本發(fā)明涉及廢水生物處理與回用中的菌群培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種厭氧條件下富集培養(yǎng)丙酸氧化菌及其互營共生菌群的方法。

技術(shù)背景

有機(jī)物厭氧生物代謝產(chǎn)甲烷過程，主要是通過不同類型微生物菌群協(xié)同作用將大分子有機(jī)物質(zhì)降解為揮發(fā)性脂肪酸等中間產(chǎn)物，并最終轉(zhuǎn)化為ch4、co2和h2o等物質(zhì)。其中丙酸是此過程中重要的中間代謝產(chǎn)物，有研究表明，體系中甲烷產(chǎn)量中大約有35％以上是由丙酸轉(zhuǎn)化而來的。然而丙酸不能被產(chǎn)甲烷菌群直接代謝，需要先轉(zhuǎn)化為乙酸而后被利用，此過程受熱動(dòng)力學(xué)限制(δg⁰>0)，反應(yīng)不能自發(fā)進(jìn)行，需其他耗氫菌群配合形成互營共生體。然而受限于“代謝鏈”前段的發(fā)酵產(chǎn)酸細(xì)菌和后段共生氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌群代謝的影響，丙酸易在厭氧系統(tǒng)中發(fā)生累積，被認(rèn)為是厭氧生物代謝過程限速步驟。丙酸的過度積累不僅影響體系環(huán)境生態(tài)因子，對(duì)包括產(chǎn)甲烷菌群在內(nèi)的其他微生物菌群產(chǎn)生抑制作用，而且會(huì)通過反饋抑制剩余有機(jī)物的水解酸化，進(jìn)而導(dǎo)致厭氧生物代謝全鏈條受阻，處理效能和運(yùn)行穩(wěn)定性下降。因此，提高厭氧生物代謝系統(tǒng)中丙酸的降解效率，緩解或解除其在系統(tǒng)內(nèi)的過度累積效應(yīng)，是保證系統(tǒng)穩(wěn)定運(yùn)行，提高原料轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵措施。

目前，構(gòu)建高效丙酸氧化菌及其互營共生菌群，實(shí)現(xiàn)丙酸在體系內(nèi)的快速代謝降解，是提升有機(jī)物厭氧生物處理效能和運(yùn)行穩(wěn)定性的主要思路。然而，常規(guī)方式主要是通過調(diào)控包括ph、orp(氧化還原電位)、堿度、有機(jī)負(fù)荷和水力停留時(shí)間等體系環(huán)境生態(tài)因子，最終找出共培養(yǎng)體最適合的生態(tài)因子范圍并獲得共培養(yǎng)菌群，如專利cn104591402a(一種互營脂肪酸氧化菌與產(chǎn)電菌優(yōu)勢菌群的構(gòu)建方法)；或者將多種類型專性降解菌疊加形成復(fù)合菌群的方式，如專利cn106085926a(快速解除丙酸積累的復(fù)合菌及其制備方法和應(yīng)用)、專利cn104862259a(高有機(jī)負(fù)荷中溫沼氣發(fā)酵復(fù)合菌劑、其制備方法和用途)。但均存在一定的缺陷，如通過調(diào)控體系環(huán)境生態(tài)因子進(jìn)而獲得共培養(yǎng)菌群方式中，報(bào)道獲得的共生耗氫菌群主要有同型產(chǎn)乙酸菌、產(chǎn)甲烷菌和硫酸鹽還原菌三大類；其中，同型產(chǎn)乙酸菌比生長速率大，生長周期長；產(chǎn)甲烷菌對(duì)環(huán)境條件較為嚴(yán)格，代謝緩慢；硫酸鹽還原菌生長過程中存在碳源競爭，且產(chǎn)生h2s抑制厭氧過程，產(chǎn)生臭味；同時(shí)，均存在富集效率低，后續(xù)應(yīng)用效果差，實(shí)施效果不高。在將多種類型專性降解菌疊加形成復(fù)合菌群的方式中，目前已鑒定得到的中溫丙酸氧化菌主要來源于δ-變形菌門綱(delta-proteobacteria)和梭狀桿菌綱(clostridia)，包含4個(gè)屬6個(gè)種，分布稀少，培養(yǎng)周期長，不易富集，菌株獲取困難，商業(yè)價(jià)格高昂，且代謝類型和生境條件各異，簡單地將全部菌群疊加在一起，未考慮代謝類型和生境條件差異，菌體在實(shí)施過程中易流失，效果大打折扣。

