本發(fā)明涉及抗腫瘤藥物
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及環(huán)磷酸腺苷硼酸絡(luò)合物及其制備方法，以及抗腫瘤藥物和中子俘獲治療的硼劑。
背景技術(shù)：
：隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，輻射殺滅腫瘤的技術(shù)也從無選擇性的x，γ輻射(普通的醫(yī)用加速器)到具有一定縱向能量選擇(博拉格峰)的質(zhì)子、重離子輻射治療。尤其利用10b分子俘獲超熱低能中子(1ev～10kev)在腫瘤細(xì)胞中產(chǎn)生核反應(yīng)(～3mev)具有更高量級選擇性殺滅腫瘤的硼中子俘獲療法(bnct)，更是近來世界上研究的熱點。bnct是把與腫瘤有特異性親和力的硼(10b)化合物攜帶劑注入人體,選擇性富集于腫瘤細(xì)胞,然后用超熱低能中子局部照射,使具有超大中子俘獲截面的10b俘獲中子形成局部核反應(yīng)殺死腫瘤細(xì)胞。如果10b化合物能特異性完全富集于腫瘤細(xì)胞中，則bnct殺滅腫瘤的選擇性將是其他輻射治療的百倍以上。然而目前經(jīng)美國食品及藥物管理局(fda)認(rèn)證的第2代硼劑低分子硼化合物十一氫巰基十二硼化二鈉(bsh)和對二羥苯基丙氨酸硼(bpa)盡管與第1代硼劑相比性能有了較大改進(jìn)，其能在腫瘤細(xì)胞中滯留較長的時間，對腫瘤細(xì)胞有一定的選擇性親和力，腫瘤與正常組織中的硼濃度比值(t/n)，以及腫瘤與血液中硼濃度比值(t/b)均能達(dá)到＞1。但仍不能滿足bnct的基本要求，即t/n或t/b≥3，因此目前bnct治療腦腫瘤的效果并不十分理想。篩選和合成能特異性富集于腫瘤細(xì)胞的10b化合物已經(jīng)成為這一技術(shù)推廣的重要瓶頸。近年來，第3代硼攜帶劑的研究也在快速發(fā)展，主要特點是能通過和腫瘤特異性表達(dá)的抗原或受體結(jié)合，使硼劑被腫瘤細(xì)胞靶向攝取，從而達(dá)到較高的t/n或t/b值。其中研究較為廣泛的有表皮生長因子受體(egfr)介導(dǎo)的能和表皮生長因子(egf)結(jié)合的bpa,葉酸受體(fr)介導(dǎo)的和葉酸能結(jié)合包含硼劑的脂質(zhì)體和碳納米顆粒,以及具有較高的親水性,能被膠質(zhì)瘤細(xì)胞t98g選擇性攝取，并具有更高親和力的結(jié)合了卟啉的硼酸鹽。目前，利用這些腫瘤選擇性吸收的硼劑，bnct在腦膠質(zhì)瘤中取得了一定的療效,通過fr介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞,能把含硼藥物運送到細(xì)胞內(nèi)，以及fr靶向的含硼碳納米顆粒能夠被高表達(dá)fr的hela細(xì)胞靶向攝取等相關(guān)研究也有報道?？傊?，現(xiàn)有的利用硼劑(10b)運用bnct進(jìn)行輻射殺滅腫瘤，雖然能一定程度上提高10b在腫瘤細(xì)胞的濃度，但僅僅是提高其bnct中能選擇性吸收中子能量來殺滅腫瘤單方面效應(yīng)，腫瘤細(xì)胞殺滅效率低，選擇性差。上述內(nèi)容僅用于輔助理解本發(fā)明的技術(shù)方案，并不代表承認(rèn)上述內(nèi)容是現(xiàn)有技術(shù)。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的主要目的在于提供一種環(huán)磷酸腺苷硼酸絡(luò)合物和制備方法，以及抗腫瘤藥物和bnct的硼劑，旨在解決現(xiàn)有的針對目前bnct中的硼劑大部分僅僅具有單一的功能，僅僅是提高其bnct中能選擇性吸收中子能量來殺滅腫瘤單方面效應(yīng)，腫瘤細(xì)胞殺滅效率低，選擇性差問題。為解決上述問題，本發(fā)明提供一種環(huán)磷酸腺苷硼酸絡(luò)合物，其特征在于，包括：優(yōu)選地，所述環(huán)磷酸腺苷硼酸絡(luò)合物的絡(luò)合形式如下：此外，為解決上述問題，本發(fā)明還提供一種環(huán)磷酸腺苷硼酸絡(luò)合物的制備方法，包括：將的溶液和包含h3bo3的溶液按照預(yù)設(shè)比例混合得到環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物。優(yōu)選地，所述和所述h3bo3的預(yù)設(shè)比例為1：32。優(yōu)選地，所述和所述h3bo3的混合時間為24小時。