本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及楊樹(shù)花粉變應(yīng)原致敏成分1與致敏成分2的表達(dá)及純化。

背景技術(shù)：

隨著經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展，工業(yè)化程度越來(lái)越高，并因環(huán)境污染和現(xiàn)代生活方式改變導(dǎo)致人體免疫力變化，我國(guó)花粉癥的發(fā)病率也在顯著升高?；ǚ郯Y是由于特應(yīng)性個(gè)體接觸花粉后所產(chǎn)生的由ige介導(dǎo)的一種超敏反應(yīng)[1]，是一種季節(jié)性疾病，根據(jù)花粉播散季節(jié)的不同，可分為春季和夏秋季節(jié)花粉癥，導(dǎo)致春季花粉癥的主要是樹(shù)木花粉[2,3]，夏秋季花粉癥主要由禾本科植物和莠類雜草花粉引起[4,5]。在我國(guó)北方，每年花粉病發(fā)病的兩個(gè)高峰期主要是4～5月和8～9月[6]。

楊樹(shù)是我國(guó)種植最廣的樹(shù)種之一，不論營(yíng)造防護(hù)林、用材林還是用于城市綠化，都是主要的選擇樹(shù)種[7]。尤其近十幾年，我國(guó)楊樹(shù)造林面積不斷擴(kuò)大，現(xiàn)已成為世界上楊樹(shù)人工林面積最大的國(guó)家。然而每年楊樹(shù)雄株產(chǎn)生的花粉和雌株產(chǎn)生的飛絮導(dǎo)致的過(guò)敏及環(huán)境問(wèn)題也給致敏患者及其家庭、社會(huì)造成了很大的負(fù)擔(dān)[8]，由此帶來(lái)的過(guò)敏性疾病有過(guò)敏性哮喘[9]和鼻炎等。據(jù)統(tǒng)計(jì)我國(guó)對(duì)花粉過(guò)敏的患者有約1000萬(wàn)人，已成為威脅我國(guó)居民健康、影響人民生活質(zhì)量的主要非感染性疾病之一，因此其危害也受到越來(lái)越多的關(guān)注[10]。因此對(duì)楊樹(shù)開(kāi)展致敏性研究，進(jìn)行低致敏品種選育，篩選出新致敏相關(guān)性蛋白，可有效減少和抑制植物致敏源的形成和傳播，促進(jìn)植物過(guò)敏性疾病的預(yù)防和控制，從而降低花粉、花絮過(guò)敏的發(fā)病率，對(duì)提高人民的健康水平具有重大的現(xiàn)實(shí)意義[11]。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是提供一種楊樹(shù)花粉變應(yīng)原致敏成分1。

目的之二是提供一種楊樹(shù)花粉變應(yīng)原致敏成分2。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：楊樹(shù)花粉變應(yīng)原致敏成分1，所述變應(yīng)原致敏成分1是從楊樹(shù)花粉中分離或純化重組得到。

所述變應(yīng)原致敏成分1的氨基酸序列如seqidno.1所示。

所述致敏成分1融合蛋白pet28a-致敏成分1通過(guò)sds-page測(cè)定的表觀分子量為22kda。

楊樹(shù)花粉變應(yīng)原致敏成分1的制備方法，包括以下步驟：

(1)將目的基因致敏成分1亞克隆到pet28a質(zhì)粒中，獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)化到大腸桿菌bl21(de3)中，利用iptg誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白；

(2)將獲得的重組蛋白超聲破碎并低溫離心，溶液上清或沉淀通過(guò)鎳柱親和層析進(jìn)行純化，洗脫得到純化重組蛋白。

楊樹(shù)花粉變應(yīng)原致敏成分2，所述變應(yīng)原致敏成分2是從楊樹(shù)花粉中分離或純化重組得到。

所述變應(yīng)原致敏成分2的氨基酸序列如seqidno.2所示。

所述變應(yīng)原致敏成分2融合蛋白pet28a-致敏成分1通過(guò)sds-page測(cè)定的表觀分子量為25kda。

楊樹(shù)花粉變應(yīng)原致敏成分2的制備方法，包括以下步驟：

(1)將目的基因致敏成分2亞克隆到pet28a質(zhì)粒中，獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)化到大腸桿菌bl21(de3)中，利用iptg誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白；

