解細胞壁的代謝酶類。cry2介導(dǎo)了藍光抑制cop1依賴的轉(zhuǎn)錄因子co(constans)蛋白的降解，co是長日照下促進開花的一個重要成員，它能夠在轉(zhuǎn)錄水平上促進ft的表達。最近的研究表明，隱花色素通過與蛋白復(fù)合體spa1/cop1的互作傳遞光信號，cry與cop1的互作不依賴于光，但是cry能與cop1互作的蛋白spa1經(jīng)歷光依賴的相互作用。cry與spa1的相互作用是藍光特異的，spa1在遺傳上位于cry的下游。cry與spa1依賴藍光的互作一定程度上解釋了cry是如何介導(dǎo)光對cop1功能抑制的。出人意料的是結(jié)構(gòu)相似的cry1和cry2與spa1/cop1的互作存在一些差異。在酵母和擬南芥中cry1-spa1的互作抑制了spa1-cop1的互作(sellaror,2009；lianhl,2011；liub,2011)，cry1以競爭對手的方式介導(dǎo)了藍光對cop1活性的抑制，恰好解釋了先前的發(fā)現(xiàn)：spa1-cop1互作受到了光的抑制(saijoy,2003)。與cry1相反，依賴于藍光的cry2-spa1的相互作用并不影響spa1-cop1的相互作用，cry2-spa1的相互作用在酵母中加強了cry2-cop1的相互作用，在植物體內(nèi)促進了cry2-cop1復(fù)合體的形成(zuoz,2011)。cry2-spa1的相互作用促進cry2-cop1的相互作用是通過酵母三雜交檢測到的，cry2-spa1促進cry2-cop1復(fù)合體的形成僅在spa1過表達的轉(zhuǎn)基因植株中觀察到。隱花色素cry1和cry2與spa1/cop1相互作用的差異有可能與其相互作用位點相關(guān)。cry1的c端cct域與spa1的c端cc-wd域相互作用，而cry2的n端phr域與spa1的n端激酶域相互作用。spa4也與cry1和cry2存在依賴藍光的相互作用。

大豆作為一種理想的光周期研究材料已有很長歷史，但對其光周期反應(yīng)的分子生物學(xué)機制至今仍知之甚少。從隱花色素著手研究其光周期反應(yīng)的分子生物學(xué)問題，可以從信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的上游開始理解大豆光周期反應(yīng)的特點，這樣既有利于盡快開拓大豆光周期研究的新領(lǐng)域，也會為更深入的進行研究提供寶貴經(jīng)驗、打下堅實基礎(chǔ)，具有非常重要的理論意義。之前的研究表明大豆隱花色素gmcry1在大豆光周期反應(yīng)中作用明顯，且與擬南芥隱花色素cry2特點相似，而gmcry2更類似cry1。gmcry1與cry2的相似之處主要表現(xiàn)為：①均呈現(xiàn)明顯的晝夜節(jié)律；②均能促進植物開花。所不同的是gmcry1在cry1缺失突變體中過表達，短日下促進開花，而cry2在長日下促進開花。gmcry2與cry1相似之處是，既沒有明顯晝夜節(jié)律也不能明顯促進開花，但gmcry2藍光下能降解而cry1不能(zhang等,2008)。

在大豆中過表達或rnai敲除gmcry基因是否能夠改變大豆開花對光周期的敏感性，在本研究之前還沒有報道。此外，大豆中的gmcry是否通過與gmcib相互作用來進行藍光信號傳遞也不清楚。目前我們在大豆中發(fā)現(xiàn)并克隆了9個與擬南芥cib1同源的gmcibs基因，通過酵母雙雜交實驗初步驗證了gmcib1與gmcry2在藍光下特異的相互作用。本研究將通過酵母雙雜交、bifc以及co-ip等手段研究gmcrys與gmcibs蛋白間的相互作用；進一步獲得gmcry與gmcib1基因過表達或rnai敲除的遺傳轉(zhuǎn)化大豆株系，結(jié)合轉(zhuǎn)基因后代的表型分析和染色體免疫共沉淀試驗(chip)結(jié)果尋找gmcib1的下游作用靶基因，分析大豆中g(shù)mcry傳遞藍光信號的gmcib信號通路，以及gmcry與gmcib1基因在大豆衰老調(diào)控中的作用，為大豆光周期的進一步深入研究和種質(zhì)創(chuàng)新打下基礎(chǔ)。

發(fā)明簡述

在一個方面中，本發(fā)明涉及一種分離的基因，其具有如下的核苷酸序列：

(1)seqidno:1或3所示的序列或其互補序列；

(2)在嚴格雜交條件下與seqidno:1或3雜交的序列；

(3)與seqidno:1或3具有至少85％、90％、95％或99％同一性的序列，其調(diào)控葉子衰老和開花；或

(4)由seqidno:1或3所示的序列通過其中一個或多個核苷酸的缺失、置換、插入或添加而衍生所得到的序列。

在另一個方面中，本發(fā)明涉及一種分離的dna分子，其包含上述的基因及其變體，該dna分子具有g(shù)mcib1基因或gmcry2基因的生物學(xué)功能。

在另一個方面中，本發(fā)明涉及一種重組載體，其包含上述的基因或如dna分子。

在另一個方面中，本發(fā)明涉及一種分離的蛋白質(zhì)，其具有如下的氨基酸序列：

(1)seqidno:2或4所示的氨基酸序列；

(2)由上述的基因編碼的序列；或

(3)包含一個或幾個氨基酸殘基的置換和/或缺失和/或添加的seqidno:2或4所示的氨基酸序列，該蛋白質(zhì)具有調(diào)控植物葉子衰老和開花的功能。

在另一個方面中，本發(fā)明涉及一種宿主細胞，其包含上述的基因、dna分子、重組載體或蛋白質(zhì)。

在另一個方面中，本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因植物，其包含上述的基因、dna分子、重組載體或蛋白質(zhì)。

在一個實施方式中，所述的轉(zhuǎn)基因植物為單子葉植物或雙子葉植物，優(yōu)選為擬南芥或大豆。

在另一個方面中，本發(fā)明涉及所述的基因、dna分子、重組載體或蛋白質(zhì)在調(diào)控植物葉子衰老和開花中的應(yīng)用。

在一個實施方式中，所述的植物為單子葉植物或雙子葉植物，優(yōu)選為擬南芥或大豆。

在另一個方面中，本發(fā)明涉及一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括將上述的基因?qū)肽康闹参镏幸垣@得轉(zhuǎn)基因植物，從而調(diào)控所述轉(zhuǎn)基因植物的葉子衰老和開花。

在一個實施方式中，培育轉(zhuǎn)基因植物的方法進一步包括獲得所述轉(zhuǎn)基因植物的種子。

在一個實施方式中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，優(yōu)選為擬南芥或大豆。

在另一個方面中，本發(fā)明涉及一種調(diào)控植物葉子衰老的方法，包括將上述的基因或載體引入所述植物中以使其在植物中表達，從而調(diào)控植物的葉子衰老。

在一個實施方式中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，優(yōu)選為擬南芥或大豆。

在另一個方面中，本發(fā)明涉及一種調(diào)控植物開花的方法，包括將上述的基因或載體引入所述植物中以使其在植物中表達，從而調(diào)控植物的開花。

在一個實施方式中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，優(yōu)選為擬南芥或大豆。

在另一個方面中，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述轉(zhuǎn)基因植物包含引入的上述基因、dna分子或重組載體，或者其重組表達上述的蛋白質(zhì)，該方法包括獲得所述轉(zhuǎn)基因植物的種子，并通過種植所述種子以獲得新的轉(zhuǎn)基因植物。

附圖簡要說明

圖1顯示了大豆cib基因的染色體定位。

圖2顯示了大豆cib基因家族成員之間的同源性。

圖3顯示了擬南芥和大豆cib保守位點分析，箭頭(頂部)表示各結(jié)構(gòu)域中保守的氨基酸。

圖4顯示了大豆cib基因的基因結(jié)構(gòu)模式。

圖5顯示了大豆cib在擬南芥原生質(zhì)體中的亞細胞定位。

圖6顯示了大豆cib基因家族在不同組織器官的表達模式。

圖7顯示了大豆cib基因家族在不同發(fā)育時期的表達模式。

圖8a-8i分別顯示了大豆cib1-9基因的光周期表達模式，其中圖8a為cib3基因的光周期表達模式，圖8b為cib2基因的光周期表達模式，圖8c為大豆cib1基因的光周期表達模式，圖8d為大豆cib4基因的光周期表達模式，圖8e為大豆cib5基因的光周期表達模式，圖8f為大豆cib6基因的光周期表達模式，圖8g為大豆cib7基因的光周期表達模式，圖8h為大豆cib8基因的光周期表達模式，和圖8i為大豆cib9基因的光周期表達模式，其中短日照(sd；8小時光照/16小時黑暗，a和b)或長日照(ld；16小時光照/8小時黑暗，c和d)處理48小時，分別轉(zhuǎn)到連續(xù)光照(ll；a和c)或連續(xù)黑暗(dd；b和d)處理48小時。標準誤差如圖所示(n＝3)。

圖9a-e分別顯示了不同緯度來源大豆品種中g(shù)mcib1-9的表達模式，其中圖9a為不同緯度來源大豆品種中g(shù)mcib2&3的表達模式，圖9b為不同緯度來源大豆品種中g(shù)mcib1&4的表達模式，圖9c為不同緯度來源大豆品種中g(shù)mcib5&6的表達模式，圖9d為不同緯度來源大豆品種中g(shù)mcib7&8的表達模式，和圖9e為不同緯度來源大豆品種中g(shù)mcib9的表達模式。

圖10顯示了大豆gmcib1過表達擬南芥轉(zhuǎn)化植株的表型。

圖11顯示了大豆gmcib4/5/6/8過表達擬南芥轉(zhuǎn)化植株的表型。

圖12顯示了gmcry1過表達植株在連續(xù)照下衰老相關(guān)的表型，其中(a-c)：野生型和gmcry1-ox轉(zhuǎn)基因植株中不同生長時期的單葉或子葉根據(jù)衰老狀況可劃分為三類(綠色，沒有衰老；黃色，輕度衰老；干枯，完全衰老)，每類所占的比例即該類的數(shù)目與植株總數(shù)的比值(n≥10)。(d-h):不同衰老階段植株單葉或子葉的圖片。(i):野生型和兩個gmcry1-ox轉(zhuǎn)基因植株中g(shù)fp-gmcry1和gmcry1表達水平的免疫印跡分析?？偟鞍滋崛∥镉糜?0％sds-page分析，gmcry1抗體用于免疫雜交。wt，野生型kn18；gmcry1-ox，gfp-gmcry1過表達在野生型kn18中。

圖13顯示了gmcry2過表達植株在連續(xù)照下衰老相關(guān)的表型，其中(a-c)：野生型和gmcry2-ox轉(zhuǎn)基因植株中不同生長時期的單葉或子葉根據(jù)衰老狀況可劃分為三類(如圖12所示)，每類所占的比例即該類的數(shù)目與植株總數(shù)的比值(n≥10)。(d-f,h):不同衰老階段植株單葉或子葉的表型。(g):野生型和兩個gmcry2-ox轉(zhuǎn)基因植株中g(shù)fp-gmcry2表達水平的免疫印跡分析?？偟鞍滋崛∥镉糜?0％sds-page分析，gmcry2抗體用于免疫雜交。ns，gmcry2抗體非特異條帶用于標示上樣量對照；gmcry2-ox，gfp-gmcry2過表達在野生型kn18中。

圖14顯示了gmcry2-rnai在連續(xù)照下衰老相關(guān)的表型，其中(a-c)：野生型和gmcry2-rnai轉(zhuǎn)基因植株中不同生長時期的單葉或子葉根據(jù)衰老狀況可劃分為三類(如圖12所示)，每類所占的比例即該類的數(shù)目與植株總數(shù)的比值(n≥10)。(d-h):不同衰老階段植株單葉或子葉的表型。(i):野生型和兩個gmcry2-rnai轉(zhuǎn)基因植株中g(shù)mcry2表達水平的免疫印跡分析?？偟鞍滋崛∥镉糜?0％sds-page分析，gmcry2抗體用于免疫雜交。ns，gmcry2抗體非特異條帶用于標示上樣量對照；gmcry2-rnai，gmcry2rna干擾植株。

圖15顯示了gmcib1過表達植株在連續(xù)照下衰老相關(guān)的表型，其中(a-c)：野生型和gmcib1-ox轉(zhuǎn)基因植株中不同生長時期的單葉或子葉根據(jù)衰老狀況可劃分為三類(如圖12所示)，每類所占的比例即該類的數(shù)目與植株總數(shù)的比值(n≥10)。(d-h):不同衰老階段植株單葉或子葉的表型。(i):野生型和兩個gmcib1-ox轉(zhuǎn)基因植株中yfp-gmcib1表達水平的免疫印跡分析?？偟鞍滋崛∥镉糜?0％sds-page分析，gfp抗體用于免疫雜交。ns，gfp抗體非特異條帶用于標示上樣量對照；gmcib1-ox，gfp-gmcib1過表達在野生型kn18中。

圖16顯示了野生型和轉(zhuǎn)基因植株中葉綠素含量、光合速率以及衰老相關(guān)基因的表達情況，其中(a)：野生型和各轉(zhuǎn)基因株系中四周大的單葉中總?cè)~綠素含量(白色柱)和葉綠素a:b比率的測定(黑色柱)。fw：鮮重。標準誤差如圖所示(n＝10)。(b)：葉片生長進程中光合成變化趨勢。選擇種植于連續(xù)光照下的第二復(fù)葉作為測定對象，用li-6400儀器對播種后31天到43天的植株進行測定，每兩天測定一次。psr：光合速率。(c)：野生型和各轉(zhuǎn)基因株系中四個衰老相關(guān)基因(gmapgl5,gmwrky53,gmsagl12和gmagl12)的rna表達情況，所選材料為連續(xù)光照下即將變黃的單葉。標準誤差如圖所示(n＝10)。(d)：野生型和各轉(zhuǎn)基因株系中葉綠素降解相關(guān)基因的gmpao藍光處理下的rna表達情況。材料處理為：黑暗下生長12天的幼苗，轉(zhuǎn)入藍光下(～22μmolm-2s-1)處理6小時，分別在黑暗下，藍光光照1小時、3小時和6小時取材(b1,b3和b6)。標準誤差如圖所示(n＝3)。

圖17顯示了gmcry1-ox,gmcry2-ox,gmcry2-rnai和gmcib1-ox轉(zhuǎn)基因植株中的開花表型，其中(a)：開花時間測定；(b)：開花時的葉片數(shù)。植株種植在連續(xù)光照下(ll)，當野生型第七復(fù)葉出現(xiàn)時，將所有的植株包括個各轉(zhuǎn)基因植株轉(zhuǎn)入到短日照(sd)條件下(8小時光照/16小時黑暗)。標準誤差如圖所示(n≥15)。

圖18顯示了gmfts和gmtfls在不同基因型中mrna表達水平，其中(a)：wt和gmcry1-ox轉(zhuǎn)基因植株中g(shù)mfts和gmtflsmrna表達水平；(b)：wt和gmcry2-ox轉(zhuǎn)基因植株中g(shù)mfts和gmtflsmrna表達水平；(c)：wt和gmcry2-rnai轉(zhuǎn)基因植株中g(shù)mfts和gmtflsmrna表達水平；(d)：wt和gmcib11-ox轉(zhuǎn)基因植株中g(shù)mfts和gmtflsmrna表達水平；測定的材料為圖17中描述的植株從連續(xù)光照轉(zhuǎn)到短日照生長3天后，取第1七復(fù)葉。標準誤差如圖所示(n＝3)。

圖19顯示了酵母雙雜交試驗gmcry1,gmcry2及atcry1與gmcibs間的相互作用，其中(a)：組氨酸營養(yǎng)缺陷分析顯示gmcry1和gmcibs間沒有互相作用。(b)：組氨酸營養(yǎng)缺陷分析顯示gmcry2和gmcib1間有藍光依賴的互相作用。(c)：組氨酸營養(yǎng)缺陷分析顯示atgmcry1和gmcib1、gmcib4、gmcib8間分別有藍光依賴的互相作用。含有編碼所示蛋白的酵母細胞在黑暗或藍光下(～22μmolm-2s-1)生長三天分別用于(a-c)中組氨酸營養(yǎng)缺陷分析。(+)：酵母細胞生長在缺少色氨酸和亮氨酸，但含有組氨酸的培養(yǎng)基中。(-)：酵母細胞生長在缺少色氨酸、亮氨酸，和組氨酸的培養(yǎng)基中。(d)：β-半乳糖苷酶活性檢測來分析藍光(～30μmolm-2s-1)或黑暗下gmcry2和gmcibs間的相互作用。過夜培養(yǎng)表達所示蛋白的酵母細胞并按1/5x稀釋，稀釋液黑暗培養(yǎng)至od600＝0.3-0.4后轉(zhuǎn)移至藍光下培養(yǎng)。標準誤差如圖所示(n＝3)。

圖20顯示了gmcry2與gmcib1藍光依賴的相互作用，其中(a)：β-半乳糖苷酶活性顯示紅光(r30，～30μmolm-2s-1)、藍光(b30，～30μmolm-2s-1)或黑暗處理2小時gmcry2和gmcib1間的相互作用。(b)：表達所示蛋白的酵母細胞紅光(r30，～30μmolm-2s-1)、藍光(b30，～30μmolm-2s-1)或黑暗不同處理時間時的β-半乳糖苷酶活性。(c)：不同藍光強度(30～70μmolm-2s-1)和光照時間處理下，gmcry2和gmcib1相互作用時的β-半乳糖苷酶活性。(a-c)酵母細胞所表達的蛋白如圖所示。標準誤差如圖所示(n＝3)。(d)：bifc試驗表明gmcry2和gmcib1體內(nèi)的相互作用。長日照下生長四周的擬南芥幼苗的葉肉細胞的原生質(zhì)體被分離用于共轉(zhuǎn)化表達圖中所示蛋白的質(zhì)粒。共轉(zhuǎn)化后黑暗培養(yǎng)12-14小時后藍光(～22μmolm-2s-1)處理30分鐘或仍放置于黑暗中用作對照。a列:yfp熒光；b列:自發(fā)熒光；c列:明場；d列:a、b、c疊加；標尺為20μm.(e)：在藍光(～22μmolm-2s-1)和黑暗處理下，顯微鏡視野中共轉(zhuǎn)化表達nyfp-gmcib1和ccfp-gmcry2質(zhì)粒的一百個細胞中含有yfp熒光的細胞的比值。(f)：coip試驗表明在煙草體內(nèi)能夠形成藍光依賴的gmcry2-gmcib1的復(fù)合體。利用含有編碼所示蛋白質(zhì)粒的農(nóng)桿菌注射煙草葉片。wt和已注射植物黑暗中放置三天后，轉(zhuǎn)移到藍光(～22μmolm-2s-1)下或留在黑暗中。myc抗體用于總蛋白和myc-凝膠產(chǎn)物的免疫雜交，將該蛋白膜剝?nèi)タ贵w后用flag抗體再免疫雜交。