優(yōu)選地，所述將和h3bo3混合，即得之后，還包括：利用液相色譜質(zhì)譜分析儀，在260nm的檢測波長下，流動相為a相0.1％甲酸水溶液和b相100％甲醇，運用c18色譜柱在預(yù)設(shè)梯度洗脫比例下進(jìn)行梯度洗脫。優(yōu)選地，所述預(yù)設(shè)梯度洗脫比例為：0min-2minb相0％，2min-16minb相0％-30％，16min-20minb相30％-90％，20min-25minb相90％，25min-25.1minb相90％-0％，25.1min-30minb相0％。進(jìn)一步的，為解決上述問題，本發(fā)明還提供一種抗腫瘤藥物，包括表皮生長因子受體抑制劑；所述表皮生長因子受體抑制劑包括權(quán)利要求1或2所述的環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物。進(jìn)一步的，為解決上述問題，本發(fā)明還提供一種中子俘獲治療的硼劑，所述硼劑包括含硼皮生長因子受體抑制劑；所述含硼皮生長因子受體抑制劑包括權(quán)利要求1或2所述的環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物。優(yōu)選地，所述硼劑還包括含硼核苷類表皮生長因子受體抑制劑；所述含硼核苷類表皮生長因子受體抑制劑包括權(quán)利要求1或2所述的環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物。本發(fā)明提供一種環(huán)磷酸腺苷硼酸絡(luò)合物和制備方法，以及抗腫瘤藥物和中子俘獲治療的硼劑，所述環(huán)磷酸腺苷硼酸絡(luò)合物，作為含硼化合物、含硼的表皮生長因子受體抑制劑，以及含硼核苷表皮生長因子受體抑制劑，綜合利用腫瘤細(xì)胞吸收硼劑，以及腫瘤細(xì)胞繁殖需要大量核苷的特性，使藥物富集于腫瘤細(xì)胞并通過輻射殺死腫瘤細(xì)胞，提高了藥物的選擇性，進(jìn)而極大提高了腫瘤細(xì)胞的殺滅效率，避免了現(xiàn)有的針對目前中子俘獲治療中的硼劑大部分僅僅具有單一的功能，僅僅是提高其中子俘獲治療中能選擇性吸收中子能量來殺滅腫瘤單方面效應(yīng)，腫瘤細(xì)胞殺滅效率低，選擇性差問題。本發(fā)明目的的實現(xiàn)、功能特點及優(yōu)點將結(jié)合實施例，參照附圖做進(jìn)一步說明。附圖說明應(yīng)當(dāng)理解的是，以下附圖僅示出了本發(fā)明的某些實施例，因此不應(yīng)被看作是對范圍的限定，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他相關(guān)的附圖。圖1為本發(fā)明環(huán)磷酸腺苷硼酸絡(luò)合物和制備方法，以及一種抗腫瘤藥物和bnct的硼劑的0.06mmcamp及含不同濃度h3bo3在0.06mmcamp中的lc-ms色譜圖；圖2為本發(fā)明環(huán)磷酸腺苷硼酸絡(luò)合物和制備方法，以及一種抗腫瘤藥物和bnct的硼劑的環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物抑制egfr的自磷酸化32p-atp放射自顯影圖；圖3為本發(fā)明環(huán)磷酸腺苷硼酸絡(luò)合物和制備方法，以及一種抗腫瘤藥物和bnct的硼劑的裸鼠腫瘤組織切片的tunel檢測圖。具體實施方式下面根據(jù)具體實施例就本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。本發(fā)明提供一種環(huán)磷酸腺苷硼酸絡(luò)合物，其特征在于，包括：本發(fā)明提供的環(huán)磷酸腺苷硼酸絡(luò)合物中，包含有h3bo3和等化合物。其中，是一種camp(cyclicadenosinemonophosphate)“腺苷-3',5'-環(huán)化一磷酸”的簡稱。亦稱“環(huán)磷酸腺苷”“環(huán)化腺核苷一磷酸”，“環(huán)腺一磷”。以微量存在于動植物細(xì)胞和微生物中。體內(nèi)多種激素作用于細(xì)胞時，可促使細(xì)胞生成此物，轉(zhuǎn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理活動與物質(zhì)代謝。作為一種環(huán)狀的核苷酸類化合物，camp的細(xì)胞毒性和抗藥性較小。上述，h3bo3為硼酸，亦稱為pt，白色粉末狀結(jié)晶或三斜軸面的鱗片狀帶光澤結(jié)晶。