促進(jìn)不同類型和營養(yǎng)型菌群融合，優(yōu)化共生菌群結(jié)構(gòu)及其代謝通路，強(qiáng)化生物鏈?zhǔn)絽f(xié)同代謝實(shí)現(xiàn)丙酸的優(yōu)先降解與快速轉(zhuǎn)化，解決中間產(chǎn)物代謝和轉(zhuǎn)化的不平衡的問題，為產(chǎn)甲烷過程提供優(yōu)質(zhì)底物，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)甲烷過程高效穩(wěn)定持續(xù)運(yùn)行是當(dāng)前解決這一問題的最新途徑，但目前尚未見之于報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種厭氧條件下富集培養(yǎng)丙酸氧化菌及其互營共生菌群的方法。在抑制產(chǎn)甲烷代謝下，通過酸化、投加硝酸鹽并控制基質(zhì)中cod/no3^--n值連續(xù)培養(yǎng)，丙酸氧化菌及其互營共生菌群數(shù)量增殖2個(gè)數(shù)量級(jí)以上，富集以互營桿菌屬(syntrophobacter)和史密斯氏菌屬(smithella)為主要丙酸氧化菌，以氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌群和反硝化菌群為主要互營共生菌群，伴隨以丙酸和氫為物質(zhì)基礎(chǔ)的代謝菌群結(jié)構(gòu)的優(yōu)勢菌群。以實(shí)現(xiàn)優(yōu)化共生菌群結(jié)構(gòu)及其代謝通路，強(qiáng)化生物鏈?zhǔn)絽f(xié)同代謝實(shí)現(xiàn)丙酸的優(yōu)先降解與快速轉(zhuǎn)化，解決中間產(chǎn)物丙酸代謝和轉(zhuǎn)化的不平衡的問題。

本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。

一種厭氧條件下富集培養(yǎng)丙酸氧化菌及其互營共生菌群的方法，包括如下步驟：

(1)在密閉的連續(xù)攪拌槽式反應(yīng)器(cstr)中接種厭氧的絮狀或顆粒狀污泥，加入甲烷代謝抑制劑培養(yǎng)后，進(jìn)行酸化，得到酸化的基質(zhì)；

(2)在酸化的基質(zhì)中，以丙酸鹽為碳源、硝酸鹽為氮源，控制基質(zhì)體系的cod/no3^--n值進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，得到富集的丙酸氧化菌及其互營共生菌群。

進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述密閉的連續(xù)攪拌槽式反應(yīng)器使用前用氬氣驅(qū)趕掉溶解氧，并投加鐵粉、l-半胱氨酸和刃天青指示劑用于降低和指示體系內(nèi)氧化還原電位值，控制體系中氧化還原電位在-350～-200mv。

進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述厭氧的絮狀或顆粒狀污泥為沉淀池、消化池或廢水厭氧反應(yīng)器中的絮狀或顆粒狀污泥，且接種前用篩網(wǎng)篩去包括紙屑、塑料片以及小石塊在內(nèi)的雜質(zhì)。

進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述厭氧的絮狀或顆粒狀污泥接種的投加濃度控制在1～5gvss/l。

進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述產(chǎn)甲烷代謝抑制劑為2-溴乙烷磺酸(bes)。

進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述產(chǎn)甲烷代謝抑制劑為一次性加入，相對(duì)污泥的最終使用濃度為5～10mmol/l。