圖21顯示了gmcry2n端結(jié)構(gòu)域與gmcib1藍光依賴的相互作用，其中(a)：gmcyr2和gmcib1蛋白結(jié)構(gòu)示意圖。gmcyr2和gmcib1相互作用的結(jié)構(gòu)域被標示出來(粉色陰影)。(b)：營養(yǎng)缺陷試驗表明了gmcry2n和gmcib1間藍光依賴的相互作用。結(jié)構(gòu)域的命名采用(a)圖所示。表達所示蛋白的酵母細胞在圖19a中所述培養(yǎng)基上生長，分別置于黑暗或藍光(～25μmolm-2s-1)下。(c)：gmcry2n或gmcry2c結(jié)構(gòu)域與gmcib1作用時的β-半乳糖苷酶活性。表達所示蛋白的酵母細胞置于黑暗或藍光(25μmolm-2s-1)下(左)，或者進行不同藍光強度(b30到b70,30～70μmolm-2s-1)和光照時間的處理(右)。

圖22顯示了gmcry1phr結(jié)構(gòu)域與gmcib1藍光依賴的相互作用，其中(a)：gmcyr1和gmcib1蛋白結(jié)構(gòu)示意圖。gmcyr1的phr結(jié)構(gòu)域(gmcry1n485)和gmcib1相互作用的結(jié)構(gòu)域用粉色陰影標示出來。(b)：營養(yǎng)缺陷試驗顯示gmcry1各個結(jié)構(gòu)域和gmcib1間相互作用情況。結(jié)構(gòu)域的命名采用(a)圖所示。表達所示蛋白的酵母細胞在圖3.8a中所述培養(yǎng)基上生長，分別置于黑暗或藍光(～25μmolm-2s-1)下。(c)：gmcry1n或gmcry1c結(jié)構(gòu)域與gmcib1作用時的β-半乳糖苷酶活性。表達所示蛋白的酵母細胞置于黑暗或藍光(25μmolm-2s-1)下(左)，或者進行不同藍光強度(b30到b70,30～70μmolm-2s-1)和光照時間的處理(右)。(d)：bifc試驗顯示gmcry1或gmcry2的不同結(jié)構(gòu)域與gmcib1在原生質(zhì)體中的相互作用情況。表達所示蛋白的質(zhì)粒通過圖3.9(d)所述方法共轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體。藍光(22μmolm-2s-1)處理30分鐘后在熒光顯微鏡下觀察。標尺為10μm。

圖23顯示了gmcib1n端結(jié)構(gòu)域與gmcry2藍光依賴的相互作用，其中(a)：營養(yǎng)缺陷試驗顯示gmcib1n(gmcib1n217)或gmcib1c(gmcib1c218-420)與gmcry1或gmcry2間相互作用情況。表達所示蛋白的酵母細胞在圖19a中所述培養(yǎng)基上生長，分別置于黑暗或藍光(～25μmolm-2s-1)。(b)：bifc試驗顯示gmcib1n與gmcry2相互作用情況。(c-d)：gmcib1不同結(jié)構(gòu)域與gmcry1或gmcry2作用時的β-半乳糖苷酶活性。表達所示蛋白的酵母細胞置于黑暗或藍光(25μmolm-2s-1)下(c)，或者進行不同藍光強度(b30到b70,30～70μmolm-2s-1)和光照時間的處理(d)。

圖24顯示了gmcib1與gmcry1/gmcry2在大豆體內(nèi)的相互作用，其中(a，b)：co-ip試驗顯示大豆體內(nèi)藍光特異的gmcry2-gmcib1或gmcry1-gmcib1復(fù)合體的形成wt(kn18)和35s::yfpgmcib1轉(zhuǎn)基因植株分別種植于短日照條件下生長三周。幼苗轉(zhuǎn)入黑暗下處理18小時后進行藍光(b，22μmolm-2s-1)處理，處理時間為(d,0分鐘；b30,30分鐘；b60,60分鐘b120,120分鐘)。yfp抗體用于總蛋白(input)和gfp-凝膠產(chǎn)物(fp-ip)的免疫雜交，將該蛋白膜剝?nèi)タ贵w后用gmcry2(a)或gmcry1(b)抗體再免疫雜交。

圖25顯示了gmcib1與gmcry1/gmcry2體外藍光依賴的相互作用，其中(a)：體外pull-down實驗表明gmcry2和gmcib1藍光特異的相互作用。含有flag抗體的凝膠與分別表達gmcib1-flag和gmcry2蛋白的昆蟲細胞裂解物的混合在一起?；旌衔镌谒{光(b,22μmolm-2s-1)和黑暗下處理，處理時間如圖所示。結(jié)合的蛋白漂洗后洗脫下來用flag(gmcib1-flag)抗體進行免疫雜交，剝?nèi)ピ摽贵w后用gmcry2再免疫雜交。(b)：體外pull-down實驗表明gmcry1和gmcib1藍光特異的相互作用。試驗方法如圖(a)所述，結(jié)合的蛋白漂洗后洗脫下來用flag(gmcib3-flag)抗體進行免疫雜交，剝?nèi)ピ摽贵w后用gmcry1再免疫雜交。

圖26顯示了gmcib1-dna體外的相互作用。rbss試驗結(jié)果顯示gmcib1蛋白結(jié)合的dna序列以及列在底部的保守序列。底部序列為gmcib1蛋白結(jié)合的dna序列，底部為比對后的canntg。

圖27a-e顯示了gmcib1與gmft3、gmft4、gmtfl1、gmtfl3和gmwrky53染色體的相互作用，其中上圖顯示了所選基因(圖27a-gmft3、圖27b-gmft4、圖27c-gmtfl1、圖27d-gmtfl3、圖27e-gmwrky53)的啟動區(qū)(箭頭)，5′utr(黑線),外顯子(灰色方框),內(nèi)含子(黑色方框),3′utr(黑線)。黑色圓圈表示e-box(canntg)所在的位置。黑線所示的dna區(qū)域是所設(shè)引物能夠擴增到或擴增不到的區(qū)域。下圖顯示chip-qpcr結(jié)果。選擇野生型(wt)或yfp-gmcib1過表達植株(gmcib1-ox)的幼苗作為分離染色體片段(～500bp)的材料，植株生長21天后黑暗下放置18小時，轉(zhuǎn)入藍光(blue,22μmolm-2s-1)下處理(左)或繼續(xù)放置在黑暗(dark)(右)下,用gfp抗體進行免疫沉淀，得到的dna沉淀用于qpcr的引物。％input:1％起始染色體片段的量用于input。標準誤差如圖所示(n＝3)。

圖28顯示了酵母細胞中響應(yīng)于藍光的gmcry2a與gmcib1的相互作用。(a)β-半乳糖苷酶(β-gal)分析表明在藍光(30μmolm^-2s^-1)或暗處理的酵母細胞中g(shù)mcry2a與gmcib1和gmcib1同源物的相互作用。(b)β-gal分析表明在紅光(r30,30μmolm^-2s^-1)、藍光(b30,30μmolm^-2s^-1)或暗(d)處理2小時的酵母細胞中g(shù)mcry2a與gmcib1的相互作用。示出了表達各種誘餌和獵物的酵母細胞。顯示三個獨立重復(fù)的平均值和標準差(a,b)。(c)β-gal分析表明在所示時間段內(nèi)響應(yīng)于不同能流率的藍光(d,暗；b30,30μmolm^-2s^-1；b50,50μmolm^-2s^-1；b70,70μmolm^-2s^-1)的gmcry2a與gmcib1的相互作用。各處理的β-gal活性在照射時隨時間線性提高，且代表β-gal活性的點與線性回歸曲線擬合。(d)不同能流率的線性回歸曲線的斜率如(c)中所示。圖中顯示了三個獨立重復(fù)的平均(±sd)(通過spss程序進行的jonckheere-terpstra趨勢分析,p＝0.003,n＝3),表明結(jié)合動力學(xué)的量度取決于光強度。(e)顯示gmcry2a-gmcib1相互作用所需的gmcry2a和gmcib1的結(jié)構(gòu)域(土黃色陰影)的示意圖。

圖29顯示了體外和植物細胞中響應(yīng)于藍光的gmcry2a與gmcib1的相互作用。(a)pull-down分析表明了藍光依賴性的gmcry2a-gmcib1體外相互作用。偶聯(lián)抗flag抗體(α-flag)的瓊脂糖珠與表達6his-gmcib1-flag(gmcib1)和6his-gmcry2a(gmcry2a)的昆蟲細胞的裂解物混合?；旌衔镞M行藍光(b,22μmolm^-2s^-1)或暗處理所示的時間。結(jié)合的蛋白質(zhì)在洗滌后洗脫，并通過抗flag抗體(α-flag)的免疫印跡進行分析、分條和用抗-gmcry2a抗體(α-gmcry2a)再次檢測。(b)bifc分析表明了用編碼nyfp-gmcib1和ccfp-gmcry2a的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的擬南芥原生質(zhì)體中藍光依賴性的gmcry2a-gmcib1相互作用。長日(ld,16h光/8h暗)條件下生長的4周齡植物的葉肉原生質(zhì)體用編碼所示蛋白質(zhì)的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化，黑暗中溫育12小時并隨后轉(zhuǎn)移到藍光(22μmolm^-2s^-1)中30分鐘，之后進行共焦顯微分析。a欄,yfp熒光；b欄,自發(fā)熒光；c欄,明視場；d欄,a、b和c欄的合并.棒,10μm。(c)對顯示bifc熒光信號的原生質(zhì)體的數(shù)目進行計數(shù)。各樣品包含至少50個原生質(zhì)體。顯示了平均值和標準差(n＝3)。p＝0.00026(student’st檢驗)。(d)活體外co-ip分析表明了煙草(nicotianabenthamiana)中g(shù)mcry2a-gmcib1復(fù)合體的藍光依賴性的形成。如所示的，嫩葉以攜帶編碼gmcib1-flag(gmcib1)或gmcry2a-myc(gmcry2a)的質(zhì)粒的農(nóng)桿菌滲透，在黑暗中保持3天，并隨后暴露于藍光(b,22μmolm^-2s^-1)1小時或保持在黑暗(d)中。蛋白質(zhì)提取物與偶聯(lián)有抗-myc抗體的瓊脂糖一起在4℃下溫育60分鐘。收集珠并洗滌3次，隨后洗脫ip產(chǎn)物?？偟鞍踪|(zhì)提取物(input)和ip產(chǎn)物的免疫印跡使用抗-myc抗體(α-myc)和抗-flag抗體(α-flag)順序地進行。(e)co-ip分析表明大豆中g(shù)mcry2a-gmcib1復(fù)合體的藍光依賴性的形成。野生型(wt)大豆kn18和過表達35s::yfp-gmcib1轉(zhuǎn)基因的大豆轉(zhuǎn)基因系(系2)(gmcib1-ox-2)在sd下生長2周。植物轉(zhuǎn)移到中18小時并暴露于藍光(b,22μmolm^-2s^-1)所示的時間(d,0min；b30,30min；b60,60min；b120,120min)。使用偶聯(lián)有抗-yfp抗體(α-yfp)的瓊脂糖進行的蛋白質(zhì)提取物(input)和ip產(chǎn)物的免疫印跡通過抗-yfp抗體(α-yfp)進行檢測、分條并通過抗-gmcry2a抗體(α-gmcry2a)再次檢測。

圖30.gmcib1是與ebox(canntg)相互作用的dna-結(jié)合蛋白。(a)經(jīng)由隨機結(jié)合位點選擇(rbss)分析通過gmcib1蛋白質(zhì)選擇的dna序列的比對。通過gmcib1選擇的90％以上的序列包含ebox元件(canntg)，如通過在線程序計算的(http://weblogo.berkeley.edu/).(b)競爭emsa分析表明gmcib1與dig-標記的e-boxdna的相互作用。gmcib1-dna相互作用與未標記的野生型ebox(ewt)或突變體ebox(em4)競爭，如(c)中所示。黑色楔形代表競爭者的都加量(12.5x,25x,50x，摩爾過量)。(c)野生型e-boxdna(ewt)和突變體e-box序列(em)競爭者的dna序列。(d)使用ewt或其它競爭者的競爭emsa的定量分析。在未標記的寡核苷酸競爭者存在(+uoc)下gmcib1-結(jié)合探針的信號除以不存在未標記的寡核苷酸競爭者(-uoc)gmcib1-結(jié)合探針的信號，并表示為rbu(相對結(jié)合單位)。

圖31.gmcib1通過gmcry2響應(yīng)于藍光而調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄激活因子。(a)e-box驅(qū)動雙-luc報告基因的結(jié)構(gòu)和重組e-box的dna序列。(b)顯示了螢光素酶活性的圖像。(c)相對報告基因活性的雙-luc分析。(d)gmcry2a對于gmcib1與e-boxdna響應(yīng)于藍光的dna-結(jié)合活性的抑制性效應(yīng)的gmcib1-dna結(jié)合分析。

圖32.gmcry2a和gmcib1調(diào)節(jié)葉衰老。(a-c)免疫印跡表明gmcry2a-ox植物、gmcib1-rnai植物或野生型植物(wt)中g(shù)fp-gmcry2a融合蛋白或內(nèi)源gmcry2a蛋白的表達，或者gmcib1-ox植物中yfp-gmcib1融合蛋白的表達。檢驗了各基因型的兩個獨立的品系?？偟鞍踪|(zhì)提取物在10％sds-page中分析用于通過α-gmcry2a(a,b)或α-gfp抗體(c)檢測的免疫印跡。通過抗體識別的非特異性帶(ns)分別用作加載對照。(d-f)典型子葉的圖像表明在所示的生長階段所示品系的不同程度的衰老。was,播種后周數(shù)。(g-i)子葉和單小葉按照其在所示發(fā)育階段的衰老程度分成三組(綠色，無衰老；黃色，輕度衰老；干燥，完全衰老)。葉衰老指數(shù)計算為相對于單個植株的總?cè)~數(shù)(n≥10)的各組的百分比。(j-o)相應(yīng)基因型(j-l)的葉綠素含量(葉綠素a+b)和gmcry2a-ox-1(m)、gmcry2a-rnai-1(n)、gmcib1-ox-2(o)的葉的葉綠素a:b比率(m-o)與wt的比較。收集所示發(fā)育階段中在連續(xù)白光中生長的植物的兩個單小葉和前兩個三小葉的混合樣品用于這兩個測量。顯示了平均值和標準差(n＝3)。

圖33.轉(zhuǎn)基因大豆表現(xiàn)葉衰老表型。(a)過表達gmcry2a的轉(zhuǎn)基因大豆(cry2ox)顯示出延遲的葉衰老表型。植物在連續(xù)光照中生長8.5周。(b)表達gmcry2a-rnai的轉(zhuǎn)基因大豆(cry2rnai)顯示出加速的葉衰老表型。植物在連續(xù)光照中生長7.5周。(c)過表達gmcib1的轉(zhuǎn)基因大豆(cib1ox)顯示出加速的葉衰老表型。植物在連續(xù)光照中生長7.5周。

圖34.gmcib1結(jié)合gmwrky53b染色質(zhì)以促進其mrna表達。(a)定量rt-pcr表明在連續(xù)光中生長的具有所示表型的葉中g(shù)mwrky53b的rna水平。相對表達單位(reu)通過gmwrky53b信號相對于actin11內(nèi)部對照的信號的標準化進行測量，并顯示了標準差(n＝3)。2t2、2t4、2t6或2t8:從2was、4was、6was或8was(播種后周)的植物收集的第二個三小葉。wt和轉(zhuǎn)基因系之間gmwrky53b的表達差異通過studentt檢驗進行分析:對于2was或6was的gmcry2a-ox及6was的gmcry2a-rnai或gmcib1-ox，分別地p＝0.007,0.046,0.006或0.005。(b)該圖表描述了gmwrky53b基因的預(yù)測的啟動子(箭頭)和5′utr(白色框)。黑色圓圈表示ebox(canntg)的位置。2880bpwrky53b基因組dna的不同區(qū)域通過pcr擴增。短下劃線表示單個重疊pcr產(chǎn)物的中心，星號表示推定的轉(zhuǎn)錄起始位點(tss)，數(shù)字顯示了tss上游(+)或下游(-)的位置(bp)。(c)采用所示引物組對從不同發(fā)育階段的gmcib1-ox-2和wt植物收集的樣品進行的chip-qpcr分析。植物在連續(xù)興中生長。u2、u3或u4代表2was、3was或4was階段的單小葉。chip樣品通過抗-yfp抗體制備并進行qpcr分析。chip-qpcr的結(jié)果通過相對于具有相應(yīng)輸入信號的ip信號標準化而定量，顯示了標準差(n＝3)。

圖35.gmcib1結(jié)合位于gmwrky53b染色質(zhì)中的e-boxdna序列。emsa表明gmcib1蛋白與分別對應(yīng)于gmwrky53b染色質(zhì)的c、f、k、o或q區(qū)域的各dna探針的親和性，如圖34b所示。各探針的dna序列在底部。

圖36.藍光抑制gmcib1與gmwrky53b染色質(zhì)的結(jié)合。(a)gmcib1響應(yīng)于藍光與gmwrky53b染色質(zhì)的各區(qū)域(a-r,圖34b)的親和性的比較。在短日光周期(8hl/16hd)中生長的3周齡植物轉(zhuǎn)移到黑暗中18小時，然后保持在黑暗中或暴露于藍光(22μmolm^-2s^-1)。收集第一個三小葉用于chip分析。dbu(不同結(jié)合單位)通過下式計算:[(gmcib1/wt)的ip/暗處理樣品的(gmcib1/wt)的輸入]/[(gmcib1/wt)的ip/藍光處理樣品的(gmcib1/wt)的輸入],顯示了標準差(n＝3)。gmcib1與gmwrky53b染色質(zhì)的單個區(qū)域的不同親和性通過studentt檢驗進行分析,對于“a”、“f”或“k”區(qū)域，分別地p＝0.8,0.002或0.007。(b)工作模型描繪了對于葉衰老的gmcib1-依賴性激活的gmcry2a-介導(dǎo)的藍光抑制。phr和cce:光解酶同源區(qū)域和cry的c-末端延伸。

詳細說明

下列定義和方法被提供來更好地定義本發(fā)明和在本發(fā)明的實施中指導(dǎo)本領(lǐng)域技術(shù)人員。除非另外指出，否則將根據(jù)相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)使用的含義來理解術(shù)語。

如本文中所用，術(shù)語“重組”是指通常未在自然界中發(fā)現(xiàn)的并且因而通過人干預(yù)產(chǎn)生的dna和/或蛋白質(zhì)和/或生物體形式。這樣的人干預(yù)可產(chǎn)生重組dna分子和/或重組植物。如本文中所用，“重組dna分子”為包含不能一起天然存在的dna分子的組合并且為人干預(yù)的結(jié)果的dna分子，例如由至少兩個彼此異源的dna分子的組合組成的dna分子，和/或為人工合成的并且包含從通常存在于自然界中的多核苷酸序列衍生的多核苷酸序列的dna分子，和/或包含人工地整合入宿主細胞的基因組dna的轉(zhuǎn)基因和相連的宿主細胞的基因組的側(cè)翼dna的dna分子。重組dna分子的實例為本文中描述的因轉(zhuǎn)基因至擬南芥、玉米或水稻基因組內(nèi)的插入而產(chǎn)生的dna分子，其可最終導(dǎo)致重組dna和/或蛋白質(zhì)分子在該生物體中表達。