水中呈弱酸性。有滑膩手感，無臭味。溶于水、酒精、甘油、醚類及香精油中。無氣味。味微酸苦后帶甜。與皮膚接觸有滑膩感。露置空氣中無變化。能隨水蒸氣揮發(fā)。0.1mol/l水溶液ph為5.1。1g能溶于18ml冷水、4ml沸水、18ml冷乙醇、6ml沸乙醇和4ml甘油。在水中溶解度能隨鹽酸、檸檬酸和酒石酸的加入而增加。相對密度1.4347。熔點184℃(分解)。沸點300℃。上述，是camp與h3bo3的合成產(chǎn)物，在水中以絡(luò)合鹽的形式存在，為一種含硼的egfr抑制劑，也是一種含硼核苷類egfr抑制劑。本發(fā)明中，所使用的camp為南京澳多福尼生物科技有限公司、純度>98％的camp，所使用的h3bo3為生工生物科技有限公司、純度>98％的h3bo3。本發(fā)明提供一種環(huán)磷酸腺苷硼酸絡(luò)合物和制備方法，以及抗腫瘤藥物和bnct的硼劑，所述環(huán)磷酸腺苷硼酸絡(luò)合物，作為含硼化合物、含硼的egfr抑制劑，以及含硼核苷類egfr抑制劑，綜合利用腫瘤細(xì)胞吸收硼劑，以及腫瘤細(xì)胞繁殖需要大量核苷的特性，使藥物富集于腫瘤細(xì)胞并通過輻射殺死腫瘤細(xì)胞，提高了藥物的選擇性，進(jìn)而極大提高了腫瘤細(xì)胞的殺滅效率，避免了現(xiàn)有的針對目前bnct中的硼劑大部分僅僅具有單一的功能，僅僅是提高其bnct中能選擇性吸收中子能量來殺滅腫瘤單方面效應(yīng)，腫瘤細(xì)胞殺滅效率低，選擇性差問題。優(yōu)選地，所述環(huán)磷酸腺苷硼酸絡(luò)合物的絡(luò)合形式如下：camp，即為腺苷-3',5'-環(huán)化一磷酸，其結(jié)構(gòu)式為camp與h3bo3在水溶液中形成環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物。需要理解的是，絡(luò)合物是由一定數(shù)量的配體(陰離子或分子)通過配位鍵結(jié)合于中心離子(或中性原子)周圍而形成的跟原來組分性質(zhì)不同的分子或離子。需要理解的是，分子或者離子與金屬離子結(jié)合，形成很穩(wěn)定的新的離子的過程就叫絡(luò)合反應(yīng)，生成的物質(zhì)叫絡(luò)合物。絡(luò)合物通常指含有絡(luò)離子的化合物，例如絡(luò)鹽ag(nh3)2cl、絡(luò)酸h2ptcl6、絡(luò)堿cu(nh3)4(oh)2等；也指不帶電荷的絡(luò)合分子，例如fe(scn)3、co(nh3)3cl3等。配合物又稱絡(luò)合物。本發(fā)明中，在水溶液中的camp和h3bo3發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)最終達(dá)到平衡狀態(tài)，形成絡(luò)合鹽，進(jìn)而成為溶液中包含有camp、h3bo3和的絡(luò)合物。上述，進(jìn)行絡(luò)合反應(yīng)的溶劑為水溶液，水作為載體使水溶性的camp和h3bo3進(jìn)行反應(yīng)。此外，也可使用其他溶劑進(jìn)行本發(fā)明中的絡(luò)合反應(yīng)，例如甲醇、甲酸水溶液等。本發(fā)明中采用的藥物反應(yīng)載體為水。本發(fā)明還提供一種環(huán)磷酸腺苷硼酸絡(luò)合物的制備方法，包括：將包含的溶液和包含h3bo3的溶液按照預(yù)設(shè)比例混合得到環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物。在本發(fā)明中，將camp與h3bo3進(jìn)行混合后，經(jīng)過絡(luò)合反應(yīng)，形成絡(luò)合物。具體的，當(dāng)h3bo3可以與具有多羥基的化合物進(jìn)行反應(yīng)并形成具有高絡(luò)合常數(shù)的絡(luò)合形式。camp上的環(huán)戊糖只有一個同側(cè)羥基，不能在此處進(jìn)行絡(luò)合，但camp的堿基中的氨基具有堿性性質(zhì)，對硼酸中氫離子進(jìn)行吸附從而形成絡(luò)合反應(yīng)并成為絡(luò)合鹽的形式。優(yōu)選地，所述和所述h3bo3的預(yù)設(shè)比例為1:32。上述，camp與h3bo3預(yù)設(shè)比例可以為1:1～1:300，在本發(fā)明中，優(yōu)選比例為1:32，摩爾濃度的優(yōu)選比例為0.06mm：1.92mm。