(2)將獲得的重組蛋白超聲破碎并低溫離心，溶液上清或沉淀通過(guò)鎳柱親和層析進(jìn)行純化，洗脫得到純化重組蛋白。

致敏成分1的氨基酸序列為：manprvyfdmtiggqpagrivmelfadttprtaenfralctgekgkgrsgkplhykgstfhrvipgfmcqggdftagngtggesiygskfadenfikkhtgpgilsmanagpgtngsqffvctaktewldgkhvvfgrvvegldvvkaiekfgssngrtskpvvvadcgqls。

致敏成分2的氨基酸序列為：atfeirnscpytvwaaaspgggrrlergqtwnlnvpagtsmariwgrtncnfdgggkgrcqtgdctggleckgwgvppntlaeyalnqfgnldfydislvdgfnipiefsptsgggkcqallctadingqcpnelrapggcnnpcsvfktneycctngqgscgptkfsrffkdrcptsysypqddptstftcpggtnyrvifcprgsphfplemveekrae

深入研究變應(yīng)原的目的主要是進(jìn)行過(guò)敏原檢測(cè)和用做特異性治療(specificallergyvaccinationtreatment,savt)[12]，然而國(guó)內(nèi)臨床上進(jìn)行體內(nèi)外過(guò)敏原檢測(cè)和特異性免疫治療所使用的花粉浸液多為粗提液?；ǚ鄞痔嵋褐泻卸喾N蛋白質(zhì)成分，其中包括主要、次要變應(yīng)原和其他雜蛋白。用這種花粉浸液進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和特異性免疫治療時(shí)，可能會(huì)造成高敏體質(zhì)的病人出現(xiàn)嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)，而眾多的雜質(zhì)則影響實(shí)驗(yàn)的特異性和敏感性，同時(shí)由于其非標(biāo)準(zhǔn)化或副作用等原因，savt取得良好療效的劑量難以掌握[13]。目前，開(kāi)發(fā)高純度、低致敏性的變應(yīng)原制劑是近年國(guó)內(nèi)外該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[14]，所以對(duì)致敏成分1和致敏成分2的鑒定為致敏成分1和致敏成分2在楊樹(shù)過(guò)敏的臨床診斷應(yīng)用和脫敏疫苗的研制方面提供一定的試驗(yàn)依據(jù)。

附圖說(shuō)明

圖1是實(shí)施例融合蛋白pet28a-致敏成分1誘導(dǎo)表達(dá)鑒定的sds-page結(jié)果，其中1是未經(jīng)誘導(dǎo)的致敏成分1蛋白免疫印跡條帶，2是經(jīng)誘導(dǎo)后的蛋白，3是蛋白經(jīng)加入0.5mmiptg，在11度的溫度下誘導(dǎo)超聲后的上清，4是蛋白經(jīng)加入0.5mmiptg，在11度的溫度下誘導(dǎo)超聲后的沉淀，m為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，由上而下分別為180.0，140.0，100.0，80.0，60.0，45.0，35.0，25.0，15.0，10.0kda。

圖2是實(shí)施例融合蛋白pet28a-致敏成分1分離純化的sds-page結(jié)果，其中1是未經(jīng)純化的致敏成分1蛋白，2是30mm咪唑純化后的洗脫液，3是50mm咪唑純化后的目的蛋白，4是100mm咪唑純化后的目的蛋白，5是150mm咪唑純化后的目的蛋白，6是200mm咪唑純化后的目的蛋白m為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，7是250mm咪唑純化后的目的蛋白，m為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，由上而下分別為180.0，140.0，100.0，80.0，60.0，45.0，35.0，25.0，15.0，10.0kda。

