本發(fā)明涉及一種月季不定芽真空滲透轉(zhuǎn)基因方法，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

月季是世界“四大切花”之首，但目前轉(zhuǎn)基因體系還不成熟，嚴(yán)重阻礙了其分子育種的發(fā)展。目前，申請公開和授權(quán)的相關(guān)專利主要有利用芽點(公開號CN103146748A)和體細胞胚(公開號CN102220372B)兩種基因轉(zhuǎn)化方法。利用莖段產(chǎn)生的芽點進行基因轉(zhuǎn)化的缺點是增殖系數(shù)低，每個芽點需要刻傷，工序繁瑣；利用體細胞胚進行轉(zhuǎn)基因操作最大的不足是體細胞胚誘導(dǎo)困難、周期長，轉(zhuǎn)化效率低?？梢姡陨蟽煞N轉(zhuǎn)基因方法都不能滿足大規(guī)模轉(zhuǎn)基因操作的需求。申請人在反復(fù)試驗的基礎(chǔ)上，創(chuàng)建了以月季不定芽為材料的基因轉(zhuǎn)化方法，轉(zhuǎn)化效率大大提高。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種月季不定芽真空滲透轉(zhuǎn)基因方法，該種方法簡便易行、增殖系數(shù)高、生長周期短、轉(zhuǎn)化效率高，便于大規(guī)模操作及工廠化生產(chǎn)。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種月季不定芽真空滲透轉(zhuǎn)基因方法，其特征是，包括以下步驟：

切取月季無菌苗的幼嫩莖尖，在增殖培養(yǎng)基上誘導(dǎo)產(chǎn)生大量不定芽；切取長度0.5～1.0cm、帶2～4片小葉的不定芽在增殖培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)3天，然后轉(zhuǎn)移到攜帶目的基因的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液中真空滲透5～10min，充分浸濕；去除菌液后的不定芽轉(zhuǎn)移到增殖培養(yǎng)基上在黑暗條件下共培養(yǎng)3天，然后把經(jīng)無菌水徹底清洗后的不定芽轉(zhuǎn)入抑菌培養(yǎng)基培養(yǎng)5天，再根據(jù)攜帶目的基因表達載體的選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)入到選擇培養(yǎng)基上按由低到高梯度篩選，獲得的抗性不定芽轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根；采集陽性植株的葉片進行PCR鑒定和報告基因檢測，PCR鑒定和報告基因檢測都為陽性的植株為轉(zhuǎn)基因植株。

進一步地，所述增殖培養(yǎng)基的成分為MS+6-BA 1.0～2.0mg/L+NAA 0.01～0.1mg/L+瓊脂6.5g/L+蔗糖30g/L，pH為5.8～6.0。

進一步地，所述農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液為含有3％蔗糖的MS營養(yǎng)液，調(diào)整OD₆₀₀＝0.5。

進一步地，所述農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液為GV3101或者EHA105轉(zhuǎn)化液。

進一步地，所述抑菌培養(yǎng)基的成分為MS+Timentin 500mg/L+瓊脂6.5g/L+蔗糖30g/L，pH為5.8～6.0。

進一步地，所述選擇培養(yǎng)基為含有潮霉素或卡那霉素或草丁膦的選擇培養(yǎng)基，pH為5.8～6.0。

進一步地，所述生根培養(yǎng)基的成分為1/2MS+NAA 0.1mg/L+瓊脂6.5g/L+蔗糖30g/L，pH為5.8～6.0。

進一步地，所述真空滲透的具體方法為：選取滅菌后的50ml醫(yī)用注射器，加入不超過15ml的含有不定芽的轉(zhuǎn)化液，趕出空氣后密封，反復(fù)拉動推柄，直到不定芽葉片變?yōu)樯罹G、充分浸濕為止。

進一步地，所述的報告基因檢測為LUC檢測，具體方法為：選取轉(zhuǎn)基因待測不定芽，均勻噴灑1mM的熒光素底物后，放置到CCD熒光照相系統(tǒng)的暗室中拍照，曝光時間為10min，選取第三張照片觀測熒光信號。

進一步地，所述的報告基因檢測為GFP檢測，具體方法為：選取生根后轉(zhuǎn)基因不定芽，用刀片切取5cm作用的初生根，放置到培養(yǎng)皿內(nèi)的1％的瓊脂上，用體式熒光顯微鏡在eGFP信號通道下觀測熒光。

本發(fā)明所達到的有益效果：本發(fā)明增殖系數(shù)高、繁殖周期短、基因轉(zhuǎn)化率高、假陽性率低。本發(fā)明采用的不定芽具有完整、旺盛的分生組織，保證較高的增殖系數(shù)；帶有2～4片小葉對分生組織起到保護作用，而且光合作用可以為分生組織提供能量；真空滲透保證了菌液能夠均勻的進入分生組織細胞，提高了轉(zhuǎn)化效率。

附圖說明

圖1為實施例1在卡那霉素(Kan)選擇培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)基因不定芽(圓圈內(nèi)為疑似陽性不定芽)；

圖2為實施例1轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定結(jié)果，M為Maker，CK為對照，F(xiàn)T為基因FT和質(zhì)粒pFAST-R05交叉引物的擴增產(chǎn)物；