優(yōu)選地，所述和所述h3bo3的混合時間為24小時。優(yōu)選地，所述將包含的溶液和包含h3bo3的溶液按照預(yù)設(shè)比例混合得到環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物之后，還包括：利用液相色譜質(zhì)譜分析儀，在260nm的檢測波長下，流動相為a相0.1％甲酸水溶液和b相100％甲醇，運用c18色譜柱在預(yù)設(shè)梯度洗脫比例下進(jìn)行梯度洗脫。優(yōu)選地，所述預(yù)設(shè)梯度洗脫比例為：0min-2minb相0％，2min-16minb相0％-30％，16min-20minb相30％-90％，20min-25minb相90％，25min-25.1minb相90％-0％，25.1min-30minb相0％。將一定比例的camp與h3bo3進(jìn)行混合后，進(jìn)行絡(luò)合反應(yīng)，在經(jīng)過預(yù)設(shè)的反應(yīng)時間后，通過lc-ms(液相色譜質(zhì)譜分析儀)對絡(luò)合物的絡(luò)合情況進(jìn)行檢測。實驗儀器和材料：lc-ms：安捷倫6120lc/ms系統(tǒng)(三重四極桿質(zhì)譜儀)(安捷倫、ca、美國)；數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)：安捷倫masshunter軟件walkuplc/ms和lc系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集；色譜柱：c18色譜柱，250mm×4.6mm(廣州綠百草生物科技有限公司，中國)；有機(jī)溶劑：甲酸(lc/ms級)、甲醇(lc/ms級)；水：超純水，通過milli-q自制；實驗條件：室溫，檢測波長：260nm；流動相：a相為0.1％甲酸水溶液；b相為100％甲醇；實驗方法：制備不同濃度的樣品，分別為：0.06mmcamp、0.06mmcamp+0.48mmh3bo3、0.06mmcamp+0.96mmh3bo3、0.06mmcamp+1.92mmh3bo3；將以上樣品利用lc-ms按表1中梯度洗脫時間和比例進(jìn)行洗脫。表1利用lc-ms對磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物絡(luò)合物進(jìn)行梯度洗脫的時間及比例檢測結(jié)果見圖1，圖1為0.06mmcamp及含不同濃度h3bo3在0.06mmcamp中的lc-ms色譜圖。由圖1中可見，隨著硼酸濃度的逐漸增加，主峰(保留時間9.9-10.1min)峰面積相應(yīng)地發(fā)生逐漸減小的變化。此外環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物包含有更多的羥基且更容易通過甲醇洗脫出來，則導(dǎo)致環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物在lc-ms中具有較小的保留時間。另外，環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物在由camp和h3bo3進(jìn)行絡(luò)合后，極性變大，從而導(dǎo)致樣品在260nm下的吸收變小的情況，由于camp堿基中的氨基具有堿性，能對硼酸中氫離子進(jìn)行吸附從而形成絡(luò)合鹽的形式。導(dǎo)致硼酸的濃度對具有紫外吸收部分的堿基有影響。綜合以上信息，判斷經(jīng)過絡(luò)合反應(yīng)的絡(luò)合物的已經(jīng)形成。此外，也可通過毛細(xì)管電泳分離法進(jìn)行對環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物的絡(luò)合情況進(jìn)行驗證，camp在h3bo3中，毛細(xì)管電泳的遷移率也隨硼酸濃度而變化,可以判斷camp和h3bo3經(jīng)過絡(luò)合反應(yīng)后形成了絡(luò)合物的形式。本發(fā)明還提供一種抗腫瘤藥物，包括表皮生長因子受體抑制劑；所述表皮生長因子受體抑制劑包括權(quán)利要求1或2所述的環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物。表皮生長因子是一種小肽，由53個氨基酸殘基組成，是類egf大家族的一個成員，是一種多功能的生長因子，在體內(nèi)體外都對多種組織細(xì)胞有強烈的促分裂作用。