如本文中所用，術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”是指人工地整合入宿主細胞的基因組的多核苷酸分子。這樣的轉(zhuǎn)基因?qū)τ谒拗骷毎梢允钱愒吹?。術(shù)語“轉(zhuǎn)基因植物”是指包含這樣的轉(zhuǎn)基因的植物。

如本文中所用，術(shù)語“dna”、“dna分子”、“核酸分子”是指基因組或合成來源的雙鏈dna分子，即脫氧核糖核苷酸堿基的聚合物或核苷酸分子，從5’端(上游)至3’端(下游)閱讀。

如本文中所用，術(shù)語“dna序列”、“核苷酸序列”和“多核苷酸序列”是指通常從5’(上游)末端至3’(下游)末端顯示的dna分子的核苷酸的序列。

如本文中所用，術(shù)語“分離的”是指至少部分地將分子與通常在其自體或天然狀態(tài)中與其聯(lián)接的其它分子分離。在一個實施方案中，術(shù)語“分離的基因”或“分離的dna分子”是指這樣的dna分子，其至少部分地與在自體或天然狀態(tài)中通常側(cè)翼連接所述dna分子的核酸分離。因此，例如作為重組技術(shù)的結(jié)果融合于它們通常不與其聯(lián)接的調(diào)控或編碼序列的dna分子在本文中被認為是分離的。此類分子即使當整合入宿主細胞的染色體或與其它dna分子一起存在于核酸溶液中時亦被認為是分離的。

如本文所述，術(shù)語“嚴格條件”，通常是指由sambrook等人，1989和由haymes等人在：nucleicacidhybridization,apracticalapproach,iropress,washington,dc(1985)中所描述的條件。dna雜交的合適的嚴格條件(例如大約45℃的6.0x氯化鈉/檸檬酸鈉(ssc)，接著50℃的2.0xssc洗滌)是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的，或可以在currentprotocolsinmolecularbiology,johnwiley&sons,n.y.,1989,6.3.1-6.3.6中找到。例如，洗滌步驟中的鹽濃度可以從50℃的大約2.0xssc的低嚴格條件到50℃的大約0.2xssc的高嚴格條件。另外，洗滌步驟中的溫度可以從室溫(大約22℃)的低嚴格條件增加到大約65℃的高嚴格條件。溫度和鹽都可以變化，或者溫度或鹽濃度中的一種可以保持恒定，而另一個變量發(fā)生變化。例如，中等嚴格條件可以為大約2.0xssc的鹽濃度和大約65℃的溫度，高嚴格條件可以為大約0.2xssc的鹽濃度和大約65℃的溫度。在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明的基因具有seqidno:1或seqidno:3所示的核酸序列。在本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明的基因與seqidno:1或seqidno:3所示的核酸序列共有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在本發(fā)明的進一步的方面中，本發(fā)明的基因與seqidno:1或seqidno:3所示的核酸序列共有95％、96％、97％、98％、99％和100％的序列同一性。

本發(fā)明的基因還包括gmcib1基因通過其中的一個或多個核苷酸發(fā)生缺失、置換、插入或添加的突變而衍生得到的變體序列?；蛲蛔兪侵富蚪Mdna分子發(fā)生的突然的、可遺傳的變異現(xiàn)象。從分子水平上看，基因突變是指基因在結(jié)構(gòu)上發(fā)生堿基對組成或排列順序的改變?；蛲蛔兊漠a(chǎn)生可以是自發(fā)的也可以是誘發(fā)的，人工誘變的方式包括物理誘變(如γ射線、x射線、紫外線和中子流等)、化學(xué)誘變(如烷化劑、堿基類似物和抗生素等)及生物誘變(如某些病毒和細菌等)。而且，可以利用重組dna技術(shù)使dna分子在指定位置上發(fā)生特定的變化，從而實現(xiàn)定向誘變。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用這些公知的誘變方法中的任一種來獲得包括一個或多個核苷酸發(fā)生缺失、置換、插入或添加的突變的gmcib1基因的變體序列。

擬南芥(a.thaliana)，又名鼠耳芥、阿拉伯芥、阿拉伯草。這種小小的有花植物是在植物科學(xué)，包括遺傳學(xué)和植物發(fā)育研究中的模式生物之一。其在植物學(xué)中所扮演的角色正仿佛小白鼠在醫(yī)學(xué)中和果蠅在遺傳學(xué)中的一樣。擬南芥的優(yōu)點是植株小(1個茶杯可種植好幾棵)、每代時間短(從發(fā)芽到開花不超過6周)、結(jié)子多(每棵植物可產(chǎn)很多粒種子)、生活力強(用普通培養(yǎng)基就可作人工培養(yǎng))。擬南芥的基因組是目前已知植物基因組中最小的。每個單倍染色體組(n＝5)的總長只有7000萬個堿基對，即只有小麥染色體組長的1/80，這就使克隆它的有關(guān)基因相對說來比較容易。其整個基因組已于2000年由國際擬南芥菜基因組合作聯(lián)盟聯(lián)合完成，也是第一個測序分析的植物基因組。擬南芥是自花受粉植物，基因高度純合，用理化因素處理突變率很高，容易獲得各種代謝功能的缺陷型。例如用含殺草劑的培養(yǎng)基來篩選，一般獲得抗殺草劑的突變率是1/100000。由于有上述這些優(yōu)點，所以擬南芥是進行遺傳學(xué)研究的好材料。

除了在植物形態(tài)建成研究中經(jīng)典的花發(fā)育abc模型外，近十年來，植物科學(xué)家們利用擬南芥模式系統(tǒng)，對植物不同組織和器官的發(fā)育開展了類似的研究。通過大量擬南芥突變體的分析，科學(xué)家們對植物根、莖、葉、花、胚胎和種子的發(fā)育，對植物抗病性和抗逆性機理，以及對各種生命活動有關(guān)的激素、光和環(huán)境因子引起的信號傳導(dǎo)過程等進行了深入的研究，極大豐富了人類對于植物生命活動內(nèi)在機理的認識。

本發(fā)明中的植物包括但不限于單子葉植物和雙子葉植物，包括作物植物(如玉米)、蕓苔屬(例如，甘藍、白菜、芥菜)，特別是可用作種子油來源的蕓苔物種、紫花苜蓿(medicagosativa)、水稻(oryzasativa)、裸麥(secalecereale)、高粱(sorghumbicolor,sorghumvulgare)、粟(例如，珍珠稷(pennisetumglaucum)、黍(panicummiliaceum)、小米(setariaitalica)、龍爪粟(eleusinecoracana))、向日葵(helianthusannuus)、紅花(carthamustinctorius)、小麥(triticumaestivum)、大豆(glycinemax)、煙草(nicotianatabacum)、土豆(solanumtuberosum)、花生(arachishypogaea)、棉花(gossypiumbarbadense,gossypiumhirsutum)、甘薯(ipomoeabatatus)、木薯(manihotesculenta)、咖啡(coffeaspp.)、椰子(cocosnucifera)、菠蘿(ananascomosus)、柑橘樹(citrusspp.)、可可(theobromacacao)、茶(camelliasinensis)、香蕉(musaspp.)、鱷梨(perseaamericana)、無花果(ficuscasica)、番石榴(psidiumguajava)、芒果(mangiferaindica)、橄欖(oleaeuropaea)、番木瓜(caricapapaya)、腰果(anacardiumoccidentale)、馬卡達姆堅果(macadamiaintegrifolia)、杏(prunusamygdalus)、甜菜(betavulgaris)、甘蔗(saccharumspp.)、燕麥、大麥)、蔬菜(如西紅柿(lycopersiconesculentum)、萵苣(例如lactucasativa)、青豆(phaseolusvulgaris)、菜豆(phaseoluslimensis)、豌豆(lathyrusspp.)和黃瓜屬的成員如黃瓜(c.sativus)、甜瓜(c.cantalupensis)和香瓜(c.melo))、觀賞植物(如杜鵑花(rhododendronspp.)、八仙花(macrophyllahydrangea)、芙蓉(hibiscusrosasanensis)、玫瑰(rosaspp.)、郁金香(tulipaspp.)、水仙花(narcissusspp.)、牽?；?petuniahybrida)、康乃馨(dianthuscaryophyllus)、猩猩木(euphorbiapulcherrima)和菊花)。在特定的實施方式中，本發(fā)明的植物是作物植物(例如，玉米、紫花苜蓿、向日葵、蕓苔屬、大豆、棉花、花生、高粱、小麥、粟、煙草等)。在一些實施方式中，優(yōu)選是擬南芥或大豆。

本發(fā)明從大豆(glycinemax)中克隆到9個cib1同源基因，分析了其基因結(jié)構(gòu)特點、不同組織器官和發(fā)育時期mrna的時空表達模式、在不同光周期條件下和不同緯度來源大豆品種中的mrna表達模式，并將基因過表達在擬南芥中對其功能進行初步研究，以期研究gmcib基因在大豆生長發(fā)育過程、光周期調(diào)控中發(fā)揮的作用，為gmcib基因的功能研究提供一定的理論參考。

基因組結(jié)構(gòu)分析顯示，gmcib家族基因成員都含有不同數(shù)目和長度的外顯子和內(nèi)含子，以及不同長度的utr。復(fù)雜的基因組結(jié)構(gòu)可能也會產(chǎn)生不同的基因轉(zhuǎn)錄后修飾，同時伴隨著不同的基因功能。

亞細胞定位分析看出，雖然gmcib為轉(zhuǎn)錄因子但亞細胞定位并不僅僅是位于細胞核內(nèi)，gmcib6和gmcib7蛋白在細胞核和細胞質(zhì)中均有表達，暗示了它們可能在細胞質(zhì)內(nèi)也能行使功能。

gmcibs不同組織器官的時空表達分析顯示各成員在不同組織器官的表達各異，表達模式也比較復(fù)雜。整體上看大部分基因在開花時期的器官中表達量較高，推測可能這一家族基因在大豆開花調(diào)控中起到一定的作用。目前研究顯示擬南芥cib1主要功能是調(diào)控植物開花，可為以上推測提供理論依據(jù)。gmcibs中有些基因在單葉期的組織器官中也有較高的表達，如gmcib1/2/3/9在剛剛張開的單葉中表達量很高，可能這些基因除有開花調(diào)控的作用，可能還參與到其他調(diào)控途徑中。

大豆cib基因不同發(fā)育時期表達模式綜合分析看，除gmcib2外，其他基因地上部分的表達量都較低，大部分基因表達量較高時期主要集中在營養(yǎng)生長后期，生殖生長初期階段即開花期，這表明這些基因可能參與到大豆的開花調(diào)控。但是也有些基因在生殖生長初期階段如單葉時期也有很高的表達量，gmcib1在單葉期和開花初期的表達量都很高，而在發(fā)育中間階段表達量卻很低?？赡茉摶蛟跔I養(yǎng)生長和生殖生長的初級階段均起到重要的調(diào)控作用，對發(fā)育調(diào)控起到雙重作用。而gmcib6的整體表達水平都很低，可能該基因?qū)Πl(fā)育調(diào)控中的作用很小，或者是受某種信號誘導(dǎo)表達的基因。

光周期和生物鐘分析顯示，gmcib家族成員中這兩種表達模式較為復(fù)雜?？傮w上看大部分基因受光周期和生物鐘共同調(diào)控，只是兩種調(diào)控機制所占主導(dǎo)地位不同?？v觀所有成員，gmcib4在長日照條件的表達有明顯的生物鐘節(jié)律，而在短日照下，生物鐘節(jié)律明顯受到光周期調(diào)控拮抗，當轉(zhuǎn)入連續(xù)光照是基因整體表達水平調(diào)高而在連續(xù)黑暗條件下基因一直維持在很低的表達水平。暗示了該基因在ld和sd條件下的調(diào)控機制有差異，這也可能由于大豆是嚴格的短日照植物，在兩種光照條件迥異的條件下可能有不同的調(diào)控機制。雖然光周期和生物鐘共同調(diào)控著基因的表達，對各成員的進一步分析發(fā)現(xiàn)，大部分基因(除gmcib1和gmcib9外)在sd和ld條件下，都有明顯或不很明顯生物鐘節(jié)律，在一天的表達中都有峰值和谷值出現(xiàn)，轉(zhuǎn)入ll和dd后生物鐘節(jié)律被消減，而光周期調(diào)控占主導(dǎo)地位，ll條件下基因的整體表達水平提高，基因在dd條件下一直維持這較低的表達水平。gmcib2例外，在ll條件下該基因表達明顯受到抑制，而在dd條件下表達量相對較高，說明gmcib2的表達受光照的抑制。

不同緯度來源大豆品種中g(shù)mcibs表達模式顯示，基因的表達模式與緯度間未發(fā)現(xiàn)明確的相關(guān)性。整體分析表明，不同緯度來源的品種中，無論在sd或ld環(huán)境下基因的表達都有隨光照時間的增加逐漸增加的趨勢，在增加過程中，有些基因在某些品種基因的表達在正午時刻(n)達到峰值后而逐漸降低，而有些會持續(xù)增加一直到黑暗來臨(e)前達到峰值。很少一部分基因的表達呈現(xiàn)逐漸降低的模式。

將克隆到的gmcibs構(gòu)建過表達植物表達載體轉(zhuǎn)化擬南芥，對得到的轉(zhuǎn)基因植株進行表型分析。在長日和短日條件下，過表達gmcib1/4/5/6/8的轉(zhuǎn)基因擬南芥表現(xiàn)出早開花表型，與擬南芥cib1的功能類似。在過表達gmcib1的轉(zhuǎn)基因植株中對下游靶基因atft表達水平檢測顯示，atft的表達水平明顯高于野生型，說明外源gmcib1的表達可提高atft的轉(zhuǎn)錄水平從而促進植物早開花。雖然gmcib1在擬南芥中的功能與cib1相似，但是大豆是典型的短日照植物，而擬南芥是長日照植物，兩者的調(diào)控機理有可能不同，所以需進行大豆遺傳轉(zhuǎn)化進一步研究gmcib基因在大豆中的功能。

此外，發(fā)明人通過酵母雙雜交實驗初步驗證了gmcib1與gmcry2在藍光下特異的相互作用。本研究將通過酵母雙雜、bifc以及co-ip等手段研究gmcrys與gmcib1蛋白間的相互作用；進一步獲得gmcry與gmcib1基因過表達或rnai敲除的大豆遺傳轉(zhuǎn)化株系，結(jié)合轉(zhuǎn)基因后代的表型分析和chip實驗來尋找gmcib1的下游作用靶基因，從而分析大豆中g(shù)mcry傳遞藍光信號的gmcib信號通路，為大豆光周期和葉片衰老調(diào)控的深入研究和種質(zhì)創(chuàng)新打下基礎(chǔ)。

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的子葉節(jié)轉(zhuǎn)化方法獲得gmcry1-ox,gmcry2-ox,gmcry2-rnai和gmcib1-ox轉(zhuǎn)基因大豆，分別對轉(zhuǎn)基因植株進行表型分析；利用酵母雙雜交、bifc以及免疫共沉淀等手段研究了gmcrys和gmcib1將的相互作用；分析了gmcib1與dna體外相互作用的位點，并通過chip試驗初步篩選鑒定gmcib1的下游作用靶基因。主要得到以下結(jié)論：

gmcry1-ox,gmcry2-ox,gmcry2-rnai和gmcib1-ox轉(zhuǎn)基因大豆表型分析結(jié)果表明，在連續(xù)光照下，過表達gmcry2導(dǎo)致植株葉片衰老延遲，而在gmcry1-ox,gmcry2-rnai和gmcib1-ox轉(zhuǎn)基因大豆出現(xiàn)葉片提前衰老的表型，初步推測gmcry1和gmcib1在葉片衰老調(diào)控過程中起到正調(diào)控的作用，而gmcry2可能抑制葉片的衰老。

過表達gmcry1和gmcry2敲除轉(zhuǎn)基因大豆表現(xiàn)出提前開花，而過表達gmcry2、gmcib1則導(dǎo)致大豆晚開花，暗示了gmcry1促進開花，而gmcry2和gmcib1負調(diào)控大豆開花。酵母雙雜交和bifc試驗表明，gmcry2和gmcib1有藍光特異的相互作用，且這種相互作用隨著光強的增強和光照時間的增加而增強。gmcry1和gmcry2的phr結(jié)構(gòu)域參與和gmcib1藍光依賴的相互作用。體內(nèi)(gmcib1-ox轉(zhuǎn)基因大豆)和體外(昆蟲蛋白表達系統(tǒng))pull-down試驗進一步驗證了gmcry1/gmcry2與gmcib1間藍光依賴的相互作用。

gmcib1與dna體外的相互作用結(jié)果顯示gmcib1與e-box結(jié)合，chip試驗顯示，gmcib1與擬南芥ft的同源基因gmft3和gmft4染色體區(qū)的e-box結(jié)合，也能與衰老相關(guān)基因wryk53的同源基因gmwryk53啟動子區(qū)核基因組內(nèi)的e-box結(jié)合，并且這種結(jié)合沒有嚴格的藍光特異性，推測gmcib1在大豆體內(nèi)可能通過負調(diào)控gmft的表達抑制開花，促進衰老相關(guān)基因如gmwryk53的轉(zhuǎn)錄進而促進葉片衰老。

實施例1、大豆cib家族基因的克隆與表達模式分析

2008年在擬南芥中通過酵母雙雜交篩選到第一個與隱花色素cry2有藍光特異相互作用的蛋白，命名為cib1(cry-interactingbhlh1)。cib1是bhlh家族中的一個成員。在酵母細胞中，cib1與cry2的相互作用是藍光波長特異的，且相互作用的強度隨著藍光強度的增強和光照時間的增加而增強。cib1的結(jié)構(gòu)功能研究顯示，其n端結(jié)構(gòu)域能夠執(zhí)行與蛋白相互作用的功能；而含有bhlh基序的c端結(jié)構(gòu)域參與到與dna的相互作用，從而通過順式作用元件調(diào)控目的靶基因。擬南芥中cib1通過與ft啟動子區(qū)的e-box(canntg)的結(jié)合來提高ft的轉(zhuǎn)錄水平，從而啟動植物開花。

本研究從大豆(glycinemax)中克隆到9個cib1同源基因，分析了其基因結(jié)構(gòu)特點、不同組織器官和發(fā)育時期mrna的時空表達模式、在不同光周期條件下和不同緯度來源大豆品種中的mrna表達模式，并將基因過表達在擬南芥中對其功能進行初步研究，以期研究gmcib基因在大豆生長發(fā)育過程、光周期調(diào)控中發(fā)揮的作用，為gmcib基因的功能研究提供一定的理論參考。

1.材料與方法

1.1材料

1.1.1植物材料

(1)大豆材料：

大豆墾農(nóng)18(kn18)以及10個其它栽培大豆品種，種植于溫室，培養(yǎng)條件為：長日照(16h光照/8h黑暗)或短日照(8h光照/16h黑暗)，培養(yǎng)溫度為25-28℃。發(fā)育時期和組織器官樣品：將大豆墾農(nóng)18(kn18)種植于短日條件下，培養(yǎng)溫度為25-28℃。