進(jìn)一步地，步驟(1)中，加入產(chǎn)甲烷代謝抑制劑培養(yǎng)的時(shí)間由體系產(chǎn)甲烷速率大小決定，優(yōu)選為4～12小時(shí)。

進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述酸化采用加入丙酸鹽和稀硝酸的混合液進(jìn)行酸化。

更進(jìn)一步地，所述丙酸鹽和稀硝酸的混合液中，丙酸鹽和稀硝酸的質(zhì)量比為10～15:1。

進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述酸化過程中，控制體系的ph值在6.0～6.5之間，酸化的時(shí)間為12-24小時(shí)。

進(jìn)一步地，步驟(2)中，所述硝酸鹽包括硝酸鈉、硝酸鉀和硝酸銨中的一種以上。

進(jìn)一步地，步驟(2)中，所述硝酸鹽由少至多分2～3次連續(xù)投加，直至達(dá)到基質(zhì)體系的預(yù)定cod/no3^--n值。

進(jìn)一步地，步驟(2)中，控制基質(zhì)體系中的cod值在2500～4000mg/l。

進(jìn)一步地，步驟(2)中，控制基質(zhì)體系中的cod/no3^--n值在5～200之間。

進(jìn)一步地，步驟(2)中，所述連續(xù)培養(yǎng)的溫度控制在35～40℃中溫范圍內(nèi)。

進(jìn)一步地，步驟(2)中，所述連續(xù)培養(yǎng)的ph值控制在6.5～7.2范圍內(nèi)。

進(jìn)一步地，步驟(2)中，所述連續(xù)培養(yǎng)過程中的攪拌速率在10～30r/min之間。

進(jìn)一步地，步驟(2)中，所述連續(xù)培養(yǎng)的時(shí)間為7～30天。

進(jìn)一步地，培養(yǎng)得到富集的丙酸氧化菌及其互營共生菌群，是以互營桿菌屬和史密斯氏菌屬為主要丙酸氧化菌，以氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌群和反硝化菌群為主要的互營共生菌群，同時(shí)伴隨以丙酸和氫為物質(zhì)基礎(chǔ)的代謝菌群結(jié)構(gòu)的優(yōu)勢菌群。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

(1)本發(fā)明的富集培養(yǎng)方法操作簡便、富集效率高，對(duì)外界環(huán)境條件無特殊要求，參數(shù)控制少，條件易控，經(jīng)濟(jì)可行，實(shí)施過程方便，后續(xù)可用于厭氧生物降解過程過度酸化等異常狀況的緩解和修復(fù)，具有顯著實(shí)用價(jià)值；

(2)本發(fā)明的富集培養(yǎng)方法將反硝化代謝過程部分引入傳統(tǒng)厭氧生物處理過程中，形成大量以丙酸和氫為物質(zhì)來源的優(yōu)勢菌群，培養(yǎng)得到的共生菌群對(duì)丙酸降解速率快，降解速率高，在短時(shí)期內(nèi)可實(shí)現(xiàn)丙酸的高效降解，培養(yǎng)過程可重復(fù)性強(qiáng)；

(3)本發(fā)明的富集培養(yǎng)方法操作簡便，為混菌條件下培養(yǎng)具有共同特質(zhì)的微生物優(yōu)勢菌群提供了參考和指導(dǎo)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明具體實(shí)施方式中富集培養(yǎng)丙酸氧化菌及其互營共生菌群的具體流程示意圖；

圖2為實(shí)施例1中富集培養(yǎng)后菌群用于丙酸降解效果的研究結(jié)果示意圖；

圖3為實(shí)施例2中富集培養(yǎng)后菌群用于丙酸降解效果的研究結(jié)果示意圖。

具體實(shí)施方式

為了便于理解本發(fā)明內(nèi)容，下面將參照相關(guān)附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，闡明本發(fā)明的突出特點(diǎn)和顯著進(jìn)步，僅在于說明本發(fā)明而絕不局限于以下所描述的實(shí)施例。