圖3是致敏成分1蛋白western-blot驗(yàn)證結(jié)果，1是未誘導(dǎo)的蛋白，作為對(duì)照；2是經(jīng)iptg誘導(dǎo)的蛋白，his-抗體作為一抗進(jìn)行結(jié)合。

圖4是致敏成分1與ige免疫結(jié)合的western-blot結(jié)果，其中1是用健康受試者的血清為一抗，以此為對(duì)照，2是用對(duì)楊樹(shù)花粉過(guò)敏患者的混合血清作為一抗。

圖5是實(shí)施例融合蛋白pet28a-致敏成分2誘導(dǎo)表達(dá)及純化的sds-page結(jié)果，其中1是未經(jīng)誘導(dǎo)的致敏成分2蛋白免疫印跡條帶，2是經(jīng)誘導(dǎo)后的蛋白，3是蛋白經(jīng)加入0.5mmiptg，在11度的溫度下誘導(dǎo)超聲后的上清，4是蛋白經(jīng)加入0.5mmiptg，在11度的溫度下誘導(dǎo)超聲后的沉淀，5是用尿素溶解的包涵體，6是250mm咪唑純化后的目的蛋白，m為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，由上而下分別為180.0，140.0，100.0，80.0，60.0，45.0，35.0，25.0，15.0，10.0kda。

圖6是致敏成分2蛋白western-blot驗(yàn)證結(jié)果，1是未誘導(dǎo)的蛋白，作為對(duì)照；2是經(jīng)iptg誘導(dǎo)的蛋白，his-抗體作為一抗進(jìn)行結(jié)合。

圖7是致敏成分2與ige免疫結(jié)合的western-blot結(jié)果，其中1是用健康受試者的血清為一抗，以此為對(duì)照，2是用對(duì)楊樹(shù)花粉過(guò)敏患者的混合血清作為一抗。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。

實(shí)施例1

pet28a-致敏成分1質(zhì)粒構(gòu)建：

將目的基因亞克隆到pet28a載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌bl21(de3)中，iptg進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果顯示致敏成分1蛋白存在包涵體中，包涵體通過(guò)鎳柱純化，透析復(fù)性得到純化的致敏成分1蛋白，下面為致敏成分1的基因區(qū)域：

atggcaaaccctagagtctacttcgacatgacaatcggcggccaaccagccggccggatcgtgatggaactgttcgccgacacaactccacgaaccgcagagaacttcagggctctttgcactggagagaaaggaaaaggccgaagcggcaagcctttacactacaaaggctcgactttccatcgagtcatccctggattcatgtgccaaggaggagatttcactgcagggaatggaaccggaggggaatcgatctacggatcgaaatttgctgacgagaattttataaagaaacatactgggccagggattttgtccatggccaatgctgggcctgggactaacgggtcgcagttctttgtctgtacagccaagactgaatggctcgatggaaaacacgtggtgtttggaagagtagtggagggtctggatgttgtgaaggctatagagaagtttgggtcgtctaatggaaggacctctaagcctgttgttgttgctgactgtggacagctttct

下面是翻譯后的致敏成分1的氨基酸序列：

manprvyfdmtiggqpagrivmelfadttprtaenfralctgekgkgrsgkplhykgstfhrvipgfmcqggdftagngtggesiygskfadenfikkhtgpgilsmanagpgtngsqffvctaktewldgkhvvfgrvvegldvvkaiekfgssngrtskpvvvadcgqls