當單葉張開前取地上部幼苗；單葉張開期取根、下胚軸、上胚軸、子葉、單葉和莖尖；在開花期(第四復(fù)葉期)取根、莖、單葉、第一復(fù)葉、第二復(fù)葉、第三復(fù)葉和花；在花后7d，14d和21d取不同發(fā)育時期的果莢和種子；分別在單葉期、第一復(fù)葉期、第二復(fù)葉期、第三復(fù)葉期、第四復(fù)葉期(開花期)取地上部分。光照開始后30min取樣。

光周期樣品：大豆墾農(nóng)18(kn18)分別種植于長日和短日條件下，當單葉剛展開時每間隔2h取樣，各取24個時間點(48h)，隨后將幼苗分別轉(zhuǎn)移至連續(xù)光照(ll)和連續(xù)黑暗(dd)條件下，每間隔2h取樣，各取24個時間點(48h)。

不同維度來源大豆品種樣品：選用11個栽培大豆品種，即黑河27(hh27)、綏農(nóng)14(sn14)、墾農(nóng)18(kn18)、長農(nóng)13(cn13)、鐵豐31(tf31)、冀豆12(jd12)、中黃13(zh13)、中豆31(zd31)、浙春3(zc3)、福豆1(fd1)和桂早2(gz2)，在長日和短日條件下種植，單葉完全張開時取樣，分別在光照開始30min(m)、光照時間中間點(n)、光照結(jié)束前30min(e)取樣。

所有樣品取樣后立即用液氮冷凍后貯于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

(2)擬南芥材料：

擬南芥野生型col-0，生長溫度為21～22℃，光照時間為長日(16h光照/8h黑暗)和短日照(8h光照/16h黑暗)。

1.1.2菌株及質(zhì)粒

根癌農(nóng)桿菌菌株gv3101::pmp90rk由本實驗室保存，大腸桿菌菌株dh5α購自全式金公司。gatewayt載體pgwc來自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)陳其軍副教授實驗室。植物表達載體pleela、pensg-yfp-gw本實驗室提供。

1.1.3酶與試劑盒

primerstar擴增酶、sybrgreenikit購自takara公司，gatewaylrclonaseenzymemix均購自invitrogen公司，膠回收及質(zhì)粒小提試劑盒購自axygen公司，質(zhì)粒小提中量試劑盒購自天根公司。

1.2實驗方法

1.2.1生物信息學(xué)分析

(1)候選基因的確定

根據(jù)擬南芥cib1基因的cds(codesequence)和氨基酸序列，在http://www.phytozome.net網(wǎng)站中進行l(wèi)ocalblast，篩選出大豆中的同源基因。

(2)引物設(shè)計與pcr擴增

根據(jù)基因的cds序列，基因克隆引物利用primerpremier5.0進行設(shè)計。real-time引物采用beacondesigner7.0軟件進行設(shè)計。引物合成由上海生工生物公司完成。

(3)基因的染色體定位

根據(jù)大豆基因組網(wǎng)站phytozome(http://www.phytozome.net)提供的信息確定基因在染色體上的位置，按照基因和染色體的長度比例用adodeillustratorcs3進行繪制。

(4)基因結(jié)構(gòu)分析

將預(yù)測所得的大豆基因組dna序列與相應(yīng)的cdna基因序列在gsds(http://gsds.cbi.pku.edu.cn)網(wǎng)站中進行比對，確定基因utr區(qū)、內(nèi)含子和外顯子的位置以及長度。采用adodeillustratorcs3序列長度比例進行繪制基因結(jié)構(gòu)模式圖。

(5)同源片段的分析

采用生物學(xué)軟件clustalx2.1軟件，dnastar軟件包，genedoc2.7軟件，mega4軟件包，以及http://weblogo.berkeley.edu網(wǎng)站對預(yù)測基因的同源片段進行分析。

表1克隆基因的引物及序列

表2用于qrt-pcr的引物序列

(1)rna的提取

1)在研缽中加入液氮，迅速將樣品充分磨碎，用rnase-free離心管盛約30mg樣品(到100μl刻度處)。

2)加入350μlra1buffer和3.5μlβ-me，充分渦旋振蕩，使其完全混勻。

3)室溫下8000g離心1min，將上清轉(zhuǎn)移到粉色的過濾柱中，室溫11000g離心1min，液體轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管，棄去過濾柱。

4)加入350μl70％乙醇，渦旋振蕩25s，充分混勻。

5)將液體轉(zhuǎn)移至藍色的吸附柱中，8000g離心30s，rna被吸附到柱子上。

6)除鹽，加入350μlmdbbuffer，11000g離心1min，棄去廢液。

7)除dna，向吸附柱加入95μldnasereactionmixture，室溫靜置15min。

8)清洗，加入200μlra2buffer，11000g離心2min，更換新的收集管。加入600μlra3buffer，11000g離心1min，棄去廢液，加入250μlbuffer，11000g離心2min，棄廢液。

9)更換新的rnase-free離心管，向吸附膜中央加入60μlrnase-freeh2o，11000g離心1min，重復(fù)一次，以增加洗脫率。此步驟在冰上操作。得到的rna放于-80℃冰箱保存。

表3用于chip-pcr的引物序列

表4用于chip-pcr的引物序列

(2)cdna第一鏈的反轉(zhuǎn)錄合成

2)在冰上向nuclease-freepcr管中依次加入下列試劑：

totalrna6μl(0.1ng-5μg)

oligo(dt)18primer1μl

nuclease-free5μl

置于pcr儀中65℃反應(yīng)5min。

2)然后再加入以下試劑：

輕輕混勻，在pcr儀中45℃反應(yīng)60min。

2)pcr儀中，70℃5min，終止反應(yīng)。

(3)實時熒光定量pcr

實時熒光定量pcr采用abistepone進行，利用sybrgreeni檢測熒光信號。

1)反應(yīng)體系為15μl：

2)反應(yīng)程序為：

兩步法：

stage1：熱啟動95℃10s；

stage2：pcr反應(yīng)95℃5s，60℃1min，40cycles；

stage3：融解曲線分析95℃15s，60℃1min，95℃15s。

三步法：

stage1：熱啟動95℃10s；

stage2：pcr反應(yīng)95℃5s，58℃30s，60℃1min，40cycles；

stage3：融解曲線分析95℃15s，60℃1min，95℃15s。

若兩步法不理想時，利用三步法對退火溫度進行調(diào)整優(yōu)化。

3)基因相對表達量的計算計算公式為：相對表達量(rq)＝2^-△△ct

1.2.3基因的克隆及載體構(gòu)建

(1)目的片段的擴增：該實驗的模板為大豆墾農(nóng)18(kn18)各組織部位cdna的混合物。

pcr反應(yīng)體系如下：

反應(yīng)程序：98℃變性10s，57℃退火5s，72℃延伸2min30s，35個循環(huán)，25℃保溫。

(2)pcr產(chǎn)物回收和產(chǎn)物連接

瓊脂糖凝膠回收試劑盒(購自axygen公司)回收pcr產(chǎn)物，回收片段與線性化的pgwc載體進行連接。在使用前，該載體經(jīng)過eam1105i酶切而產(chǎn)生兩端有5’t的線性化載體?；厥盏膒cr產(chǎn)物與酶切后的pgwc載體連接，檢測正向克隆并送測序。

pgwc載體的酶切反應(yīng)體系如下：

反應(yīng)混和液于37℃溫育4-6h。瓊脂糖凝膠電泳檢測1μl酶切反應(yīng)液的酶切效果，大體估計載體片段濃度，無需純化酶切反應(yīng)液直接用作連接。

dna回收片段與pgwc-t的連接：

反應(yīng)液16℃過夜連接(約12～16h)后用于轉(zhuǎn)化實驗。

(3)大腸桿菌dh5α的轉(zhuǎn)化

a)在超凈臺中取50μl冰上凍融的感受態(tài)細胞，加入5μl連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰浴置30min。

b)42℃水浴鍋熱激45s，快速轉(zhuǎn)移到冰上放置2min。

c)加入500μl無抗的lb培養(yǎng)基于離心管中，37℃，200rpm培養(yǎng)1h。

d)將菌液加均勻涂布與含有相應(yīng)抗生素(氯霉素chl)的lb平板上，待液體完全吹干后，倒置平板，37℃培養(yǎng)過夜。

(4)陽性克隆的鑒定

用牙簽挑取平板上的單克隆，在含有氯霉素抗生素的lb平板劃線，然后將牙簽在含有pcr反應(yīng)混合物的管中輕輕攪動幾下，進行菌落pcr來鑒定?？梢蕴羧《鄠€單克隆，并在平板上做好標記，以增加獲得陽性克隆的概率。之后將平板置于37℃過夜培養(yǎng)。

pcr體系：

pcr程序：反應(yīng)程序：98℃6min，94℃30s，57℃30s，72℃2min，35個循環(huán)，

pcr產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，有目的片段的克隆，把對應(yīng)平板上的劃線，送菌液測序，得到連有正向基因的陽性克隆。

(5)質(zhì)粒提取對于測序正確的單克隆，擴搖菌液，用試劑盒提取質(zhì)粒，步驟如下：

a)取2ml培養(yǎng)過夜的菌液，12000g離心1min，棄盡上清。

b)加250μlbuffers1(含有rnase)用移液器吹打懸浮細菌沉淀，一定要保證均勻。

c)加入250μlbuffers2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)數(shù)次混合均勻，使菌體充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步驟不宜超過5min，以防質(zhì)粒dna被裂解。

d)加入350μlbuffers3，溫和并充分地混合數(shù)次，12000g離心10min。

e)吸取上清轉(zhuǎn)移到制備管(置于2ml離心管中)，12000g離心1min，棄濾液。

f)將制備管放回2ml離心管中，加500μlbufferw1，12000g離心1min，棄濾液。

g)將制備管放回離心管，加700μlbufferw2，12000g離心1min，棄濾液；重復(fù)一次。

h)將制備管放回2ml離心管中，12000g離心1min。

i)將制備管移入干凈的1.5ml離心管中，在吸附管膜中央加40μl

ddh2o，室溫靜置1min。12000g離心1min，洗脫質(zhì)粒dna。

(6)基因表達載體的構(gòu)建

本實驗中用到的表達載體均含有g(shù)ateway重組系統(tǒng)，pgwc帶有目的基因的質(zhì)粒作為入門載體(enteryvector)，通過lr反應(yīng)可完成目的基因表達載體的構(gòu)建。

lr反應(yīng)體系：

25℃反應(yīng)過夜。反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α，篩選陽性克隆。

(7)農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備與轉(zhuǎn)化

1)農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備

挑取農(nóng)桿菌gv3101::pmp90rk和eha105單菌落分別置于5ml含相應(yīng)抗生素的lb液體培養(yǎng)基中，gv3101::pmp90rk抗性為：100μg/ml利福平(rif)，50μg/ml卡那霉素(kan)、50μg/ml慶大霉素(gen)；eha105抗性為：100μg/ml利福平(rif)。28℃培養(yǎng)過夜；取過夜培養(yǎng)菌液

500μl接種于50mllb含相應(yīng)抗生素的液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)到od600約為0.5；冰上放置30min；4℃，5,000rpm離心10min，用15ml預(yù)冷的10mmcacl2重懸農(nóng)桿菌細胞，4℃，5,000rpm離心10min；用2ml預(yù)冷的10mmcacl2重懸沉淀，冰上100μl/管分裝，液氮速凍，-80℃保存。

2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

取100μl感受態(tài)細胞冰上解凍，加入1μg質(zhì)粒dna混勻后，冰上放置30min，液氮速凍3-5min后立即放于37℃水浴5min，加入1ml無抗lb液體培養(yǎng)基，28℃，160rpm復(fù)蘇3-5h后菌液均勻涂于含相應(yīng)抗生素的固體培養(yǎng)基上。28℃倒置培養(yǎng)2～3d，挑單菌用pcr鑒定陽性克隆。

1.2.4原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化及瞬時表達觀察亞細胞定位

(1)小提中量試劑盒提取質(zhì)粒dna(提取方法參考天根小提中量試劑盒質(zhì)粒提取方法)

(2)擬南芥原生質(zhì)體制備

a)取未抽苔的幼嫩擬南芥葉片，將葉片切為0.5mm-1mm大小，棄去葉尖和葉柄。

b)將碎葉浸10ml酶解液中，暗培養(yǎng)3-4h，直至原生質(zhì)體完全解離。

c)鏡檢檢驗酶解效果。

d)200目不銹鋼網(wǎng)篩過濾原生質(zhì)體至新離心管中，讓液體沿著管壁慢慢滑下，移液器使用的槍頭應(yīng)剪切尖頭，避免吸取過程中原生質(zhì)體破裂。

e)低速100g離心1min，棄上清，收集原生質(zhì)體；

f)用等體積預(yù)冷的w5液體培養(yǎng)基重懸原生質(zhì)體，100g離心1min，棄去上清(重復(fù)一次)。

g)等體積預(yù)冷的w5液體重懸原生質(zhì)體，冰上放置30min。

h)100g離心1min，收集原生質(zhì)體，1/10體積mmg液體重懸原生質(zhì)體。

(3)peg轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體

a)2ml離心管中依次加入10μl質(zhì)粒dna(10-20μg)，100μl上述原生質(zhì)體，輕輕彈動管壁，充分混勻后加入110μlpeg-4000溶液?；旌衔锸覝仂o置30min。

b)加入440μlw5液體培養(yǎng)基，充分混勻。

c)低速100g離心1min，棄去上清，，收集原生質(zhì)體。

d)加入500μlw5液體，100g離心1min，收集原生質(zhì)體，重復(fù)一次。

e)1mlw5液體培養(yǎng)基重懸原生質(zhì)體后加入到細胞培養(yǎng)板中，25℃避光培養(yǎng)18-20h。

f)100g離心1min，然后僅留下100μl液體懸浮原生質(zhì)體，其余上清液體棄去，使用激光共聚焦顯微鏡成像保存。

1.2.5擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化及表型觀察

(1)農(nóng)桿菌的準備

1)將含有目的載體的農(nóng)桿菌(gv3101::pmp90rk)接種于lb(含有相應(yīng)抗生素)液體培養(yǎng)基；28℃,180-210rpm過夜培養(yǎng)；

2)吸取500μl菌液涂布于含相應(yīng)抗生素的lb固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)過夜。

3)30mlyeb液體培養(yǎng)基刮起并重懸菌斑，重懸液用含有5％蔗糖和0.01％silwet-l77的水溶液稀釋到120ml，用于擬南芥轉(zhuǎn)化。

(2)擬南芥的轉(zhuǎn)化

1)長日照下生長的擬南芥種，剪掉抽苔后第一個花序；一周左右待更多花蕾露出時可用于轉(zhuǎn)化；

2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液浸泡花蕾10-20s。將已轉(zhuǎn)化植株用黑色塑料袋罩住避光、保濕，16-24h后掀開塑料袋；

3)視植株生長情況，待下一批花蕾出現(xiàn)(兩周后)，可進行第二次轉(zhuǎn)化。精心照看轉(zhuǎn)化后的植株，收種子用于轉(zhuǎn)化陽性植株的篩選。

(3)篩選與初步鑒定擬南芥轉(zhuǎn)化后代

轉(zhuǎn)化后收到的種子為t1代，均勻播種于土中，7-10d后子葉完全張開，此時即可噴灑1:1000的basta，5-7d后噴第二次。一周左右非轉(zhuǎn)化植株全部萎蔫死亡，此時的植株即為轉(zhuǎn)基因t2代植株，同時可通過提取dna、pcr檢測，來對t1代轉(zhuǎn)基因植株進行初步鑒定。單株收獲t2代種子。

(4)擬南芥開花時間與葉片的統(tǒng)計

種子置于含浸濕濾紙的培養(yǎng)皿中，4℃黑暗處理3-4d，然后播于土上，三周左右留下生長一致且長勢較好的苗。將對照和待檢測的苗種置于同樣的條件下生長，每個株系確保有10-40個單株。統(tǒng)計從種植到開花時的開花時間和蓮座葉片數(shù)的平均值和標準差。

2.結(jié)果與分析

2.1大豆cib基因的克隆

根據(jù)擬南芥cib1序列，在大豆基因組網(wǎng)站進行blast分析，發(fā)現(xiàn)大豆cib基因家族中共有12個成員(表5)，其中g(shù)mcib1、gmcib2、gmcib3、gmcib11與擬南芥cib1的同源性較高，推測它們可能與cib1有類似的功能。而其他成員在擬南芥中的同源基因均屬于bhlh家族。目前共克隆到了9個gmcib基因。

2.2大豆cib基因的染色體定位

根據(jù)網(wǎng)站http://www.phytozome.net提供的大豆基因組相關(guān)信息繪制12個gmcib基因在染色體上定位模式圖(圖1)。12個基因分布在大豆的11條染色體上，除gmcib2和gmcib8共同分布在4號染色體上，且物理距離很近。其他10個基因均分布在不同的染色體上。從每個基因在染色體上的分布位置看，這12個基因大都分布在染色體的長臂上，只有g(shù)mcib5、gmcib9、gmcib10位于染色體短臂上。

2.3大豆cib基因同源性及保守位點分析

2.3.1同源性分析

在擬南芥中cib1和cib5調(diào)控開花?；虻耐葱苑治霭l(fā)現(xiàn)(圖2)，大豆cib基因與擬南芥cib1、cib5的同源性大都在30％以上。gmcib1、gmcib2、gmcib3、gmcib11與擬南芥cib1的同源性較高，分別為41.6％、42.1％、39.2％和39.4％，而它們與cib5的同源性稍低于與cib1的同源性，同源性在30％左右。gmcib9和gmcib10與cib1的同源性在30％左右，而與cib5的同源性較高，分別為51.2％和50.5％。

大豆cib基因間同源性的高低參差不齊，如gmcib1和gmcib2同源性高達91％，而這兩個基因與其他基因的同源性明顯低于這一數(shù)值。gmcib1除與gmcib11的同源性較高外，與其他基因的同源性相對較低。進一步分析發(fā)現(xiàn)12個大豆cib基因中分成兩兩基因間同源性很高6對組合，而此兩基因與其他基因間的同源性比較低。這可能是因為大豆為古四倍體，長期進化選擇過程中，不同來源的兩個基因被保留下來形成了2個拷貝，以至于很多基因以多拷貝方式存在。

表5大豆12個cib基因家族成員

注：a序列信息來自

phytozome(http://www.phytozome.net/cgi-bin/gbrowse/soybean/)b本地blastp比對擬南芥蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫。

2.3.2保守位點分析

擬南芥cib1是典型的bhlh家族基因，含有保守的bhlh結(jié)構(gòu)域，對大豆cib家族的保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)(圖3)，所有基因都含有bhlh結(jié)構(gòu)域，且含有與擬南芥相同的氨基酸保守位點，basic堿性區(qū)典型的色氨酸t(yī)ry(r)[除gmcib8為絲氨酸ser(s)]，helix螺旋區(qū)的亮氨酸leu(l)，loop嚕噗環(huán)中的脯氨酸pro(p)。從功能上看，擬南芥bhlh結(jié)構(gòu)域參與到與dna的相互作用，通過與啟動區(qū)的順式作用元件結(jié)合來調(diào)控下游目標靶基因的表達。大豆的cib家族含有如此保守的bhlh結(jié)構(gòu)域，是否也參與到與dna順式作用元件的結(jié)合，目前還不清楚。