表皮生長因子受體，也稱為egfr(epithelialgrowthfactorreceptor)，本身具有酪氨酸激酶活性，一旦與表皮生長因子(egf)組合可啟動細(xì)胞核內(nèi)的有關(guān)基因，從而促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖。胃癌、乳腺癌、膀胱癌和頭頸部鱗癌的egfr表達(dá)增高。本發(fā)明中所提供的環(huán)磷酸腺苷硼酸絡(luò)合物，包括以絡(luò)合鹽的形式存在。而環(huán)磷酸腺苷硼酸絡(luò)合物物中的camp和屬于表皮生長因子受體抑制劑(egfr抑制劑)，在中子獲取療法中，可具有對腫瘤細(xì)胞的抑制作用，可以抑制egfr修復(fù)輻射誘導(dǎo)的dna損傷。本發(fā)明還提供一種中子俘獲治療的硼劑，所述硼劑包括含硼表皮生長因子受體抑制劑；所述含硼表皮生長因子受體抑制劑包括權(quán)利要求1或2所述的環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物。bnct為中子治療即硼中子俘獲治療(boronneutroncapturetherapy，簡稱bnct)。硼中子俘獲治療通過在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的原子核反應(yīng)來摧毀癌細(xì)胞。它的原理是這樣的：先給病人注射一種含硼的特殊化合物，這種化合物與癌細(xì)胞有很強的親和力，進(jìn)入人體后，迅速聚集于癌細(xì)胞內(nèi)，而其他組織內(nèi)分布很少。一般地，這種含硼化合物對人體無毒無害，本身韓鵬化合物對癌癥也無治療作用。這時，用一種中子射線進(jìn)行照射，這種射線對人體的損傷不大，但中子與進(jìn)入癌細(xì)胞里的硼能發(fā)生很強的核反應(yīng)，釋放出一種殺傷力極強的射線，這種射線的射程很短，只有一個癌細(xì)胞的長度。所以只殺死癌細(xì)胞，不損傷周圍組織。這種有選擇的只殺死形狀復(fù)雜的癌細(xì)胞而不損傷正常組織的技術(shù)，稱為硼中子俘獲治療技術(shù)。如果10b化合物能特異性完全富集于腫瘤細(xì)胞中，則bnct殺滅腫瘤的選擇性將是其他輻射治療的百倍以上。本發(fā)明所提供的環(huán)磷酸腺苷硼酸絡(luò)合物，包括在水中以絡(luò)合鹽的形式存在。作為為一種含硼egfr抑制劑，可實現(xiàn)直接與跨膜蛋白egfr結(jié)合，在bnct中硼俘獲中子產(chǎn)生的能量將直接破壞重要的細(xì)胞膜通道位點，導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂，繼而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。優(yōu)選地，所述硼劑還包括含硼核苷類表皮生長因子受體抑制劑；所述含硼核苷類表皮生長因子受體抑制劑包括權(quán)利要求1或2所述的環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物。本發(fā)明所提供的環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物，為camp與h3bo3發(fā)生絡(luò)合的產(chǎn)物，其中camp為腺苷-3',5'-環(huán)化一磷酸，亦稱為環(huán)磷酸腺苷，是一種核苷類核苷類表皮生長因子受體抑制劑，通過絡(luò)合反應(yīng)得到環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物，屬于一種含硼核苷類表皮生長因子受體抑制劑。需要理解的是，目前，提高硼劑對腫瘤細(xì)胞的特異性選擇的方法包括一種通過核苷進(jìn)入腫瘤細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞同步繁殖，從而提高對腫瘤細(xì)胞的殺傷力的方法。該方法利用腫瘤細(xì)胞繁殖時需要大量核苷的原理，將10b連接到核苷上，就能使10b更多進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的dna中，由于腫瘤細(xì)胞的繁殖速率遠(yuǎn)大于正常細(xì)胞，這樣硼化合物聚積將在腫瘤細(xì)胞的濃度不僅高于正常細(xì)胞，而且能聚積在腫瘤細(xì)胞核之一關(guān)鍵靶點，這將極大提高對腫瘤細(xì)胞的殺傷力。