融合后pet28a-致敏成分1的理論分子量約為22kda。

實(shí)驗(yàn)方法：

將pet28a-致敏成分1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌bl21(de3)中，置冰上20min；42℃熱激90sec，迅速置冰中5min；加入600μl，37℃預(yù)熱的lb培養(yǎng)液；37℃，220rpm振搖1h，離心后全部涂布于含50μg/ml卡那抗生素的lb平板，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。

iptg誘導(dǎo)pet28a-致敏成分1融合蛋白的表達(dá)：挑取轉(zhuǎn)化平板上的單克隆接種于含50μg/ml卡那抗生素的3mllb培養(yǎng)液的試管中，37℃220rpm振搖過(guò)夜；次日按1：100接種于50μg/ml卡那抗生素的30mllb培養(yǎng)液中，37℃220rpm振搖至菌體od600為0.4(約2h)；取出1ml培養(yǎng)物，10000g室溫離心2min，棄上清，用100μl1×上樣緩沖液重懸菌體沉淀；向剩余的培養(yǎng)物中加入iptg至終濃度為0.5mm11℃220rpm分別振搖8h，誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)。

變應(yīng)原致敏成分1的確定(采用免疫印跡方法)：取出1ml培養(yǎng)物，12000g室溫離心2min，棄上清，用100μl1×上樣緩沖液重懸菌體沉淀。應(yīng)用12％分離膠，5％濃縮膠對(duì)樣品進(jìn)行分離。起始電壓70v，待溴酚藍(lán)前沿進(jìn)入分離膠后將電壓升至120v，恒壓電泳，直至溴酚藍(lán)前沿到達(dá)凝膠下邊界，停止電泳。取下凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。恒流轉(zhuǎn)引60min，將蛋白轉(zhuǎn)印至pvdf膜上。將pvdf膜放入盛有封閉液的平皿中，封閉3h。將封閉后的pvdf膜放在一抗中，4度過(guò)夜。次日將條帶用tbst進(jìn)行洗滌3*10min。之后放入到鼠抗(二抗)中，室溫置搖床上2h，結(jié)束后用tbst進(jìn)行洗滌3*5min，進(jìn)行底物顯色，待蛋白條帶顯色清晰，終止反應(yīng)。變應(yīng)原致敏成分1的分離純化：

將誘導(dǎo)表達(dá)的培養(yǎng)菌體沉淀用20ml抽提液ni-idabinding-buffer重懸后，超聲破碎(功率400w，工作4sec，間歇8sec，共20min)，4℃10000g離心20min，取上清，以0.5ml/min流速上樣至ni-idabinding-buffer預(yù)平衡的ni-ida-sepharosecl-6b親和層析柱；用ni-idabinding-buffer以0.5ml/min流速?zèng)_洗，至流出液od280值到達(dá)基線；用ni-idawashing-buffer(20mmtris-hcl，20mm咪唑，0.15mnacl，ph8.0)以1ml/min流速?zèng)_洗，至流出液od280值到達(dá)基線；用ni-idaelution-buffer(20mmtris-hcl，250mm咪唑，0.15mnacl，ph8.0)以1ml/min流速洗脫目的蛋白，收集流出液；將洗脫后的重組蛋白用透析緩沖液pbs(ph7.4)透析，每隔12小時(shí)換一次透析液，換液3次后，取出透析后的蛋白液，于-20℃保存?zhèn)溆?，同時(shí)進(jìn)行12％sds-page分析,結(jié)果如圖所示。

圖1是實(shí)施例融合蛋白pet28a-致敏成分1誘導(dǎo)表達(dá)鑒定的sds-page結(jié)果，其中1是未經(jīng)誘導(dǎo)的致敏成分1蛋白免疫印跡條帶，2是經(jīng)誘導(dǎo)后的蛋白，3是蛋白經(jīng)加入0.5mmiptg，在11度的溫度下誘導(dǎo)超聲后的上清，4是蛋白經(jīng)加入0.5mmiptg，在11度的溫度下誘導(dǎo)超聲后的沉淀，m為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，由上而下分別為180.0，140.0，100.0，80.0，60.0，45.0，35.0，25.0，15.0，10.0kda。

圖2是實(shí)施例融合蛋白pet28a-致敏成分1分離純化的sds-page結(jié)果，其中1是未經(jīng)純化的致敏成分1蛋白，2是30mm咪唑純化后的洗脫液，3是50mm咪唑純化后的目的蛋白，4是100mm咪唑純化后的目的蛋白，5是150mm咪唑純化后的目的蛋白，6是200mm咪唑純化后的目的蛋白，7是250mm咪唑純化后的目的蛋白，m為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，由上而下分別為180.0，140.0，100.0，80.0，60.0，45.0，35.0，25.0，15.0，10.0kda。