進一步對保守序列的同源性進行分析發(fā)現(xiàn),gmcib7和gmcib8在進化的最外分支，gmcib1/2/3/11，gmcib4/6/12以及gmcib9/10分別聚為一類。雖然基因的保守結(jié)構(gòu)域的保守位點幾乎一致，但是其他氨基酸的同源性很低可能是在長期進化過程中，不同的選擇壓力而造成的功能分化。

2.4大豆cib基因的基因結(jié)構(gòu)

擬南芥cib1編碼區(qū)結(jié)構(gòu)的顯示，從功能上可將基因分為n端和c端，n端含有一段核定位信號(nls)參與到基因的入核定位以及蛋白間的相互作用，c端的bhlh結(jié)構(gòu)域可以與dna結(jié)合(作用元件)，調(diào)控下游靶基因的表達。大豆cib基因編碼區(qū)結(jié)構(gòu)與cib1類似，bhlh結(jié)構(gòu)域也位于基因的c端。

基因組結(jié)構(gòu)分析顯示，大豆cib基因組的保守性比較低，這是因為各個基因組結(jié)構(gòu)組成復(fù)雜。圖4顯示每個基因都含有不同數(shù)目的外顯子和內(nèi)含子，且都含有不同長度的5’utr。除gmcib1/2/3/11含有3’utr外其他基因沒有，這剛好與此四個基因在進化上比較近相吻合。從外顯子和內(nèi)含子的數(shù)目上看，gmcib1/4/5/6均含有7個外顯子和6個內(nèi)含子，其中g(shù)mcib4/5/6每個相對應(yīng)的外顯子和內(nèi)含子的長度差別不是很大。gmci1/8/11均含有6個外顯子和5個內(nèi)含子，而gmcib8的第五個內(nèi)含子長度是所有基因中最長的。gmcib12所含外顯子數(shù)目最多有12個，而gmcib9所含內(nèi)含子數(shù)目最多有9個。

2.5大豆cib基因的亞細胞定位

為了初步確定大豆cib基因在細胞內(nèi)的定位，構(gòu)建了大豆cib基因與黃色熒光蛋白(yfp)融合的表達載體，利用擬南芥葉肉細胞進行原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，對已克隆的gmcib蛋白的亞細胞定位進行分析。結(jié)果顯示(圖5)除gmcib6和gmcib7蛋白在細胞核和細胞質(zhì)中均有表達，其他gmcib蛋白均定位于細胞核內(nèi)。

2.6大豆cib基因的表達模式分析

2.6.1大豆cib基因在不同組織器官的表達模式表達

利用大豆在單葉期、開花期和結(jié)莢期的20個不同組織器官對大豆cib基因家族中的9個基因的表達情況進行分析。結(jié)果顯示(圖6)大豆cib基因在不同組織器官的表達各異。gmcib1、gmcib2、gmcib3的表達模式相似，在單葉期后期和開花期早期的組織器官中表達量較高，而在單葉期早期和開花期后期組織器官中的表達量較低。這三個基因在單葉期和開花期的單葉中表達量都很高，此外gmcib1和gmcib2在開花期的第二復(fù)葉，gmcib1開花期的第一復(fù)葉中的表達量也很高。其他6個基因的mrna表達分析顯示，它們在開花后期和結(jié)莢時期的組織器官中的表達量較高。gmcib5/6/7/8/9在花器官中的表達量都相對較高，gmcib7在開花期的第二復(fù)葉高表達，gmcib4和gmcib5結(jié)莢后期表達量很高，而在成熟種子中表達量劇減，可能該基因不參與種子的后成熟。與此相反，gmcib6/7/8/9在結(jié)莢后期表達量很低，而在成熟種子中表達量劇增，可能這些基因種子的后成熟有關(guān)。該推論的科學(xué)論證還需進一步探索。

表6大豆不同組織器官的樣品

2.6.2大豆cib基因在不同發(fā)育時期的表達模式

表7大豆不同發(fā)育時期的樣品

大豆cib基因在不同發(fā)育時期的表達模式各異(圖7)，從所有基因的整體表達模式看，大豆cib基因中除gmcib2外，其他基因地上部分的表達量都較低，表達量較高時期主要集中在復(fù)葉時期，個別基因(gmcib1)在單葉期也有很高的表達量。單個基因的表達水平顯示，gmcib6的整體表達較低，而gmcib8的整體表達水平較高。gmcib1/3/4/7在第三復(fù)葉剛張開時的表達量很高，gmcib1在各個發(fā)育時期的單葉中都有表達。進一步分析發(fā)現(xiàn)gmcib4和gmcib7發(fā)育時期表達模式類似，除在第三復(fù)葉開始張開到第四復(fù)葉開始張開期間表達很高外，其他時期的表達都很低。gmcib5和gmcib9在果莢發(fā)育階段的表達模式相反，gmcib5的表達量隨著果莢發(fā)育而不斷增加但在種子成熟期表達劇減，而gmcib9在果莢剛開始發(fā)育時表達量達到較高水平，隨著果莢的發(fā)育其表達量不斷減低，但在成熟種子該基因的表達量劇增。這樣的表達模式可能與基因在發(fā)育時期所行使的功能有關(guān)。

2.6.3大豆cib基因的光周期表達模式

大豆cib光周期表達模式所涉及到的樣品取材如下：墾農(nóng)18(kn18)幼苗分別種植于長日(ld)和短日條件下(sd)，樣品為剛展開的單葉，剛開燈時刻開始取樣，每間隔2h取樣，各取24個時間點(48h)。隨后將幼苗分別轉(zhuǎn)移至連續(xù)光照(sd-ll/ld-ll)和連續(xù)黑暗(sd-dd/ld-dd)條件下，每間隔2h取樣，各取24個時間點(48h)。各組樣品用于gmcibs光周期表達分析，結(jié)果顯示(圖8)gmcibs的光周期表達差異很大。gmcib1(圖8a)sd和ld條件下的表達模式不同，sd條件下，基因表達呈現(xiàn)周期節(jié)律變化，開燈后基因表達呈現(xiàn)下降趨勢，進入黑暗時基因的表達還處于低水平表達，在亮燈前4小時基因表達峰值出現(xiàn)。轉(zhuǎn)入連續(xù)光照后，基因的表達周期節(jié)律改變，出現(xiàn)多個表達峰值。而轉(zhuǎn)入連續(xù)黑暗時，其周期節(jié)律整體模式變化不大，但基因的表達峰值向后推遲了兩小時。ld條件下，gmcib1的表達沒有明顯的光周期節(jié)律。

圖8b顯示了gmcib2在sd和ld條件下的光周期表達情況，ld條件下gmcib2表達沒有明顯的周期節(jié)律現(xiàn)象。而在sd條件下gmcib2在開燈后表達量逐漸降低，在進入黑暗時其表達量達到最低，隨后基因的表達逐漸增加，在開燈前4小時基因的表達達到最高。當從sd轉(zhuǎn)入ll時基因表達整體水平有所下降，雖然表達峰值出現(xiàn)的時刻沒有變化，但其幅度明顯下降。而從sd轉(zhuǎn)入dd時基因整體表達水平大幅提高，基因表達的峰值也被覆蓋?？蛇M一步推測，gmcib2的表達在sd條件下受光周期的調(diào)控，同時還受到光的抑制作用。

gmcib1的光周期表達模式在sd和ld條件下相類似，開燈后基因表達有稍短時間的降低，6小時后(即正午時刻)基因表達逐漸增加，熄燈后6小時基因表達達到最高，隨后表達量劇減。

分別轉(zhuǎn)入ll時，基因表達的峰值消失了，基因表達維持在中高等水平。而當轉(zhuǎn)入dd時，基因的表達量明顯降低。以上現(xiàn)象說明，gmcib1的mrna表達受光的正調(diào)控。

gmcib4的光周期表達模式分析顯示(圖8d)，該基因在ld有明顯的晝夜周期節(jié)律，關(guān)燈后6小時該基因的表達量最高，而其它時間其表達量相對較低。當轉(zhuǎn)入ll后表達模式幾乎沒有改變，轉(zhuǎn)入dd后表達峰值推遲2h出現(xiàn)。sd條件下基因表達在亮燈6小時后達到最高，隨后呈降低趨勢。但轉(zhuǎn)入ll時基因的表達明顯增加，而在dd條件下基因一直處于較低的表達水平。可能sd下，光周期調(diào)控強度大于植物體內(nèi)的生物鐘調(diào)控，并且光照促進該基因的轉(zhuǎn)錄水平。而在ld條件下，該基因的生物鐘調(diào)控起主導(dǎo)作用。

圖8e顯示在sd條件下，gmcib5的表達量在光照4h后出現(xiàn)表達的峰值。轉(zhuǎn)入ll條件下該基因量有不同程度的增加，但表達峰值消失。而在dd條件下，基因的表達水平明顯降低。ld條件下，gmcib5的表達量在亮燈后有個短時間(2h)的降低，隨后隨著光照時間的增加其表達量不斷增加，光照6h后其表達量達到最高。推測該基因的表達主要受光周期的調(diào)控，且受光的正調(diào)控。

gmcib6的表達模式(圖8f)與gmcib5相似，光周期調(diào)控占主導(dǎo)地位。在sd和ld下，該基因均呈現(xiàn)明顯的晝夜節(jié)律。而在ll和dd下這種節(jié)律被打破，呈現(xiàn)出ll條件下基因表達水平整體大幅度提高，而在dd條件下基因表達顯著降低。

gmcib7的表達分析顯示(圖8g)，該基因在sd和ld均沒有明顯的生物鐘或光周期節(jié)律。當轉(zhuǎn)入ll后，隨著光照時間的增加其表達量不斷升到，雖然有個表達劇減時刻，但隨后其表達又快速增加。而在dd條件下，該基因的表達明顯減低且一直維持在很低的表達水平。以上結(jié)果表明該基因不受生物鐘的調(diào)控，光照可能調(diào)控其轉(zhuǎn)錄水平。

由圖8h可以看出，在sd和ld條件下gmcib8有明顯生物鐘節(jié)律。sd下隨著光照的到來表達量不斷升高，在關(guān)燈后2h，表達峰值出現(xiàn)，隨后表達量劇減，在開燈前4h，表達量降到低谷。ld條件下，光照后6h基因表達量達到最高，隨后表達逐漸降低，開燈前6h表達量最低。ll和dd條件下這種節(jié)律現(xiàn)象消失，并且在ll條件下基因的整體表達水平有較大幅度的提高，而在dd條件下則維持在較低水平。

gmcib9的表達結(jié)果顯示(圖8i)，該基因的生物鐘節(jié)律和光周期均沒有明顯的規(guī)律，可能在基因表達過程中這兩調(diào)控作用復(fù)雜的交織在一起共同起作用，或者該基因的表達受到更復(fù)雜的調(diào)控機制的控制。

2.6.4不同緯度來源大豆品種中g(shù)mcib基因家族的表達模式

選取緯度不同的11個栽培大豆品種，分別種植在sd和ld的溫室中，分別取m、n、e三個時刻的樣品，用于gmcibs基因的在不同品種中的表達分析。結(jié)果顯示(圖9)，gmcibs基因在不同品種中的表達模式隨著緯度的變化各不相同。在高緯度分布的品種(40°-50°)，無論在sd還是ld下gmcib1表達有先增加再降低的趨勢(圖9a)，即在中午時刻(n)表達量最高。在低緯度品種(25°-30°)，sd條件下基因的表達呈下降趨勢，而ld下表達量逐漸增加。

sd條件下，不同品種中g(shù)mcib2表達模式大體相同，除cn13、tf31、zd31外，其他品種中該基因一天中的表達呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在正午時刻達到峰值。而在ld條件下，幾乎呈現(xiàn)相反的表達模式，在高緯品種(hh27、sn14)中，基因的表達在中午時刻達到谷值，在傍晚時刻表達量最高。隨著緯度的降低，基因的表達自接受光照后持續(xù)增加，在傍晚時刻也達到最高?？梢妉d條件下，gmcib2在kn18，cn13，tf31中自開燈后表達持續(xù)降低，而在其他品種幾乎都呈現(xiàn)持續(xù)增加的趨勢。

gmcib1基因在不同品種的表達模式分析顯示(圖9b)，隨著緯度的增加，其表達量的峰值不斷前移，緯度38°-50°分布的栽培品種中，sd和ld條件下在傍晚時刻gmcib1的轉(zhuǎn)錄水平最高。在zd31和zc3中，sd和ld下基因的表達模式剛好相反，短日照下基因表達呈現(xiàn)先增長，在正午時刻達到峰值，隨后表達量逐漸降低，而在長日照呈現(xiàn)先降低在增加的趨勢。在兩個較低緯度品種fd1、gz2中，基因表達不受光周期影響，表達模式幾乎相同，隨著光照時間的增加其表達量不斷上升，在正午時刻表達量最高。

從圖9b可以看出，gmcib4基因在高緯度分布的栽培品種的表達，不受光周期的影響，在hh27、sn14、kn18中其表達呈現(xiàn)光照后持續(xù)增長趨勢，在關(guān)燈前半小時到達表達峰值。隨著緯度的降低，基因表達峰值不斷前移，在正午時刻(n)到達，隨后表達量逐漸降低。而在靠近赤道的品種(fd1和gz2),ld條件下其表達先有個下降趨勢，在正午時刻(n)達到低谷，隨后表達逐漸增加。而sd條件下，低緯度(zc3、fd1和gz2)品種表達模式類似于高緯度品種，其表達量持續(xù)增加。

圖9c顯示，ld條件下，gmcib5基因在低緯度(25°-31°)栽培品種中(gz2外)的表達，在光照期間持續(xù)增加，在即將進入黑暗時達到最高。這一趨勢與其在sd條件下的表達模式類似。其他品種中g(shù)mcib5基因(分布于中高緯度)在ld環(huán)境下的表達呈現(xiàn)先增加后降低的模式。sd和ld條件下，各個品種中g(shù)mcib6基因的表達峰值大都在熄燈前，但增長的趨勢有所不同，高緯度品種自開燈后gmcib6基因的表達持續(xù)增長，隨著緯度的降低，該基因的轉(zhuǎn)錄水平隨著光照時間的增加而逐漸降低，達到低谷后又逐漸增加。

gmcib7和gmcib8基因在各品種的表達模式分析表明(圖9d)，ld條件下兩基因的表達模式大致相同，隨著光照時間的增加表達量逐漸增加，在正午時刻(n)達到峰值。sd條件下gmcib7基因在高緯度和低緯度分布的品種中也表現(xiàn)出上述表達模式，gmcib8基因則表現(xiàn)出表達持續(xù)增加的趨勢，在進入黑暗前(e)表達量最高。

gmcib9基因表達分析顯示該基因表達峰值隨著緯度的降低而不斷前移，并且sd條件下的移動速度快于ld條件。sd條件下，gmcib9基因在高緯度分布的品種經(jīng)過先降低再增加的表達模式，在進入黑暗前達到峰值。隨著緯度的遞減其表達呈先增長后降低的趨勢，在正午時刻(n)達到最高值。而在較低緯度分布的品種中(fd1和gz2)其表達持續(xù)降低。ld條件下，在低緯度品種(fd1和gz2)中g(shù)mcib9基因在正午時刻達到峰值，隨著品種緯度分布的增加其表達不斷增加，在熄燈前表達量達到最高。

2.7大豆cib基因過表達在擬南芥中的表型分析

將大豆gmcibs分別構(gòu)建到35s植物過表達載體(pleela)上，分別轉(zhuǎn)化擬南芥并對其功能進行分析。經(jīng)basta篩選得到了gmcib1/4/5/6/85個基因擬南芥過表達轉(zhuǎn)基因植株。將篩選到的轉(zhuǎn)基因植株分別種植在sd和ld條件下，進一步觀察分析表型。gmcib1過表達擬南芥在sd和ld均表現(xiàn)出早花表型(圖10)。開花時間和葉片數(shù)統(tǒng)計顯示，在sd和ld條件下，轉(zhuǎn)基因植株開花時間明顯早于野生型，葉片數(shù)也少于野生型。對過表達植株中(ld)的gmcib1和atft的mrna表達水平檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株中g(shù)mcib1基因過表達，atft的表達量明顯高于野生型。暗示了gmcib1基因的過表達促進了atft的表達，從而使植物提前開花。gmcib3在擬南芥中的功能也與擬南芥cib1功能相同。但其在大豆是否也有類似的功能呢，將在下面具體討論。同樣，gmcib4/5/6/8四個基因分別過表達在擬南芥中，在sd和ld條件下均能促進擬南芥提前開花(圖10)，開花時間早于野生型，蓮座葉數(shù)目也明顯減少，說明這四個基因在擬南芥也起到開花調(diào)控的作用。但它們在大豆中的功能，目前還不清楚。

3.討論

3.1大豆cib基因家族的克隆

本實驗通過生物信息學(xué)同源比對在大豆中確定了cib基因家族中的12個成員，最先預(yù)測到了前9個gmcibs基因，隨著大豆基因組序列的不斷公布，隨后又預(yù)測到了gmcib10/11/12三個基因。本實驗基于時間與轉(zhuǎn)化材料的原因最先克隆了前9個gmcibs基因。克隆所用模板是大豆墾農(nóng)18(kn18)主要組織器官cdna的混合物，這就避免了基因在不同組織中的表達差異造成的基因克隆困難?？寺〉?個gmcibs基因的編碼區(qū)與預(yù)測的序列吻合，分別將基因構(gòu)建到植物過表達載體、yfp融合的亞細胞定位表達載體，以及酵母雙雜交等載體上，以期對這些基因的體內(nèi)外功能進行研究。

3.2大豆cib基因家族的基因結(jié)構(gòu)

通過生物信息學(xué)工具和一些生物學(xué)軟件對大豆cib基因家族成員進行較詳盡的生物信息學(xué)分析。染色體定位顯示除gmcib2和gmcib8共同分布在同一染色體(chr.4)上，其他10個基因分布在不同的染色體上。雖然gmcib2和gmcib8在同一染色體上的物理距離很近，但兩者的同源性并不高，僅達到27.3％，推測可能是長期進化中，選擇壓力造成的同源基因的功能分化。

12個gmcib成員間，形成兩基因間同源性很高的6對基因組合，同源性最高的達到93.0％(gmcib9和gmcib10)，最低的也到達了80.1％(gmcib7和gmcib8)。從染色體分布上看，同源性較高的兩基因均位于不同染色體上，這可能因為大豆為古四倍體，不同來源的兩個基因經(jīng)過長期進化分化過程被保留下來，從而形成了2個拷貝，這些位于不同染色體上且同源較高的成對基因恰恰支持了這一論斷。

gmcib同源基因在功能上是否存在冗余，目前還未有報道。從進化角度考慮，重復(fù)基因受長期的進化選擇壓的影響可能向不同的方向演化，比如：功能的喪失(假基因)、功能弱化(表達降低，功能減弱)、功能獲得(分化出新的功能)和功能細化(不同基因拷貝功能細化并調(diào)控同一過程)。對大豆cib基因家族成員的時空表達模式進行分析將有助于了解在它們在大豆中行使的功能。