本發(fā)明具體實(shí)施方式中富集培養(yǎng)丙酸氧化菌及其互營共生菌群的具體流程示意圖如圖1所示，包括步驟：在密閉的連續(xù)攪拌槽式反應(yīng)器中接種污泥，加入產(chǎn)甲烷抑制劑進(jìn)行甲烷代謝的抑制，酸化以及加入碳、氮源控制基質(zhì)碳氮比進(jìn)行連續(xù)富集培養(yǎng)，得到丙酸氧化菌及其互營共生菌群。

本發(fā)明具體實(shí)施方式中的高通量測序條件如下：

高通量測序在miseq測序平臺(tái)(illumina,usa)上完成，實(shí)驗(yàn)過程中選用引物對(duì)515f(5’-gtgccagcmgccgcggtaa-3’)和806r(5’-ggactachvgggtwtctaat-3’)對(duì)16srdna基因v4可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，不同樣品連接特異性接頭用于區(qū)分。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)在geneamp9700儀器(appliedbiosystems,usa)上進(jìn)行，擴(kuò)增體系為50μl，其中包含0.4μm正反引物、1μl模板dna、250nm核苷酸和1×fastpfubuffer的混合物。擴(kuò)增條件如下：95℃預(yù)變性3min，95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；25個(gè)周期循環(huán)后，在72℃延伸5min。擴(kuò)增后產(chǎn)物用axyprep^tmdnagelextractionkit(axygen,usa)試劑盒純化并定量。

測序數(shù)據(jù)下機(jī)后，去除數(shù)據(jù)中末端的接頭序列和引物序列，然后根據(jù)標(biāo)簽序列將數(shù)據(jù)拆分為不同樣本數(shù)據(jù)，然后將拆分后所獲得的數(shù)據(jù)利用flash(version1.2.7)軟件(http://ccb.jhu.edu/software/flash/)對(duì)每個(gè)污泥樣數(shù)據(jù)進(jìn)行重組裝拼接，拼接后所得到序列即為原始數(shù)據(jù)，將拼接后數(shù)據(jù)(tags)從連續(xù)低質(zhì)量值(默認(rèn)設(shè)定<＝10)堿基數(shù)達(dá)到設(shè)定長度(默認(rèn)是5)的第1個(gè)低質(zhì)量堿基位點(diǎn)截?cái)?，過濾去除截取后得到的tags集合中長度小于平均長度的70％的數(shù)據(jù)，將以上過濾得到的序列與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，去除其中的嵌合體序列，得到最終有效序列(effectivetags)用于后續(xù)分析。提取序列間相似率大于97％的非重復(fù)序列，借助mothur軟件(http://www.mothur.org/wiki/main_page)分析并生成分類操作單元(otu)；基于otus類型和數(shù)量等信息，采用rdp分類法將otu序列與silva數(shù)據(jù)庫(http://www.arb-silva.de)進(jìn)行比對(duì)，找出最相近且可信度達(dá)80％以上的種屬信息。為了獲得每個(gè)otu系統(tǒng)發(fā)育分類學(xué)信息，將相似水平97％上每個(gè)otu中的所有序列進(jìn)行一致性歸類分析，將同一個(gè)otu中的不同序列的最近祖先的種屬信息作為此otu的系統(tǒng)發(fā)育種屬信息。

實(shí)施例1

利用丙酸鈉在絮狀污泥中選擇性培養(yǎng)丙酸氧化菌及其互營共生菌群，步驟如下：

(1)在密閉的cstr反應(yīng)器(有效容積為5l)中接種消化池底絮狀污泥，濃度為4gvss/l，加入bes溶液(bes相對(duì)污泥的使用濃度為5mmol/l)并攪拌混合均勻，培育4小時(shí)，加入50ml丙酸鈉和稀硝酸混合液(質(zhì)量比為10:1，稀硝酸濃度為10wt％)，控制體系ph值為6.5，酸化培育12小時(shí)；而后以丙酸鈉為碳源，cod為2500mg/l，以硝酸鉀為氮源，由零開始，逐步提升基質(zhì)中碳硝比(cod/no3^--n)并最終控制在121.47，在ph為6.8、溫度35℃、20r/min攪拌條件下連續(xù)培養(yǎng)富集14天。