本發(fā)明提供的環(huán)磷酸腺苷硼酸絡(luò)合物，在溶劑中以絡(luò)合鹽的形式存在。將10b連接至核苷類egfr抑制劑camp上，從而形成了含硼核苷類egfr抑制劑，可使腫瘤細(xì)胞對含硼核苷類egfr抑制劑具有選擇性，當(dāng)腫瘤細(xì)胞將含硼核苷類egfr抑制劑吸收后，形成多基因靶點破壞，從而達(dá)到選擇性輻射誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。綜上，本發(fā)明所提供的環(huán)磷酸腺苷硼酸絡(luò)合物，作為一種egfr抑制劑，本身可以特異性直接降低腫瘤細(xì)胞增殖，增強腫瘤細(xì)胞的輻射敏感性，從而極大加強輻射產(chǎn)生的自由基誘導(dǎo)的凋亡作用；作為一種含硼egfr抑制劑，直接與egfr結(jié)合，在bnct中硼俘獲中子產(chǎn)生的能量直接破壞重要的細(xì)胞膜通道位點，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；作為一種含硼核苷類egfr抑制劑，使腫瘤細(xì)胞對含硼核苷類egfr抑制劑具有選擇性，將含硼核苷類egfr抑制劑吸收進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核中，繼而形成多基因靶點破壞，達(dá)到選擇性輻射誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。綜合以上三點的效應(yīng)，極大的提高硼中子俘獲選擇性殺滅腫瘤的效率，繼而極大的降低輻射劑量。由于大部分腫瘤細(xì)胞膜的egfr遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常細(xì)胞，因此特異性含硼egfr抑制劑將選擇性的富集在腫瘤細(xì)胞膜上，達(dá)到t/n或t/b≥3。并由于其多重誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，因此富集在腫瘤細(xì)胞上的含硼egfr抑制劑可以在較低的濃度達(dá)到理想的效果。通過32p-atp同位素示蹤技術(shù)確定環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物抑制egfr自身磷酸化能力為了確定環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物抑制egfr自身磷酸化能力，本發(fā)明中對通過32p-atp同位素示蹤技術(shù)篩選egfr自磷酸化抑制效果好的核苷類含硼絡(luò)合劑，通過比較，了解和驗證抑制劑的抑制效力情況。實驗儀器和材料：egfr/her1/erbb1(aa668-1210)(重組人表皮生長因子受體/gst嵌合體，由780個氨基酸組成，分子質(zhì)量89.1kda，sino生物公司(pa，美國)；[γ32p]-atp(3000ci/毫摩爾，10mci/ml，perkinelmer公司，ca，美國)；反應(yīng)緩沖液(10倍t4pnk反應(yīng)緩沖液)；camp(生工生物科技有限公司，純度>98％)；環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物，自制；fla7000激光掃描儀(ge，英國)。實驗方法：1、將含2μl0.52mg/ml人類egfr/her1/erbb1反應(yīng)(aa668-1210)重組人表皮生長因子受體/gst嵌合體，由780個氨基酸組成，分子質(zhì)量89.1kda，sino生物公司(pa，美國)(>85％純度))，1μl[γ32p]-atp(3000ci/毫摩爾，10mci/ml，perkinelmer公司，ca，美國)和1.2μl反應(yīng)緩沖液(10倍t4pnk反應(yīng)緩沖液)加或不加不同濃度的camp(2μl，4μl和8μl5μmcamp(生工生物科技有>98％、純度)以及不同濃度環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物(1μl，2μl和3μl5mmh3bo3+2μl5μmcamp)。每個反應(yīng)溶液保持12μl體積(去離子水調(diào)節(jié))。