擬南芥cib1是典型的bhlh蛋白，含有典型的bhlh保守結(jié)構(gòu)域。大豆cib基因家族保守性結(jié)構(gòu)域分析表明，每個成員均含有保守性較高的bhlh結(jié)構(gòu)域。擬南芥cib1的研究顯示，bhlh基序可以通過與ft基因啟動區(qū)的e-box(canntg)結(jié)合,促進ft的mrna表達水平，從而啟動植物的開花(liu等,2008)。gmcib家族擁有如此保守的結(jié)構(gòu)域，其功能是否和cib1相似，這也是我們感興趣的問題。擬南芥cib1基因的n端和c端在的功能不同，n端含有一段核定位信號，與基因的入核以及蛋白-蛋白的相互作用有關(guān)。基因的c端含有bhlh結(jié)構(gòu)域參與與dna的結(jié)合。gmcib家族基因的編碼區(qū)結(jié)構(gòu)預(yù)測與擬南芥cib1類似，bhlh保守結(jié)構(gòu)域也位于基因的c端。對gmcib家族成員的保守結(jié)構(gòu)域同源性分析發(fā)現(xiàn)，各基因間的結(jié)構(gòu)域同源性與基因編碼氨基酸全長同源性間稍有差異，這可能是除保守氨基酸外其他氨基酸不同所致。這可能也是長期進化過程中，植物體為適應(yīng)不同的選擇壓而形成的同源基因的功能分化。

基因組結(jié)構(gòu)分析顯示，gmcib家族基因成員都含有不同數(shù)目和長度的外顯子和內(nèi)含子，以及不同長度的utr。復(fù)雜的基因組結(jié)構(gòu)可能也會產(chǎn)生不同的基因轉(zhuǎn)錄后修飾，同時伴隨著不同的基因功能。

3.3大豆cib基因家族的表達模式

亞細胞定位分析看出，雖然gmcib為轉(zhuǎn)錄因子但亞細胞定位并不僅僅是位于細胞核內(nèi)，gmcib6和gmcib7蛋白在細胞核和細胞質(zhì)中均有表達，暗示了它們可能在細胞質(zhì)內(nèi)也能行使功能。

gmcibs不同組織器官的時空表達分析顯示各成員在不同組織器官的表達各異，表達模式也比較復(fù)雜。整體上看大部分基因在開花時期的器官中表達量較高，推測可能這一家族基因在大豆開花調(diào)控中起到一定的作用。目前研究顯示擬南芥cib1主要功能是調(diào)控植物開花，可為以上推測提供理論依據(jù)。gmcibs中有些基因在單葉期的組織器官中也有較高的表達，如gmcib1/2/3/9在剛剛張開的單葉中表達量很高，可能這些基因除有開花調(diào)控的作用，可能還參與到其他調(diào)控途徑中。

大豆cib基因不同發(fā)育時期表達模式綜合分析看，除gmcib2外，其他基因地上部分的表達量都較低，大部分基因表達量較高時期主要集中在營養(yǎng)生長后期，生殖生長初期階段即開花期，這表明這些基因可能參與到大豆的開花調(diào)控。但是也有些基因在生殖生長初期階段如單葉時期也有很高的表達量，gmcib1在單葉期和開花初期的表達量都很高，而在發(fā)育中間階段表達量卻很低?？赡茉摶蛟跔I養(yǎng)生長和生殖生長的初級階段均起到重要的調(diào)控作用，對發(fā)育調(diào)控起到雙重作用。而gmcib6的整體表達水平都很低，可能該基因?qū)Πl(fā)育調(diào)控中的作用很小，或者是受某種信號誘導(dǎo)表達的基因。

光周期和生物鐘分析顯示，gmcib家族成員中這兩種表達模式較為復(fù)雜。總體上看大部分基因受光周期和生物鐘共同調(diào)控，只是兩種調(diào)控機制所占主導(dǎo)地位不同?？v觀所有成員，gmcib4在長日照條件的表達有明顯的生物鐘節(jié)律，而在短日照下，生物鐘節(jié)律明顯受到光周期調(diào)控拮抗，當轉(zhuǎn)入連續(xù)光照是基因整體表達水平調(diào)高而在連續(xù)黑暗條件下基因一直維持在很低的表達水平。暗示了該基因在ld和sd條件下的調(diào)控機制有差異，這也可能由于大豆是嚴格的短日照植物，在兩種光照條件迥異的條件下可能有不同的調(diào)控機制。雖然光周期和生物鐘共同調(diào)控著基因的表達，對各成員的進一步分析發(fā)現(xiàn)，大部分基因(除gmcib1和gmcib9外)在sd和ld條件下，都有明顯或不很明顯生物鐘節(jié)律，在一天的表達中都有峰值和谷值出現(xiàn)，轉(zhuǎn)入ll和dd后生物鐘節(jié)律被消減，而光周期調(diào)控占主導(dǎo)地位，ll條件下基因的整體表達水平提高，基因在dd條件下一直維持這較低的表達水平。gmcib2例外，在ll條件下該基因表達明顯受到抑制，而在dd條件下表達量相對較高，說明gmcib2的表達受光照的抑制。

不同緯度來源大豆品種中g(shù)mcibs表達模式顯示，基因的表達模式與緯度間未發(fā)現(xiàn)明確的相關(guān)性。整體分析表明，不同緯度來源的品種中，無論在sd或ld環(huán)境下基因的表達都有隨光照時間的增加逐漸增加的趨勢，在增加過程中，有些基因在某些品種基因的表達在正午時刻(n)達到峰值后而逐漸降低，而有些會持續(xù)增加一直到黑暗來臨(e)前達到峰值。很少一部分基因的表達呈現(xiàn)逐漸降低的模式。

3.4大豆cib基因家族在擬南芥中的表型

將克隆到的gmcibs構(gòu)建過表達植物表達載體轉(zhuǎn)化擬南芥，對得到的轉(zhuǎn)基因植株進行表型分析。在長日和短日條件下，過表達gmcib1/4/5/6/8的轉(zhuǎn)基因擬南芥表現(xiàn)出早開花表型，與擬南芥cib1的功能類似。在過表達gmcib1的轉(zhuǎn)基因植株中對下游靶基因atft表達水平檢測顯示，atft的表達水平明顯高于野生型，說明外源gmcib1的表達可提高atft的轉(zhuǎn)錄水平從而促進植物早開花。雖然gmcib1在擬南芥中的功能與cib1相似，但是大豆是典型的短日照植物，而擬南芥是長日照植物，兩者的調(diào)控機理有可能不同，所以需進行大豆遺傳轉(zhuǎn)化進一步研究gmcib基因在大豆中的功能。

4.小結(jié)

大豆中預(yù)測了12個擬南芥cib1的同源基因，共克隆到了9個gmcibs，通過對所預(yù)測基因的生物信息學(xué)分析，對克隆到的基因在不同組織器官和發(fā)育時期的mrna的時空表達模式，生物鐘和/或光周期以及在不同維度來源大豆品種中的mrna表達模式進行分析，亞細胞定位，并將基因過表達擬南芥對基因功能進行初步分析。得到的主要結(jié)論如下：

大豆cib基因家族成員共有12個，分別位于11條不同的染色體上(gmcib2和gmcib8分布在同一染色體)。同源性分析顯示，家族成員共分成6對，每對基因間的同源性很高，但與其他成員間的同源性較低，且成對的基因均位于不同染色體上，可能與大豆是古四倍體以及長期的進化選擇有關(guān)。

大豆cib基因都有保守的bhlh結(jié)構(gòu)域。各成員的基因組結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，都含有不同數(shù)目和長度的外顯子和內(nèi)含子，以及不長度的utr。

大豆cib與yfp融合蛋白經(jīng)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化瞬時表達對其亞細胞定位研究表明，所有基因都定位在細胞核內(nèi)，而有個別基因(gmcib6和gmcib7)在細胞質(zhì)中也有表達，說明這些基因的功能行使不僅僅局限于細胞核，可能也參與到細胞質(zhì)中的部分功能調(diào)控。

大豆cib基因不同組織器官的表達顯示，大部分成員在開花期的組織表達較高。不同發(fā)育時期表達模式表明，大部分基因在營養(yǎng)生長過渡到生殖生長(即開花期)時表達量逐漸升高，推測該家族成員可能與開花調(diào)控相關(guān)。而個別基因如gmcib1在單葉期和開花初期的表達量都很高，推測該基因可能在營養(yǎng)生長和生殖生長的初級階段均起到重要的調(diào)控作用，對發(fā)育調(diào)控起到雙重作用。光周期和生物鐘表達模式分析顯示，gmcib基因受這兩種機制的雙重調(diào)控。整體上看，大部分基因(除gmcib4外)受光周期的正調(diào)控。不同緯度來源大豆品種中g(shù)mcibs表達模式顯示，gmcibs與緯度變化沒有明顯的相關(guān)性。

將克隆到的gmcibs過表達到擬南芥中，得到的過表達gmcib1/4/5/6/8轉(zhuǎn)基因擬南芥在長日和短日條件下，均表現(xiàn)出早開花表型，表明這些在擬南芥中的功能與擬南芥cib1的功能類似。

實施例2、gmcry1&2及gmcib1調(diào)控開花和衰老的功能研究

本研究將通過酵母雙雜、bifc以及co-ip等手段研究gmcrys與gmcib1蛋白間的相互作用；進一步獲得gmcry與gmcib1基因過表達或rnai敲除的大豆遺傳轉(zhuǎn)化株系，結(jié)合轉(zhuǎn)基因后代的表型分析和chip實驗來尋找gmcib1的下游作用靶基因，從而分析大豆中g(shù)mcry傳遞藍光信號的gmcib信號通路，為大豆光周期和葉片衰老調(diào)控的深入研究和種質(zhì)創(chuàng)新打下基礎(chǔ)。

1.材料與方法

1.1材料

1.1.1植物材料

大豆品種為墾農(nóng)18，煙草品種為nicotianabenthamiana。

1.1.2菌株與質(zhì)粒

農(nóng)桿菌及大腸桿菌菌株同實施例1，酵母菌株mav203為本實驗室保存。昆蟲細胞昆蟲細胞sf9來自清華大學(xué)施一公實驗室。

酵母雙雜交載體pdest22、pdest32；植物表達載體pgwb11、pgwb17；bifc載體pccfp-x、pnyfp-x；昆蟲表達載體pfastbachta均由本實驗室保存。

1.2方法

1.2.1大豆遺傳轉(zhuǎn)化與表型觀察

(1)大豆遺傳轉(zhuǎn)化：將構(gòu)建的含有目的基因的過表達載體和rnai載體利用優(yōu)化的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的子葉節(jié)法，轉(zhuǎn)入大豆品種墾農(nóng)18(kn18)中，得到純合且可穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植株，初步研究基因的功能。

(2)轉(zhuǎn)基因植株的鑒定和純合系的獲得：對于穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植株主要采取三個方法來鑒定：一是抗性分析，以上表達載體都帶有除草劑篩選標記，可以用一定濃度的除草劑噴灑初步篩選到可能的轉(zhuǎn)基因植株；第二，利用分子生物學(xué)方法鑒定，利用rt-pcr和western-blot證明整合到基因組中的目的基因確實表達；第三，利用遺傳學(xué)方法分析，除草劑抗性標記基因與目的基因是否共分離，目的基因在后代遺傳中是否符合孟德爾規(guī)律，并篩選穩(wěn)定遺傳的純合轉(zhuǎn)基因植株。

(3)轉(zhuǎn)基因植株的表型分析：分析穩(wěn)定遺傳的過表達和rna干涉轉(zhuǎn)基因植株與對照植株之間的表型差異。

1)開花時間和葉片數(shù)統(tǒng)計：將不同轉(zhuǎn)基因植株和野生型分別種植于長日照和短日照溫室內(nèi)，統(tǒng)計開花時間以及開花時的葉片數(shù)。

2)葉片衰老差異的統(tǒng)計：基于在連續(xù)光照下一些轉(zhuǎn)基因植株早衰現(xiàn)象比較明顯，將不同轉(zhuǎn)基因植株和野生型種植于連續(xù)光照條件下，統(tǒng)計子葉和單葉開始變黃、變黃以及脫落的時間。

3)總?cè)~綠素以及葉綠素a、b含量的測定：種植于連續(xù)光照的植株，當早衰植株單葉開始變黃時，每株系分別取5片不同單葉，液氮冷凍后充分研磨樣品。每樣品加入500μl提取液[50mm磷酸鋰ph7.2；1mm；120mm；5％(v/v)甘油；1mmpmsf；0.2％]混勻,分別取100μl加入80％丙酮，充分混勻后，置于-20℃避光放置1h，12800g離心3min。分光光度計測定663nm和646nm波長的光吸收值。利用以下公式計算葉綠素濃度：

總?cè)~綠素含量(mg/l)＝20.2a646+8.02a663；

葉綠素a含量(mg/l)＝13.19a663-2.57a646；

葉綠素b含量(mg/l)＝22.1a646-5.269a663.

4)光合速率的測定：利用光合儀li-6400在不同時間段測定連續(xù)光照種植的不同植株的光合速率，選擇被測植株的單葉，第二復(fù)葉和第四復(fù)葉作為測定對象。

5)衰老相關(guān)基因以及開花調(diào)控相關(guān)基因表達情況分析選擇連續(xù)光照下，早衰植株單葉剛剛變化時作為取材時間點，對不同轉(zhuǎn)基因植株和野生型進行取材，作為衰老相關(guān)基因(gmapgl5、gmwrky53、gmsagl12、gmagl12)表達測定的模板。連續(xù)光照轉(zhuǎn)為短日照三天后取第七復(fù)葉作為開花調(diào)控相關(guān)基因(gmfts和gmtfls)表達情況測定的模板。(rna提取、real-timepcr同實施例2)

1.2.2酵母雙雜交

酵母雙雜交實驗依照clontech手冊進行。將gmcrys與gmcibs分別構(gòu)建到酵母雙雜交載體pdest32(bait)和pdest22(prey)，共轉(zhuǎn)酵母菌株mav203。用組氨酸營養(yǎng)缺陷實驗分析gmcrys與gmcibs間蛋白的互作，將酵母克隆滴在三缺板上生長(-his-trp-leu)，一組放置在黑暗下，一組用25μmolem-2s-1藍光照射，于28℃培養(yǎng)箱中生長2到3天。對蛋白互作的定量分析是采用定量β-半乳糖苷酶實驗，以cprg為顯色底物。挑取酵母單克隆于二缺sd培養(yǎng)基(-trp-leu)中避光過夜培養(yǎng)，待od600至1.8，用sd稀釋至od600約為0.2，再避光培養(yǎng)1-2h，然后分成兩組，一組置于22μmolem-2s-1藍光下，一組用錫箔紙包裹置于相同培養(yǎng)環(huán)境下，在0-150min內(nèi)不同時間點收集酵母檢測β-半乳糖苷酶活性。整個過程保持酵母生長濃度od600在0.4-0.8之間。

1.2.3bifc試驗

將gmcry1/gmcry2和gmcib1分別構(gòu)建到表達載體pccfp-x、pnyfp-x上，通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(方法同實施例1)，confoal顯微鏡下觀察gmcry1/gmcry2和gmcib1相互作用情況。

1.2.4免疫印跡(westernblot)

(1)免疫印跡操作流程

1)蛋白提?。菏占瘮M南芥幼苗于1.5ml離心管中，加入20-30μl的4樣品緩沖液，研磨充分后，95℃煮樣5min，置冰上冷卻，于最高轉(zhuǎn)速離心15min。

2)sds-page分離蛋白。

3)將蛋白轉(zhuǎn)移到nc膜上，用5％脫脂奶粉(溶于pbst溶液中)封閉1h。

4)加一抗常溫孵育1h。

5)用pbst溶液洗膜三次，每次6min。

6)加入二抗孵育1h

7)用pbst溶液洗膜三次，每次6min。

8)加顯色底物進行顯影。

9)膜再雜交：用洗膜液洗膜三次，每次15min，重新用牛奶封閉，加入第二種抗體。

(2)溶液配制

1)凝膠儲液：acrylamide29.2g，bisacrylamide0.8g，加ddh2o定容至100ml，濾紙過濾后于4℃保存。

2)1.5mtris-hcl緩沖液，ph8.8

稱量36.3gtris-base于70mlddh2o中，用hcl調(diào)ph值至8.8，加ddh2o定容至100ml，高壓滅菌，室溫保存。

3)0.5mtris-hcl緩沖液，ph6.8

稱量6gtris-base于70mlddh2o中，用hcl調(diào)ph值至6.8，加ddh2o定容至100ml，高壓滅菌，室溫保存。

4)10％sds

稱量10gsds，用ddh2o定容至100ml，高壓滅菌，室溫保存。

5)10％ap

稱量0.1gammoniumpersulfate，用ddh2o定容至1ml，于-20℃保存。

6)10％的分離膠(5ml)

7)4％的濃縮膠(2ml)

8)10x蛋白電泳液(1000ml)

30gtris，144gglycine，10gsds，加ddh2o定容至1000ml。

9)10x轉(zhuǎn)膜液(1000ml)

30gtris，144gglycine，加ddh2o定容至1000ml。

10)1x轉(zhuǎn)膜液(1000ml)

100ml10轉(zhuǎn)膜液，700mlddh2o，200ml甲醇。

11)10xpbs(1000ml)

80gnacl,2gkh2po4,2gkcl,241.42gna2hpo.7ho。

12)1xpbst

100ml10pbs,1mltween20,加ddh2o定容至1000ml。

13)洗膜液(1000ml)

15gglycine，用hcl調(diào)ph值為2.5，加ddh2o定容至1000ml。

14)樣品緩沖液

25.2gglycerol，0.02gbromophenolblue，4gsds，20ml1mtris-hclph6.8,3.1gdtt，加ddh2o定容至50ml，分裝后于-20℃保存。

1.2.5gmcry1&2和gmcib1蛋白的體外表達和純化

重組的his-gmcry1,his-gmcry2，his-gmcib1-flag蛋白是通過昆蟲細胞sf9細胞系表達。gmcry1,gmcry2和gmcib1-flag編碼區(qū)序列通過ecori和xhoi酶切分別連接到pfastbachta載體，通過重組bacmiddna介導(dǎo)轉(zhuǎn)化昆蟲細胞sf9。構(gòu)建與轉(zhuǎn)化過程參照invitrogenbactobacbaculovirusexpressionsystem。

蛋白純化：離心收集病毒侵染細胞(3000g，10min)，重懸于xb溶液(500mmnacl,50mmtris-hclph7.8,0.5％tritonx100,4.8mmβ-me,1mmpmsfaddfresh)，冰浴30min，超聲破碎(sonics&materials.inc,modelvc505)直至細胞溶液不再粘稠,隨后超速離心(45000g，60min，4℃)，收集上清并用0.22μm的過濾膜過濾。用ni-nta(invitrogen)鎳柱吸附目的蛋白，透析并濃縮(amiconconcentrator30kdcutoff)。