(2)富集培養(yǎng)過程結(jié)束后，收集接種污泥和富集培養(yǎng)后污泥(5.0g濕重)，抽提基因組總dna并借助高通量測序技術(shù)對(duì)其16srdna片段測序，拼裝后以有效序列數(shù)據(jù)(effectivetags)表示其對(duì)應(yīng)菌群中(otus)菌體個(gè)數(shù)。

表1為連續(xù)培養(yǎng)過程中，丙酸氧化菌群類型及其序列數(shù)量和比例。

表1丙酸氧化菌群類型及其序列數(shù)量和比例

由表1可知，通過本發(fā)明方法的富集培養(yǎng)，絮狀污泥中的丙酸氧化菌及其互營共生菌群以syntrophobacter和smithella為主，其數(shù)量(以序列數(shù)量計(jì))在富集培養(yǎng)7天時(shí)，數(shù)量增加1.75倍，占全部菌群比例由接種時(shí)0.44％上升至1.21％，并隨培養(yǎng)時(shí)間繼續(xù)，其數(shù)量和菌群比例不斷上升，在富集培養(yǎng)14天時(shí)，菌群比例上升至2.4％，比初始接種污泥中增加4.5倍，實(shí)現(xiàn)了菌群培養(yǎng)富集。

富集培養(yǎng)后菌群用于丙酸降解效果的研究：

借助序批實(shí)驗(yàn)開展富集培養(yǎng)前后絮狀污泥丙酸降解效果研究，其中，體系中有20g濕重絮狀污泥，150ml100mg/l丙酸溶液和1.0ml微量元素使用液，投加碳酸氫鈉控制體系ph為7.0，在35℃恒溫水浴槽中連續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)，間隔不等時(shí)間取樣測定體系中丙酸含量；研究結(jié)果如圖2所示，由圖2可知，富集培養(yǎng)后絮狀污泥體系中丙酸降解速率明顯高于富集培養(yǎng)前，其體系總丙酸降解速率最大時(shí)為45.8mg/l·h，富集培養(yǎng)后體系中在8小時(shí)處，體系中殘留有約3.6mg/l丙酸，在12小時(shí)處，體系中丙酸被完全降解，而富集培養(yǎng)前體系中在12小時(shí)處，仍殘留有10.3mg/l丙酸。

實(shí)施例2

利用丙酸鈉在顆粒污泥中選擇性培養(yǎng)丙酸氧化菌及其互營共生菌群，步驟如下：

(1)在密閉的cstr反應(yīng)器(有效容積為5l)中接種成熟厭氧顆粒污泥，濃度為5gvss/l，加入bes溶液(相對(duì)污泥的使用濃度為10mmol/l)并攪拌混合均勻，培育8小時(shí)后，加入100ml丙酸鈉和稀硝酸混合液(質(zhì)量比為15:1，稀硝酸濃度為10wt％)，控制體系ph值為6.0，酸化培育18小時(shí)；而后以丙酸鈉為碳源，cod為4000mg/l，以硝酸鈉為氮源，由零開始，逐步提升基質(zhì)碳硝比(cod/no3^--n)值并最終控制在15.18，在ph為6.8、溫度37℃、25r/min條件下連續(xù)培養(yǎng)富集15天。

(2)富集培養(yǎng)過程結(jié)束后，收集接種污泥和富集培養(yǎng)后污泥(5.0g濕重)，抽提基因組總dna并借助高通量測序技術(shù)對(duì)其16srdna片段測序，拼裝后以有效序列數(shù)據(jù)(effectivetags)表示其對(duì)應(yīng)菌群中(otus)菌體個(gè)數(shù)。