2、在37℃孵育24h后，各反應(yīng)液5μl加入7m尿素變性凝膠電泳(15cm×15cm)使用1xtbe緩沖液與10w功率常溫1-2h。3、分離后的凝膠覆蓋著熒光屏的成像板收集32pγ輻射激發(fā)光，暴露3h后，熒光屏是利用fla7000激光掃描儀讀取(ge，英國)。實驗結(jié)果：如圖2所示；1道顯示egfr+γ-32p-atp；2-4道顯示egfr+32p-atp+camp(不同濃度)反應(yīng)后；5-7道，顯示egfr+32p-atp+環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物(不同濃度)反應(yīng)后放射自顯影圖；8道顯示酶活性示蹤對照圖(poly(5tyr)標(biāo)記；9道顯示放射自顯影強度對照圖(20b的32p-rna，是由rna(20b)和t4pnk在γ-32p-atp存在下反應(yīng)得到的)。放射自顯影結(jié)果如圖2所示，camp和環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物均能抑制egfr自身磷酸化，環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物具有更強的抑制效果。這是由于egfr與atp結(jié)合口袋也能與camp結(jié)合，導(dǎo)致camp類似化合物能競爭性抑制egfr自磷酸化過程。而由于硼酸是多元弱酸能與堿性的氨基絡(luò)合，因此能對camp有一定的絡(luò)合作用，同時也能和egfr與atp結(jié)合口袋位點的氨基結(jié)合，導(dǎo)致環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物更牢固的吸附在egfr與atp結(jié)合口袋位點上，從而環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物能更強地競爭性抑制egfr自磷酸化過程?？鼓[瘤動物實驗免疫組化分析：實驗材料：裸小鼠移植瘤模型使用非小細(xì)胞肺癌a549細(xì)胞具有野生型egfr表達(dá)的模型(已由廣東實驗動物中心造模)。腫瘤移植后達(dá)到5至6mm的直徑，該載瘤裸鼠被用于抗腫瘤實驗。所有裸鼠為雌性，體重19-20g；甲狀腺素鈉(生工生物科技有限公司，純度>98％)；動物分組：上述小鼠隨機(jī)分為3個不同給藥劑量的組別：a組：去離子水，即為陰性對照組；b組：去離子水+(環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物溶液)；c組：去離子水+(甲狀腺素鈉+環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物溶液)。所有治療持續(xù)四周?？诜┝?b組：camp濃度為1.6mg/ml和h3bo3濃度為16mg/ml(環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物飲用溶液，ph＝7，用naoh溶液，調(diào)節(jié)ph)；c組：甲狀腺素鈉濃度0.010mg/ml(甲狀腺素鈉+環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物溶液，ph＝7，用naoh溶液調(diào)節(jié)ph。a組自由飲用水和食物。b組c組為給藥組，飲用藥液保持0.20-0.30ml/天，每只裸鼠控制給藥時間和給藥量。通過環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞a549對裸鼠移植瘤生長的影響：口服4周后，小鼠體重、體溫、腫瘤組織重量等指標(biāo)見表2。由表1可知，在實驗期間的3組小鼠的體重沒有統(tǒng)計學(xué)顯著的變化。其中，c組、b組腫瘤組織質(zhì)量顯著低于a組，且c組明顯低于b組。c組腫瘤ca含量顯著高于b組和a組。結(jié)果表明，環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物可顯著抑制腫瘤生長。c組ca含量較高，在一定程度上，可能由于細(xì)胞凋亡的引起鈣流失，導(dǎo)致抑制腫瘤生長。表2腫瘤生長抑制裸鼠移植模型(n＝5)使用t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析。所有p值均為雙側(cè)p≤0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。