1.2.6體外蛋白與蛋白的相互作用

體外gmcry1&gmcry2與gmcib1的相互作用：

1)將昆蟲細胞表達的gmcry1、gmcry2和gmcib1-flag的細胞裂解。將gmcry1和gmcry2的細胞裂解液分別與gmcib1-flag的細胞裂解液混合。

2)裂解后的細胞高速離心去沉淀，并用0.22μm的過濾器過濾上清。

3)用bcaproteinassaysystem(pierce)測定裂解液濃度。

4)用xb緩沖液將細胞裂解液稀釋到1μg蛋白/μl。

5)分別取1mlgmcry1、gmcib1-flag裂解液混合液和gmcry2、gmcib1-flag裂解液混合液與20μlprotein-a/gagarose孵育1h，去除裂解液中與protein-a/gagarose非特異性結(jié)合的蛋白。

6)將連接了flag抗體的protein-a/gagarose溶液分別加入到gmcry1-gmcib1和gmcry2-gmcib1混合裂解液中，置于冰上，在黑暗或藍光(22μmolem-2s-1)下處理不同時間(10min,30min,60min,120min)。

7)1000g，3min，4℃，收集agarose，用冰浴的wb2緩沖液(500mmnacl,50mmtris-hclph7.8,0.1％tritonx100,1mmpmsf)洗4次。

8)將agarosebeads重懸于30μl2樣品緩沖液中，95℃煮10min。取10μl用sds-page分離，并用westernblot檢測目標蛋白。取0.2％的input作為對照。用gmcry1和gmcry2的抗體分別檢測gmcry1和gmcry2，用flag的抗體檢測gmcib1。

1.2.7體內(nèi)蛋白與蛋白的相互作用

(1)大豆體內(nèi)蛋白相互作用的檢測

大豆墾農(nóng)18和35s::yfpgmcib1過表達轉(zhuǎn)基因植株分別種植在短日照下三周左右。植株轉(zhuǎn)移到黑暗條件下18h后藍光(b,22μmolm-2s-1)處理，處理時間為d,0min；b30,30min；b60,60min；b120,120min。不同的處理時間分別取材，樣品剪成細條用mg132避光處理3-4h，液氮冷凍用于免疫共沉淀試驗?？偟鞍滋崛∥?input)和偶聯(lián)anti-gfp抗體凝膠柱拖下的產(chǎn)物(gfp-ip)利用anti-yfp抗體進行免疫雜交，隨后該ecl膜用strippingbuffer將anti-yfp抗體洗掉，用anti-gmcry2或anti-gmcry1抗體重新免疫結(jié)合。

(2)煙草瞬時表達檢測蛋白-蛋白相互作用

1)挑取含有目的表達載體(pgwb11-gmcib1、pgwb17-gmcry2)的農(nóng)桿菌于3-5mllb培養(yǎng)基(+50mg/lkana+50mg/lrif)，250rpm，28℃振蕩培養(yǎng)過夜(16h)。od600＝1-2

2)以1；500—1:1000轉(zhuǎn)接至新鮮lb培養(yǎng)基(+10mmmes+20umas+50mg/lkana+50mg/lrif)，250rpm，28℃振蕩培養(yǎng)過夜(16h)。od600＝1

3)4000rpm離心10min，去上清

4)用infiltrationbuffer(10mmmes，150umas，10mmmgcl2)重懸菌體(可先用菌液一半體積的infiltrationbuffer重懸)。測量重懸液od600的數(shù)值。

5)infiltrationbuffer調(diào)整pgwb11-gmcib1與pgwb17-gmcry2重懸液至od600＝1.5，p19重懸液至od600＝1。

6)等體積混合各菌液(也可先分開靜置，注射前再混合)，在室溫靜置重懸液3小時以上(但不要太長時間，建議不要超過6小時)。

7)煙草準備：在注射前一天可以把煙草從培養(yǎng)室拿出來，放在樓上實驗室，因為在培養(yǎng)室的煙草葉片含水量高，菌液很難滲透注射進去。所選擇注射的葉片要完全伸展，靠近頂端的葉片最好，太嫩不好注射，太老活力不強。

8)在葉片背面用針頭扎一個小孔，用去了針頭的注射器對準小口，另一只手用手指隔著葉片輕輕堵住針筒和小孔(力度需要自己體會，太重了菌液推不出來，太輕了菌液推不進去，經(jīng)驗是用食指側(cè)面比較好用)，推動活塞，把菌液注射進葉片，直至水漬滿了整個葉片(如果葉片較大，扎2-4個小孔)。在葉柄上貼上標簽。

9)注射完的煙草要注意保濕，溫室放置一天后移至黑暗放置兩天后，部分材料藍光(b,22μmolm-2s-1)處理2h,黑暗和藍光處理的材料分別取材，迅速用液氮冷凍，用于免疫共沉淀。

1.2.8dna-binding試驗

(1)材料的準備：

1)64bpdsdna:合成序列中間含有16bp隨機核酸序列的64bpssdna。

random5’-tggagaagaggagagtgggcnnnnnnnnnn

binding-fnnnnnnctcttttgcattcttcttcgattccggg-3’

random5’-cccggaatcgaagaagaatgcaaaagagnnn

binding-rnnnnnnnnnnnnngcccactctcctcttctcca-3’

rbingf5’-tggagaagaggagagtgggc-3’

rbingr5’-cccggaatcgaagaagaatgcaaaagag-3’

2)protein:昆蟲細胞表達his-gmcib1

3)5xdna結(jié)合緩沖液：

(2)試驗程序：

1)dsdna的合成:50ulpcr反應(yīng)體系中等量混合rbss-f和rbss-r(200pmole)。pcr儀中進行以下反應(yīng)：100℃2min；慢慢降溫到45℃，保持10min；72℃10min。

2)昆蟲細胞表達his-gmcib1,利用ni-nta(invitrogen)鎳柱吸附目的蛋白，得到偶聯(lián)his-gmcib1beads，sdspage檢測蛋白量。

3)dna結(jié)合：0.5ml離心管中加入

5uldna隨機片段(步驟1或6)

5ulhis-gmcib1beads(10ug蛋白)

2.5ul5xdna結(jié)合緩沖液

室溫反應(yīng)10min。(注：不含有目的蛋白的beads作為陰性對照)

4)500ul1xdna結(jié)合緩沖液漂洗beads，2000rpm，4℃離心，棄上清。重復(fù)洗5遍。

5)洗脫beads結(jié)合的dna:加入10ul含有10mm還原型谷胱甘肽的50mmtris-hcl(ph8.0)緩沖液洗脫beads，輕輕混勻10min，2000rpm，4℃離心，將上清液轉(zhuǎn)移到一新管中。

6)以洗脫得到的dna片段為模板,以f/r為引物進行pcr擴增。

反應(yīng)程序為：94℃30s,40℃1min,72℃20s；94℃30s,60℃10s,72℃10s，30個循環(huán)。

7)2.5％瓊脂糖凝膠檢測pcr產(chǎn)物。

8)重復(fù)步驟3到7，五次，直至pcr產(chǎn)物的量足夠多，即20個循環(huán)就能檢測到pcr產(chǎn)物。

(第三輪pcr產(chǎn)物出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，此時應(yīng)減少循環(huán)數(shù)和縮短延伸時間)。第三輪pcr程序：94℃30s,40℃1min,72℃20s；94℃30s,60℃10s,72℃6s，22個循環(huán)；第四輪pcr程序：94℃30s,40℃1min,72℃20s；94℃30s,60℃10s,72℃5s，20個循環(huán)；第五到七輪pcr程序：94℃30s,40℃1min,72℃20s；94℃30s,60℃10s,72℃3s，18個循環(huán)。

9)最后一輪pcr產(chǎn)物連接到克隆載體上(tacloningkit)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α。

10)經(jīng)藍白斑篩選，挑取白斑進行測序分析。

1.2.9chip試驗

(1)交聯(lián)：

1)大豆野生型和種植于35s::yfpgmcib1過表達轉(zhuǎn)基因植株分別種植在短日照下三周左右。暗處放置18h后，藍光(b,22μmolm-2s-1)處理2h，分別取4g藍光和黑暗條件下的幼葉。

2)將所取的幼葉剪成細條放于50ml三角瓶中，分別加入37ml交聯(lián)液，室溫真空泵內(nèi)交聯(lián)10-15min。(交聯(lián)后的葉片呈透明狀)

3)交聯(lián)的三角瓶中加入2.5ml2m的甘氨酸(終濃度為100mm)，室溫抽真空泵5min來終止交聯(lián)反應(yīng)。

(2)染色體的分離與超聲處理：

4)交聯(lián)后的樣品用無菌水洗三次，盡量吸干葉片表面后迅速用液氮冷凍。

5)充分研磨樣品，確保樣品在研磨過程中處于冷凍狀態(tài)。

6)研磨后的樣品裝入50ml離心管中，25ml預(yù)冷的細胞核提取液重懸。

7)快速振蕩樣品，直至充分混勻，期間樣品保持冰上放置。

8)四層紗布過濾后的重懸液，11000g，4℃離心20min。這是將會看到管底部有緊密的灰白色的顆粒。

9)棄上清，2ml預(yù)冷的核裂解液重懸灰白色顆粒(即細胞核)。(每個樣品取出5μl用于與超聲后的片段作對照)。

10)將得到的樣品分成四份，每離心管中500μl。超聲處理將dna剪切成500bp左右的片段。超聲處理的程序為：超聲強度為25％，每超聲15s停30s,共超聲5次，樣品保持冰上放置。

11)超聲后樣品，13800g，4℃離心10min。

12)將同一樣品的上清液(共四管)集合至一起。分別取出5μl與步驟9中對應(yīng)的樣品進行電泳，1％瓊脂糖凝膠，100-120v,電泳30min。紫外下觀察，若超聲后的樣品在200-1000bp出現(xiàn)模糊拖尾樣的條帶，且在500bp左右較集中，說明dna樣品超聲效果比較好。反之，超聲效果不佳，要進一步優(yōu)化超聲條件。

(3)免疫沉淀：

13)取100μl超聲處理的染色體樣品用裂解液稀釋十倍成1ml。

14)稀釋后的樣品中分別加入50μl預(yù)平衡的salmonspermdna/proteinaagarosebeads，4℃輕輕翻轉(zhuǎn)孵育1h,去樣品中與salmonspermdna/proteinaagarosebeads非特異性結(jié)合的dna片段。

15)3,800g，4℃離心2min，棄去agarosebeads。

16)上清液中加入5μl適當?shù)目贵w(anti-gfp),4℃輕輕翻轉(zhuǎn)孵育過夜。

17)向(16)中的反應(yīng)液中加入80μl預(yù)平衡的salmonspermdna/proteinaagarosebeads，4℃繼續(xù)孵育2h。

18)3,800g，4℃離心2min，棄去上清，收集結(jié)合染色體的agarosebeads。

19)agarosebeads的清洗，分別加入1ml以下緩沖液,4℃輕輕翻轉(zhuǎn)混勻5min,3,800g，4℃離心2min，棄上清。清洗所用緩沖液的順序為：低鹽漂洗液漂洗一次，高鹽漂洗液漂洗一次，licl漂洗液漂洗一次，te緩沖液漂洗兩次。

20)250μl新配制的洗脫緩沖液加入到含有agarosebeads的離心管中，室溫輕輕翻轉(zhuǎn)15min,將免疫結(jié)合復(fù)合體從agarosebeads洗脫下來。

21)3,800g，4℃離心2min，將上清液轉(zhuǎn)移到一新的離心管中。

22)再加入250μl新配制的洗脫緩沖液到(21)步中含有agarosebeads的離心管中，室溫輕輕翻轉(zhuǎn)30min，再次洗脫免疫結(jié)合復(fù)合體，3,800g，4℃離心2min。

23)將21)和22)步驟中兩次洗脫液混合共500μl。與此同時，50μl超聲后的染色體片段(來自于步驟12)加入450μl洗脫緩沖液作為input(陽性對照)。

(4)去交聯(lián)和蛋白質(zhì)消化：

24)去交聯(lián)反應(yīng):向步驟23中的每個樣品中加入20μl5mnacl,65℃孵育過夜。

25)蛋白質(zhì)的消化：各樣品中依次加入：10μl0.5medta,20μl1mtris-hcl(ph6.5),1μlproteinasek(20mgml-1),45℃孵育1.5h。

(5)dna沉淀：

26)加入等體積(550μl)的酚/氯仿/異戊醇，輕輕翻轉(zhuǎn)混勻。

27)13,800g，4℃離心15min,將上清液轉(zhuǎn)入到一新的2ml離心管中。

28)依次加入：2.5倍體積的無水乙醇，1/10體積的3m醋酸鈉(ph5.2)，4μl糖原(20mgml-1)，-80℃沉淀dna過夜。

29)13,800g，4℃離心15min。

30)棄上清，500μl70％乙醇漂洗沉淀。13,800g，4℃離心10min。

31)棄上清，室溫干燥沉淀。

32)50μlte緩沖液溶解dna,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(6)real-timepcr：

33)實時熒光定量pcr采用roch480進行，利用lightcycler480sybrgreenimaster檢測熒光信號

34)利用基因特異引物進行pcr檢測，本實驗所涉及的基因為:gmft3、gmft4、gmtfl1、gmtfl3、gmwrky53。

35)反應(yīng)體系為15μl：

反應(yīng)程序為：

stage1：熱啟動95℃5min(20℃/s)。

stage2：pcr反應(yīng)95℃5s(20℃/s)，55℃10s(20℃/s),72℃30s(20℃/s)，45cycles?；蛳鄬Ρ磉_量的計算采用％input方法計算

(7)溶液配制：

1)交聯(lián)緩沖液：0.4m蔗糖，10mmtris–hcl(ph8.0),1mmpmsf,1mmedta,1％formaldehyde，現(xiàn)用現(xiàn)配

2)細胞核解離緩沖液：0.25m蔗糖,15mmpipes(ph6.8),5mmmgcl2,60mmkcl,15mmnacl,1mmcacl2,0.9％tritonx-100,2mgml–1pepstaina,2mgml–1aprotinin，4℃保存。

3)細胞核裂解緩沖液：50mmhepes(ph7.5),150mmnacl,1mmedta,1mmpmsf,1％sds,0.1％nadeoxycholate,1％tritonx-100,1mgml–1pepstaina,1mgml–1aprotinin

4)洗脫緩沖液：0.5％sds，0.1mnahco3

5)低鹽漂洗緩沖液：150mmnacl,20mmtris–hclph8,0.2％sds,0.5％tritonx-100,2mmedta,4℃保存。

6)高鹽漂洗緩沖液：500mmnacl,20mmtris–hclph8,0.2％sds,0.5％tritonx-100,2mmedta.4℃保存。

7)licl漂洗緩沖液：0.25mlicl,1％sodiumdeoxycholate(脫氧膽酸鈉),10mmtris–hclph8,1％np-40,1mmedta.4℃保存。

8)te緩沖液：1mmedta，10mmtris–hclph8，4℃保存。

9)pmsf：用甲醇配制成200mm，-20℃保存。

10)pepstatina：用甲醇配制成1mgml–1，-20℃保存。

11)aprotinin：用水配制成1mgml–1，-20℃保存。

12)預(yù)平衡的salmonspermdna/proteinaagarosebeads:

用裂解緩沖液來平衡proteinaagarosebeads的方法如下：視樣品的個數(shù)，分別取50μlsalmonspermdna/proteinaagarosebeads于1.5ml離心管中，3,800g，4℃離心2min，棄上清。加入50μl裂解緩沖液，4℃輕輕翻轉(zhuǎn)混勻2min,3,800g，4℃離心2min，棄上清,重復(fù)此步一次。50μl裂解緩沖液重懸proteinagarosea。

13)edta：50mm

2.結(jié)果與分析

2.1gmcrys和gmcib1過表達或rnai大豆轉(zhuǎn)基因植株的表型

通過大豆遺傳轉(zhuǎn)化得到了的gmcry1-ox,gmcry2-ox,gmcry2-rnai和gmcib1-ox轉(zhuǎn)基因植株，將野生型(wt)和各轉(zhuǎn)基因植株種植在連續(xù)光照下，分別用相應(yīng)的抗體對轉(zhuǎn)基因植株進行western檢測，結(jié)果顯示過表達植株gmcry1-ox,gmcry2-ox和gmcib1-ox中g(shù)mcry1、gmcry2和gmcib1分別都得到表達(圖12i，13g，15g)，而gmcry2-rnai轉(zhuǎn)化植株中內(nèi)源gmcry2的明顯減少(圖14i)。葉片衰老表型分析顯示，gmcry1-ox,gmcry2-rnai和gmcib1-ox轉(zhuǎn)基因植株，種植兩周左右，子葉脫落明顯早于野生型，隨著植株的生長單葉逐漸變黃，且變黃的時間也早與野生型，這三個轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)出早衰的表型。而gmcry2-ox轉(zhuǎn)基因植株無論是子葉脫落還是單葉變黃都晚于野生型，說明該轉(zhuǎn)基因植株的衰老被延遲。以上表型暗示了gmcry1和gmcib1可能促進植物衰老，而gmcry2抑制葉片衰老的進程。

進一步分析表征葉片衰老的相關(guān)參數(shù)顯示，總?cè)~綠素含量和葉綠素a:b測定結(jié)果顯示(圖16a)，gmcry1-ox,gmcry2-rnai和gmcib1-ox轉(zhuǎn)基因植株中葉綠素含量明顯低于野生型wt，而葉綠素a:b比率高于wt，因為在葉綠素降解過程中葉綠素b先轉(zhuǎn)變成葉綠素a然后再進入降解途徑，因此在降解過程中葉綠素a:b比率會升高。該結(jié)果也暗示了以上三個轉(zhuǎn)基因株系中葉綠素的降解速度高于野生型對照。而gmcry2-ox轉(zhuǎn)基因植株中則相反，葉綠素含量高于wt，而葉綠素a:b比率低于wt，推測該轉(zhuǎn)基因植株中葉綠素的降解被延遲。對連續(xù)光照下生長31天的植株進行光合速率的測定，分別選擇第二復(fù)葉和第四復(fù)葉作為測定對象，每兩天測定一次，連續(xù)測定兩周，結(jié)果表明(圖16b)，每個被測定株系的光合速率隨著葉片生長時間的增加其光合速率逐漸降低，從光合速率降低的趨勢看gmcry1-ox,gmcry2-rnai和gmcib1-ox轉(zhuǎn)基因植株中光合速率降低速度高于野生型，而gmcry2-ox轉(zhuǎn)基因植株中光合速率降低幅度小于wt。