表2為連續(xù)培養(yǎng)過程中，丙酸氧化菌群類型及其序列數(shù)量和比例。

表2丙酸氧化菌群類型及其序列數(shù)量和比例

由表2可知，通過本發(fā)明方法的富集培養(yǎng)，顆粒污泥中的丙酸氧化菌及其互營共生菌群以syntrophobacter和smithella為主，其數(shù)量(以序列數(shù)量計(jì))在富集培養(yǎng)7天時(shí)，數(shù)量增加了0.31倍，占全部菌群比例由接種時(shí)1.02％上升至1.34％，并隨培養(yǎng)時(shí)間繼續(xù)，其數(shù)量和菌群比例不斷上升，在富集培養(yǎng)14天時(shí)，菌群比例上升至2.51％，比初始接種污泥中增加1.29倍，實(shí)現(xiàn)了菌群培養(yǎng)富集。

富集培養(yǎng)后菌群用于丙酸降解效果的研究：

借助序批實(shí)驗(yàn)開展富集培養(yǎng)前后顆粒污泥丙酸降解效果的研究，其中體系中有20g濕重顆粒污泥，150ml300mg/l丙酸溶液和1.0ml微量元素使用液，投加碳酸氫鈉控制體系ph為7.0，在35℃恒溫水浴槽中連續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)，間隔不等時(shí)間取樣測定體系中丙酸含量；由圖3可知，富集培養(yǎng)后顆粒污泥體系中丙酸降解速率明顯高于富集培養(yǎng)前，其體系總丙酸降解速率最大時(shí)為145.4mg/l·h，富集培養(yǎng)后體系中在8小時(shí)處，體系中殘留有約4.3mg/l丙酸，在12小時(shí)處，體系中丙酸為1.1mg/l，而富集培養(yǎng)前體系中在12小時(shí)處，仍殘留有15.2mg/l丙酸。

實(shí)施例3

不同基質(zhì)cod/no3^--n值對(duì)培養(yǎng)富集丙酸氧化菌及其互營共生菌群的影響

與實(shí)施例2中相同，不同在于：以丙酸鈉為碳源，cod為4000mg/l，硝酸鈉投加濃度分別為32.94mg/l、100.01mg/l、263.53mg/l、500.05mg/l和800.01mg/l(cod/no3^--n值為121.47、40.00、15.18、8.00和5.00)條件下連續(xù)培養(yǎng)15天。高通量測試分析對(duì)應(yīng)條件下丙酸氧化菌數(shù)量和比例，不同基質(zhì)cod/no3^--n值條件下丙酸氧化菌群類型及其序列數(shù)量和比例如表3所示。

表3丙酸氧化菌群類型及其序列數(shù)量和比例

由表3可知，通過本發(fā)明方法的富集培養(yǎng)，不同基質(zhì)碳氮比(cod/no3^--n)條件下顆粒污泥中的丙酸氧化菌及其互營共生菌群均以syntrophobacter和smithella為主，菌群序列數(shù)量和比例與基質(zhì)碳氮比(cod/no3^--n)密切相關(guān)，不同基質(zhì)碳氮比(cod/no3^--n)條件下連續(xù)富集培養(yǎng)后，其中丙酸氧化菌及其互營共生菌群序列數(shù)量和比例均有所上升，在碳氮比為121.47時(shí)，連續(xù)培養(yǎng)后體系中菌群比例由初始時(shí)1.02％上升至1.82％；隨著基質(zhì)中碳氮比的提升，菌群比例也逐漸上升，在碳氮比為8.00基質(zhì)中，連續(xù)培養(yǎng)富集后菌群比例為6.21％；在碳氮比條件5.00基質(zhì)中，其菌群比例為5.96％，較碳氮比為8.00時(shí)略有下降，其富集效果依舊明顯。