圖3是致敏成分1蛋白western-blot驗(yàn)證結(jié)果，1是未誘導(dǎo)的蛋白，作為對(duì)照；2是經(jīng)iptg誘導(dǎo)的蛋白，his-抗體作為一抗進(jìn)行結(jié)合。

圖4是致敏成分1與ige免疫結(jié)合的western-blot結(jié)果，其中1是用健康受試者的血清為一抗，以此為對(duì)照，2是用對(duì)楊樹(shù)花粉過(guò)敏患者的混合血清作為一抗。

實(shí)施例2

pet28a-致敏成分2質(zhì)粒構(gòu)建：

將目的基因亞克隆到pet28a載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌bl21(de3)中，iptg進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果顯示致敏成分2蛋白存在包涵體中，包涵體通過(guò)鎳柱純化，透析復(fù)性得到純化的pop4蛋白，下面為致敏成分2的基因區(qū)域：

gccacctttgaaatccgaaatagttgtccttacactgtgtgggccgcagcctcacctggtggtggacgccgtctagaacgtggccaaacttggaatcttaatgtgcctgctggcacctccatggctcgtatttggggcaggacaaattgtaacttcgatggtggtggtaagggtcgttgccaaactggggattgtactggtggcctcgagtgcaaaggctggggtgtccctcccaacactctagcagaatatgcattaaatcagtttggtaacttggatttttatgatatatcgcttgttgatggatttaatatccctatagaatttagtccaacatcaggcggtgggaagtgtcaagcgcttctttgcacagcagatattaatgggcaatgtcctaatgaattgagggctcctggggggtgtaataacccatgttccgtgttcaaaactaacgaatattgctgcactaatgggcaggggagctgtggccctaccaaattttcaaggttttttaaggataggtgccctacttcttatagctatccccaggatgaccctacaagcacatttacatgccctggcgggaccaactatagggttatcttttgccctcgggggtctcctcatttccccttggagatggttgaagaaaagcgtgcagag

下面是翻譯后的致敏成分2氨基酸序列，融合后pet28a-致敏成分2的理論分子量約為25kda。

atfeirnscpytvwaaaspgggrrlergqtwnlnvpagtsmariwgrtncnfdgggkgrcqtgdctggleckgwgvppntlaeyalnqfgnldfydislvdgfnipiefsptsgggkcqallctadingqcpnelrapggcnnpcsvfktneycctngqgscgptkfsrffkdrcptsysypqddptstftcpggtnyrvifcprgsphfplemveekrae

實(shí)驗(yàn)方法：

將pet28a-致敏成分2分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌bl21(de3)中，置冰上20min；42℃熱激90sec，迅速置冰中5min；加入600μl，37℃預(yù)熱的lb培養(yǎng)液；37℃，220rpm振搖1h，離心后全部涂布于含50μg/ml卡那抗生素的lb平板，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。

iptg誘導(dǎo)pet28a-致敏成分2融合蛋白的表達(dá)：挑取轉(zhuǎn)化平板上的單克隆接種于含50μg/ml卡那抗生素的3mllb培養(yǎng)液的試管中，37℃220rpm振搖過(guò)夜；次日按1：100接種于50μg/ml卡那抗生素的30mllb培養(yǎng)液中，37℃220rpm振搖至菌體od600為0.4(約2h)；取出1ml培養(yǎng)物，10000g室溫離心2min，棄上清，用100μl1×上樣緩沖液重懸菌體沉淀；向剩余的培養(yǎng)物中加入iptg至終濃度為0.5mm11℃220rpm分別振搖8h，誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)。