對衰老相關(guān)基因的mrna水平測定分析表明，在早衰表型出現(xiàn)的轉(zhuǎn)基因植株，這些衰老相關(guān)基因的表達水平明顯上升，而在gmcry2-ox轉(zhuǎn)基因植株的表達水平很低(圖16c)。如擬南芥典型的衰老相關(guān)基因wrky53、sag12、apgl5在大豆中的同源基因gmwryk53、gmsagl12、gmagl12、gmapgl5在gmcry2-ox轉(zhuǎn)基因植株中的表達量遠低于wt，而在gmcry1-ox,gmcry2-rnai和gmcib1-ox轉(zhuǎn)基因植株中的表達量遠高于wt，尤其是gmwryk53、gmsagl12、gmagl12三個基因的表達量高于野生型10倍左右。暗示了gmcry1、gmcry2和gmcib1可能參與到植株衰老的調(diào)控。pao基因編碼葉綠素降解過程中起限速作用的一個酶(脫鎂葉綠酸a加氧酶)，對大豆中的該基因的同源基因gmpao的表達水平分析顯示(圖16d)，黑暗下生長12天的黃化苗分別轉(zhuǎn)移到藍光下，藍光處理6小時，在gmcry1-ox,gmcry2-rnai和gmcib1-ox轉(zhuǎn)基因植株中該基因在黑暗中的表達量很低，隨著藍光光照時間的增加其表達量逐漸增加且遠高于野生型，尤其是gmcry2-rnai轉(zhuǎn)基因植株中在藍光光照6小時時該基因的表達量比野生型高30倍左右。而在gmcry2-ox轉(zhuǎn)基因植株，該基因一直維持在很低的表達水平。推測藍光可能誘導(dǎo)gmcry1-ox,gmcry2-rnai和gmcib1-ox轉(zhuǎn)基因植株中g(shù)mpao的表達，從而加速了葉片衰老的進程。而gmcry2-ox轉(zhuǎn)基因植株中g(shù)mpao的表達被抑制，所以其葉片衰老被延遲。

在實施例1中將gmcib1基因過表達到擬南芥中得到了提前開花的轉(zhuǎn)基因擬南芥，推測gmcib1對開花調(diào)控起重要的作用。而在gmcib1-ox轉(zhuǎn)基因大豆中卻表現(xiàn)出晚花的表型(圖17)，暗示了gmcib1也起到了開花調(diào)控的作用，但與擬南芥cib1的作用相反，在大豆中g(shù)mcib1抑制開花。對其他轉(zhuǎn)基因植株開花表型分析顯示gmcry1-ox和gmcry2-rnai轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出早花的表型，而gmcry2-ox轉(zhuǎn)基因植株則表現(xiàn)出晚花。推測gmcry1和gmcry2在開花調(diào)控中起相反的作用，前者促進開花而后者抑制開花。對wt和轉(zhuǎn)基因植株中的gmfts和gmtfls的mrna的表達水平進行分析，結(jié)果顯示(圖18)在gmcry1-ox和gmcry2-rnai轉(zhuǎn)基因植株中g(shù)mfts的表達有不同程度的提高，gmtfls的表達水平很低。而在gmcib1-ox和gmcry2-ox轉(zhuǎn)基因株系中g(shù)mtfls的mrna水平明顯上升，而gmfts的表達量明顯低于wt。進一步論證了gmcry1可促進大豆開花，而gmcry2和gmcib1對開花起到負調(diào)控作用。

gmcry1過表達葉片早衰表型結(jié)果參見圖12。

gmcry2過表達葉片晚衰表型結(jié)果參見圖13。

gmcry2-rnai過表達葉片早衰表型結(jié)果參見圖14。

gmcib1過表達葉片早衰表型結(jié)果參見圖15。

葉片衰老相關(guān)參數(shù)分析結(jié)果參見圖16。

gmcrys和gmcib1對大豆開花時間的調(diào)控的結(jié)果參見圖17。

gmfts和gmtfls在不同基因型中mrna表達水平參見圖18。

2.2gmcrys和gmcib1間蛋白-蛋白相互作用的分析

2.2.1酵母雙雜交試驗分析gmcrys和gmcib1間蛋白-蛋白相互作用

擬南芥中的研究表明cry2與cib1有藍光依賴的相互作用，大豆中的crys與cibs是否也有類似的相互作用呢？我們首先通過酵母雙雜交實驗來檢測gmcrys和gmcibs間的相互作用。將atcry2、gmcry1和gmcry2分別構(gòu)建到載體pdest32(bait)上，gmcibs分別構(gòu)建到pdest22(prey)上，分別共轉(zhuǎn)化酵母細胞，在(-his，-trp，-leu)缺陷型培養(yǎng)基，黑暗和藍光(22μmolm-2s-1)條件下進行篩選。從圖19a-c看出gmcry2和gmcib1在藍光下有相互作用，atcry2與gmcib1/4/8均有藍光特異的相互作用。β-半乳糖苷酶活性檢測顯示(圖19d)含有g(shù)mcry2和gmcib1的酵母細胞在藍光下有很高的β-半乳糖苷酶活性，進一步表明gmcry2與gmcib1有藍光特異的相互作用。

gmcrys-gmcibs間蛋白的相互作用參見圖19。

gmcry2-gmcib1間蛋白的相互作用參見圖20。

gmcry1&2不同的結(jié)構(gòu)域(phr結(jié)構(gòu)域和cct結(jié)構(gòu)域)與gmcib1間的相互作用參見圖21和22。

gmcib1不同的結(jié)構(gòu)域與gmcry1&2間的相互作用參見圖23。

通過酵母雙雜交、bifc對gmcry1/2與gmcib1間的蛋白相互作用進行了分析，體內(nèi)試驗進行一步驗證顯示(圖24)，煙草瞬時表達(圖20f)顯示，gmcry2與gmcib1在煙草體內(nèi)有藍光依賴的相互作用。利用gmcib1-ox過表達植株進行pulldown試驗，結(jié)果顯示gmcry1和gmcry2在大豆體內(nèi)均能和gmcib1有藍光特異的相互作用，且這種相互作用隨著光照時間的增加，作用強度不斷增強，光照兩小時時相互作用強度最強。酵母細胞內(nèi)gmcry1僅有n端的phr區(qū)能夠與gmcib1互作，而在體內(nèi)gmcry1全長能夠與gmcib1在藍光下互作，推測gmcry1在酵母和植物體可能形成不同的結(jié)構(gòu)，因此產(chǎn)生不同的作用方式。

2.2.3體外昆蟲細胞表達系統(tǒng)pulldown試驗分析gmcrys與gmcib1的蛋白相互作用

利用昆蟲表達系統(tǒng)，分別表達了gmcrys與gmcib1-flag蛋白，體外pulldown試驗結(jié)果顯示(圖25)，gmcry1、gmcry2與gmcib1均有藍光依賴的蛋白相互作用，作用強度隨著光照時間的增加不斷增強。與gmcry2相比，gmcry1與gmcib1間作用強度較低。本實驗所用的蛋白為gmcry1全長蛋白，在酵母體內(nèi)gmcry1全長不能與gmcib1互作，而在大豆體內(nèi)兩者能夠相互作用，推測在不同的物種gmcry1的蛋白結(jié)構(gòu)可能有差異，從而導(dǎo)致了起作用方式的改變。

2.3gmcib1蛋白dna結(jié)合位點檢測

gmcib1蛋白與dna的體外相互作用結(jié)果顯示，gmcib1能夠與e-box結(jié)合(圖26)。但擬南芥中cib1體外與g-box(cacgtg)結(jié)合，體內(nèi)與e-box結(jié)合來調(diào)控下游靶基因的表達。推測gmcib1在體內(nèi)也可能通過與e-box結(jié)合調(diào)控靶基因的表達，但gmcib1調(diào)控的靶基因目前還不清楚。

2.4chip-qpcr檢測gmcib1與衰老或開花調(diào)控相關(guān)基因的染色體間相互作用

gmcib1過表達轉(zhuǎn)基因大豆表現(xiàn)出早衰和晚花的表型，為了尋找gmcib1作用的下游靶基因，來初步闡明其作用機制。首先通過chip-qpcr來研究gmcib1與一些候選基因染色體區(qū)的相互作用。候選基因是選擇上述所檢測的基因中，mrna表達水平變化較大的一些基因。如開花調(diào)控中的gmft3、gmft4、gmtfl1、gmtfl3，衰老相關(guān)的基因gmwrky53。對實驗材料進行了黑暗和藍光處理，看是否藍光會影響其間的相互作用。實驗結(jié)果顯示，無論在藍光或黑暗下gmcib1蛋白均能與gmft3、gmft4和gmwrky53染色體區(qū)的e-box結(jié)合(圖27a，27b，27e)，進一步分析發(fā)現(xiàn)藍光和黑暗下結(jié)合e-box有相同的也有不同的。如gmft3染色體區(qū)與gmcib1結(jié)合的e-box在藍光和黑暗下是相同的，而gmft4中的a區(qū)是暗黑下特異結(jié)合的，而j區(qū)是藍光下特異結(jié)合。gmwrky53中含有兩個e-box的k區(qū)與gmcib1在藍光下的結(jié)合能力遠遠高于黑暗下。而且gmcib1所結(jié)合的這些區(qū)域不僅分布在基因啟動區(qū)，在基因組中也有分布，暗示了下游靶基因的染色體結(jié)構(gòu)決定了轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點，同時也推測gmcib1對靶基因的調(diào)控作用不是嚴格的藍光依賴性的。在gmtfl1和gmtfl3中沒有檢測到gmcib1蛋白結(jié)合的區(qū)域(圖27c，27d)，說明gmcib1可能對二者沒有調(diào)控作用。

3.討論

3.1gmcry1-ox,gmcry2-ox,gmcry2-rnai和gmcib1-ox轉(zhuǎn)基因植株的表型分析

通過大豆遺傳轉(zhuǎn)化獲得gmcry1-ox,gmcry2-ox,gmcry2-rnai和gmcib1-ox轉(zhuǎn)基因大豆，對表型進行觀察過程中發(fā)現(xiàn)，連續(xù)光照下(ll)，不同轉(zhuǎn)基因植株中出現(xiàn)有衰老相關(guān)的表型。

在ll條件下gmcry1-ox,gmcry2-ox和gmcib1-ox轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出早衰現(xiàn)象，如與野生型(wt)相比子葉和單葉變黃和脫落明顯提前，葉片衰老表征的參數(shù)測定顯示wt還處于較高光合作用時期時，這些轉(zhuǎn)基因株系中葉綠素含量劇減，光合速率也大幅度降低，同時衰老相關(guān)基因(gmwryk53、gmsagl12、gmagl12、gmapgl5)的mrna水平也明顯上升。而gmcry2-ox轉(zhuǎn)基因植株中卻出現(xiàn)相反的表型，子葉和單葉變黃和脫落相對于wt來說明顯被推遲，葉綠素含量沒有明顯降低，光合速率降低速度遠低于wt，衰老相關(guān)基因的表達受到抑制。暗示了在葉片衰老調(diào)控過程中g(shù)mcry1和gmcib1起到正調(diào)控的作用，而gmcry2可能抑制葉片的衰老?；虻谋磉_模式從某種程度上決定了基因的功能。實施例1中對gmcib1的mrna的時空表達模式進行了詳盡的分析，結(jié)果顯示gmcib1在單葉時期的整體表達水平相對較高，過表達gmcib1的轉(zhuǎn)基因大豆植株中，在單葉時期葉片衰老提前的表型就已顯現(xiàn)，推測gmcib1在單葉時期的集中表達促進了其功能的發(fā)揮。而gmcib1的光周期表達模式分析顯示，該基因的mrna水平受光照的正調(diào)控，當在連續(xù)光照條件下(圖8c的a和c)，gmcib1的整體表達水平呈現(xiàn)增長趨勢，這一表達模式可能與gmcib1過表達植株在連續(xù)光照下表現(xiàn)出明顯的早衰表型相關(guān)，基因表達模式與其功能間相關(guān)性的具體機理目前還不清楚，還需做進一步研究。

開花表型分析發(fā)現(xiàn)，gmcry1-ox和gmcry2-rnai轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出早花表型，而gmcry2-ox和gmcib1-ox轉(zhuǎn)基因大豆表現(xiàn)出晚開花。擬南芥中ft和tfl是開花調(diào)控中兩個功能相反的基因，ft是一個開花途徑中的整合因子整合來自不同開花途徑的信號，促進開花。而tfl1與ft的功能完全相反，是一種開花抑制因子。tfl1主要通過延遲開花途徑整合基因lfy的表達，并抑制花分生組織基因ap1和cal的表達，延長營養(yǎng)生長階段，抑制成花轉(zhuǎn)變，并維持花序的無限生長狀態(tài)。大豆中ft的9個同源基因gmfts在gmcry1-ox和gmcry2-rnai轉(zhuǎn)基因植株的表達量有不同程度的提高，而在gmcry2-ox和gmcib1-ox轉(zhuǎn)基因大豆中的表達量都維持很低的水平。擬南芥開花抑制因子tfl1的4個同源基因gmfts在gmcry2-ox和gmcib1-ox轉(zhuǎn)基因植株的表達量有不同程度的提高，而在gmcry1-ox和gmcry2-rnai轉(zhuǎn)基因大豆中的表達量很低。以上結(jié)果顯示，在開花調(diào)控中g(shù)mcry2和gmcib1可能起到相同的調(diào)控作用，抑制開花。而gmcry1起到開花促進作用。在實施例1中通過將gmcib1基因過表達在擬南芥中對其功能進行了分析，在擬南芥中該基因能夠促進atft的mrna表達水平從而提前開花，其表型與上述gmcib1基因在大豆中抑制開花的結(jié)果相反，推測可能是由于物種的不同而導(dǎo)致了基因調(diào)控機制的不同。大豆是嚴格的短日照植物，而擬南芥是長日照植物，而且本研究中還得出gmcib1的表達水平受光調(diào)控，這些因素可是導(dǎo)致了gmcib1基因在擬南芥和大豆中表現(xiàn)出不同功能，至于具體的機制還需通過對gmcib1基因乃至整個gmcib基因家族的深入研究來揭示。綜上所述，我們可以得出在葉片衰老調(diào)控中，gmcry1和gmcib1均起到促進作用，而gmcry2起負調(diào)控。在開花調(diào)控中g(shù)mcry1促進開花，而gmcry2和gmcib1抑制開花。gmcry1和gmcry2在這兩種調(diào)控中起到完全相反的作用，二者可能在每種調(diào)控過程中起到拮抗作用。

3.2gmcrys和gmcib1間蛋白-蛋白的相互作用

為了更好地詮釋gmcrys和gmcib1在大豆中的功能，對它們之間的相互作用進行了深入的研究。首先通過酵母雙雜交實驗篩選到gmcry2和gmcib1藍光特異的相互作用，且作用強度隨著藍光光強的增強和光照時間的增加而增加，但gmcry1全長與gmcib1卻沒有相互作用。gmcry1/2的phr區(qū)與gmcib1有藍光特異的相互作用，暗示了gmcry的phr域是蛋白-蛋白相互作用必需的，而gmcry1的cct結(jié)構(gòu)域可能會影響其與gmcib1間的相互作用。對gmcib1的結(jié)構(gòu)分析顯示其n端結(jié)構(gòu)域也是蛋白互作必需的結(jié)構(gòu)域。

體內(nèi)試驗，煙草瞬時表達和gmcib1-ox轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)的pull-down試驗進一步論證了gmcry2和gmcib1藍光依賴的相互作用。利用昆蟲蛋白表達系統(tǒng)分別表達的gmcry1、gmcry2和gmcib1蛋白而進行的pull-down試驗也得出相同的結(jié)果。而gmcry1和gmcib1間的相互作用較有意思，雖然全長gmcry1在酵母和煙草中不能與gmcib1蛋白互作，但在大豆體內(nèi)二者有藍光依賴的相互作用。昆蟲表達的gmcry1與gmcib1蛋白在藍光下也有較弱的互作。推測gmcry1在酵母、昆蟲和植物體可能形成不同的結(jié)構(gòu)，影響蛋白間的相互作用。

3.3gmcib1與衰老或開花調(diào)控相關(guān)基因的染色體間相互作用

擬南芥cib1在體外與e-box(canntg)中的g-box(cacgtg)結(jié)合,體內(nèi)與ft啟動子區(qū)的e-box結(jié)合來調(diào)控開花。gmcib1與dna相互作用的體外試驗結(jié)果顯示gmcib1可與e-box結(jié)合，chip試驗表明gmcib1與擬南芥ft的同源基因gmft3和gmft4染色體區(qū)的e-box結(jié)合，也能與衰老相關(guān)基因wryk53的同源基因gmwryk53啟動子區(qū)核基因組內(nèi)的e-box結(jié)合，并且這種結(jié)合沒有嚴格的藍光特異性。而開花抑制基因tfl的同源基因gmtfl1和gmtfl3沒有檢測出結(jié)合區(qū)域。推測gmcib1在大豆體內(nèi)可能通過負調(diào)控gmft的表達抑制開花，促進衰老相關(guān)基因如gmwryk53的轉(zhuǎn)錄進而促進葉片衰老。

4.小結(jié)

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的子葉節(jié)轉(zhuǎn)化方法獲得gmcry1-ox,gmcry2-ox,gmcry2-rnai和gmcib1-ox轉(zhuǎn)基因大豆，分別對轉(zhuǎn)基因植株進行表型分析；利用酵母雙雜交、bifc以及免疫共沉淀等手段研究了gmcrys和gmcib1將的相互作用；分析了gmcib1與dna體外相互作用的位點，并通過chip試驗初步篩選鑒定gmcib1的下游作用靶基因。主要得到以下結(jié)論：

gmcry1-ox,gmcry2-ox,gmcry2-rnai和gmcib1-ox轉(zhuǎn)基因大豆表型分析結(jié)果表明，在連續(xù)光照下，過表達gmcry2導(dǎo)致植株葉片衰老延遲，而在gmcry1-ox,gmcry2-rnai和gmcib1-ox轉(zhuǎn)基因大豆出現(xiàn)葉片提前衰老的表型，初步推測gmcry1和gmcib1在葉片衰老調(diào)控過程中起到正調(diào)控的作用，而gmcry2可能抑制葉片的衰老。

過表達gmcry1和gmcry2敲除轉(zhuǎn)基因大豆表現(xiàn)出提前開花，而過表達gmcry2、gmcib1則導(dǎo)致大豆晚開花，暗示了gmcry1促進開花，而gmcry2和gmcib1負調(diào)控大豆開花。酵母雙雜交和bifc試驗表明，gmcry2和gmcib1有藍光特異的相互作用，且這種相互作用隨著光強的增強和光照時間的增加而增強。gmcry1和gmcry2的phr結(jié)構(gòu)域參與和gmcib1藍光依賴的相互作用。體內(nèi)(gmcib1-ox轉(zhuǎn)基因大豆)和體外(昆蟲蛋白表達系統(tǒng))pull-down試驗進一步驗證了gmcry1/gmcry2與gmcib1間藍光依賴的相互作用。

gmcib1與dna體外的相互作用結(jié)果顯示gmcib1與e-box結(jié)合，chip試驗顯示，gmcib1與擬南芥ft的同源基因gmft3和gmft4染色體區(qū)的e-box結(jié)合，也能與衰老相關(guān)基因wryk53的同源基因gmwryk53啟動子區(qū)核基因組內(nèi)的e-box結(jié)合，并且這種結(jié)合沒有嚴格的藍光特異性，推測gmcib1在大豆體內(nèi)可能通過負調(diào)控gmft的表達抑制開花，促進衰老相關(guān)基因如gmwryk53的轉(zhuǎn)錄進而促進葉片衰老。

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序列表

<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所

<120>大豆gmcib1基因和gmcry2基因及其調(diào)控開花及衰老的作用

<160>4

<210>1

<211>1263

<212>dna

<213>大豆

<400>1

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<211>634

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