從表2腫瘤生長抑制率可以得出，c組與a組進(jìn)行對比，腫瘤生長抑制率為2.8(1.50/0.53)，實驗結(jié)果優(yōu)于其他egfrtkis報道(solitdb2005，boehrers2008)的腫瘤抑制劑的腫瘤生長抑制率(2.1，921/438)。從表2中可以得出，ca在c組甲狀腺素鈉+環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物處理的腫瘤組織中的含量顯著提高。細(xì)胞內(nèi)鈣離子與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切。由甲狀腺素鈉-解偶聯(lián)劑誘導(dǎo)較高的體溫將導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞更容易凋亡。因此用甲狀腺素鈉+環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物協(xié)同抑制腫瘤生長的機(jī)制更有利于腫瘤細(xì)胞凋亡。免疫組化凋亡化分析：通過給藥對實驗小鼠進(jìn)行治療4周后，小鼠體重在同一時間進(jìn)行稱重記錄于表2中。所有的腫瘤細(xì)胞移植瘤在切除后，稱重，并進(jìn)行比較。部分腫瘤組織通過免疫組化分析的末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(tdt)的dutp缺口末端標(biāo)記(tunel)法檢測腫瘤細(xì)胞凋亡。部分腫瘤組織進(jìn)行檢測ca含量，測定結(jié)果記錄在表2中。圖3為裸鼠腫瘤組織切片的免疫組化圖。從圖3中可以得出，tunel陽性細(xì)胞在c組腫瘤細(xì)胞顯著增加，說明細(xì)胞凋亡的過程可以通過egfr抑制劑與解偶聯(lián)劑協(xié)同增強，從而進(jìn)一步抑制腫瘤生長。腫瘤組織中鈣含量的icp-ms分析：磨碎的腫瘤組織樣本0.2g加入聚四氟乙烯(ptfe)消化容器。一個體積8ml硝酸加入到每一個樣本，然后，他們被放置在室溫下30分鐘。標(biāo)本采用微波消解系統(tǒng)消解(ethosone；里程碑，意大利)。消化后的溶液，用去離子水稀釋至50毫升的總量。進(jìn)一步的分析進(jìn)行了使用電感耦合等離子體質(zhì)譜法(nexion300x；珀金埃爾默，美國)。詳細(xì)的過程可以參考我們以前的工作(25)。bnct實驗比較：上述a組和c組各3只腫瘤直徑約8mm，停藥12小時后，分別固定腫瘤部位于鈹镅中子源(105個中子/cm2s)1厘米處輻照24小時，吸收劑量根據(jù)美國國家標(biāo)準(zhǔn)(ansi/ans-6.1.1-1977)轉(zhuǎn)化劑量率為1.25×10-6gy/n/cm2shr；因此24小時1cm處裸鼠吸收劑量為1.25×10-6×105×24/(4×3.14×12)＝2.4x10-1gy,由于屏蔽窗作用裸鼠其余部位收到輻射較小。輻照后3天后均不給藥自由食物，比較其輻照前后腫瘤體積變化。表3.輻照前后腫瘤體積變化(n＝3)組別腫瘤組織體積cm3a組0.25±0.08b組0.03±0.10pac<0.05使用t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析。所有p值均為雙側(cè)p≤0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。輻照后a組裸鼠(去離子水，即為陰性對照組)3天后腫瘤直徑接近增長1mm，而b組合c組作為給藥組，腫瘤直徑未見明顯變化。說明前期給藥加輻照更能誘導(dǎo)腫瘤凋亡。綜上，環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物作為含硼抑制劑，對腫瘤細(xì)胞的生長具有一定的抑制作用。統(tǒng)計分析：統(tǒng)計分析采用t-test；p值進(jìn)行雙邊比較，p≤0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。以上僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書及附圖內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運用在其他相關(guān)的
技術(shù)領(lǐng)域：
。當(dāng)前第1頁12