變應(yīng)原致敏成分2的確定(采用免疫印跡方法)：取出1ml培養(yǎng)物，12000g室溫離心2min，棄上清，用100μl1×上樣緩沖液重懸菌體沉淀。應(yīng)用12％分離膠，5％濃縮膠對(duì)樣品進(jìn)行分離。起始電壓70v，待溴酚藍(lán)前沿進(jìn)入分離膠后將電壓升至120v，恒壓電泳，直至溴酚藍(lán)前沿到達(dá)凝膠下邊界，停止電泳。取下凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。恒流轉(zhuǎn)引60min，將蛋白轉(zhuǎn)印至pvdf膜上。將pvdf膜放入盛有封閉液的平皿中，封閉3h。將封閉后的pvdf膜放在一抗中，4度過(guò)夜。次日將條帶用tbst進(jìn)行洗滌3*10min。之后放入到鼠抗(二抗)中，室溫置搖床上2h，結(jié)束后用tbst進(jìn)行洗滌3*5min，進(jìn)行底物顯色，待蛋白條帶顯色清晰，終止反應(yīng)。變應(yīng)原致敏成分2的分離純化：

將誘導(dǎo)表達(dá)的培養(yǎng)菌體沉淀用20ml抽提液ni-idabinding-buffer重懸后，超聲破碎(功率400w，工作4sec，間歇8sec，共20min)，4℃10000g離心20min，取上清，以0.5ml/min流速上樣至ni-idabinding-buffer預(yù)平衡的ni-ida-sepharosecl-6b親和層析柱；用ni-idabinding-buffer以0.5ml/min流速?zèng)_洗，至流出液od280值到達(dá)基線；用ni-idawashing-buffer(20mmtris-hcl，20mm咪唑，0.15mnacl，ph8.0)以1ml/min流速?zèng)_洗，至流出液od280值到達(dá)基線；用ni-idaelution-buffer(20mmtris-hcl，250mm咪唑，0.15mnacl，ph8.0)以1ml/min流速洗脫目的蛋白，收集流出液；將洗脫后的重組蛋白用透析緩沖液pbs(ph7.4)透析，每隔12小時(shí)換一次透析液，換液3次后，取出透析后的蛋白液，于-20℃保存?zhèn)溆?，同時(shí)進(jìn)行12％sds-page分析,結(jié)果如圖所示。

圖5是實(shí)施例融合蛋白pet28a-致敏成分2誘導(dǎo)表達(dá)及純化的sds-page結(jié)果，其中1是未經(jīng)誘導(dǎo)的致敏成分2蛋白免疫印跡條帶，2是經(jīng)誘導(dǎo)后的蛋白，3是蛋白經(jīng)加入0.5mmiptg，在11度的溫度下誘導(dǎo)超聲后的上清，4是蛋白經(jīng)加入0.5mmiptg，在11度的溫度下誘導(dǎo)超聲后的沉淀，5是用尿素溶解的包涵體，6是250mm咪唑純化后的目的蛋白，m為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，由上而下分別為180.0，140.0，100.0，80.0，60.0，45.0，35.0，25.0，15.0，10.0kda。

圖6是致敏成分2蛋白western-blot驗(yàn)證結(jié)果，1是未誘導(dǎo)的蛋白，作為對(duì)照；2是經(jīng)iptg誘導(dǎo)的蛋白，his-抗體作為一抗進(jìn)行結(jié)合。

圖7是致敏成分2與ige免疫結(jié)合的western-blot結(jié)果，其中1是用健康受試者的血清為一抗，以此為對(duì)照，2是用對(duì)楊樹(shù)花粉過(guò)敏患者的混合血清作為一抗。

如上所述，盡管參照特定的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)表示和表述了本發(fā)明，但其不得解釋為對(duì)本發(fā)明自身的限制。在不脫離所附權(quán)利要求定義的本發(fā)明的精神和范圍前提下，可對(duì)其在形式上和細(xì)節(jié)上作出各種變化。

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序列表

<110>南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院

<120>楊樹(shù)變應(yīng)原

<160>2

<210>seqidn0.1

<211>516

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