圖3為實施例1轉(zhuǎn)基因植株的GFP報告基因的檢測結(jié)果，CK為對照，F(xiàn)T-R05為轉(zhuǎn)基因植株的初生根；

圖4為實施例2在草丁膦(Bar)選擇培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)基因不定芽(圓圈內(nèi)為疑似陽性不定芽)；

圖5為實施例2轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定結(jié)果，M為Maker，CK為對照，KSN為基因KSN啟動子和質(zhì)粒pBGWL7交叉引物的擴增產(chǎn)物；

圖6為實施例2轉(zhuǎn)基因植株的LUC報告基因的檢測結(jié)果，CK為對照，pKSN-LUC為轉(zhuǎn)基因植株。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步描述。以下實施例僅用于更加清楚地說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而不能以此來限制本發(fā)明的保護范圍。

實施例1

I切取月季‘月月粉’無菌苗的莖尖，在MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+瓊脂6.5g/L+蔗糖30g/L基本增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)4周誘導(dǎo)莖尖產(chǎn)生不定芽，準(zhǔn)備100個左右。

II切取0.5cm左右?guī)?～4片小葉的不定芽繼續(xù)在增殖培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)3天，然后轉(zhuǎn)移到攜帶FT基因的pFAST-R05質(zhì)粒(比利時，根特大學(xué)提供)的農(nóng)桿菌GV3101轉(zhuǎn)化液(MS+蔗糖30g/L，OD₆₀₀＝0.5))中，轉(zhuǎn)移到無菌注射器中反復(fù)抽提滲透5min，并輕輕搖晃，觀察到葉片變?yōu)樯罹G、充分浸濕為止。

III去菌液后的不定芽轉(zhuǎn)移到增殖培養(yǎng)基上在黑暗條件下共培養(yǎng)3天，然后把經(jīng)無菌水徹底清洗后的不定芽轉(zhuǎn)入抑菌培養(yǎng)基培養(yǎng)5天，再根據(jù)pFAST-R05質(zhì)粒的抗性轉(zhuǎn)入到含有卡那霉素的選擇培養(yǎng)基上篩選，先在卡那霉素濃度為10mg/L的培養(yǎng)基上篩選3周，然后在30mg/L的培養(yǎng)基上篩選3周(如圖1所示)，獲得的新再生的抗性不定芽或者莖尖轉(zhuǎn)移到1/2MS+NAA0.1mg/L+瓊脂6.5g/L+蔗糖30g/L的生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根。

IV采集陽性植株的葉片進行PCR鑒定和報告基因GFP檢測。

PCR鑒定用基因FT和質(zhì)粒pFAST-R05特異性交叉引物進行常規(guī)PCR擴增。引物序列：F-ATGCTTAAAACTATGCCTAGGGCT，R-GGCCATGATATAGACGTTGTGG。PCR擴增條件：94℃2min，94℃30s，58℃30s，72℃1.5min，38個循環(huán)，72℃，5min，鑒定結(jié)果如圖2所示。

報告基因GFP檢測：選取生根后轉(zhuǎn)基因不定芽，用刀片切取5cm作用的初生根，放置到培養(yǎng)皿內(nèi)的1％的瓊脂上，用體式熒光顯微鏡在eGFP信號通道下觀測熒光。檢測結(jié)果如圖3所示。

PCR鑒定和報告基因檢測都為陽性的植株為轉(zhuǎn)基因植株。

實施例2

I切取月季‘月月粉’無菌苗的幼嫩莖尖，在MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.05mg/L+瓊脂6.5g/L+蔗糖30g/L基本增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)3周誘導(dǎo)莖尖產(chǎn)生不定芽，準(zhǔn)備100個左右。

II切取0.5cm左右?guī)?～4片小葉的不定芽繼續(xù)在增殖培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)3天，然后轉(zhuǎn)移到攜帶KSN基因啟動子的pBGWL7質(zhì)粒(比利時，根特大學(xué)提供)的農(nóng)桿菌EHA105轉(zhuǎn)化液(MS+蔗糖30g/L，OD₆₀₀＝0.5)，轉(zhuǎn)移到無菌注射器中反復(fù)抽提滲透7分鐘，并輕輕搖晃，觀察到葉片變?yōu)樯罹G、充分浸濕為止。

III去菌液后的不定芽轉(zhuǎn)移到增殖培養(yǎng)基上在黑暗條件下共培養(yǎng)3天，然后把經(jīng)無菌水徹底清洗后的不定芽轉(zhuǎn)入抑菌培養(yǎng)基培養(yǎng)5天，再根據(jù)pBGWL7質(zhì)粒的抗性轉(zhuǎn)入到含有草丁膦的選擇培養(yǎng)基上篩選，先在草丁膦濃度為0.5mg/L的培養(yǎng)基上篩選3周，然后在1mg/L的培養(yǎng)基上篩選3周(如圖4所示)，獲得的新生抗性不定芽或者莖尖轉(zhuǎn)移到1/2MS+NAA0.1mg/L+瓊脂6.5g/L+蔗糖30g/L的生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根。

IV采集陽性植株的葉片進行PCR鑒定和報告基因LUC檢測。

PCR鑒定用基因KSN啟動子和質(zhì)粒pBGWL7特異性交叉引物進行常規(guī)PCR擴增。引物序列：F-GTGAGATTTGAACCCGTAACTTC，R-TAAAAGCAATTGTTCCAGGAACCAG。PCR擴增條件：94℃2min，94℃30s，60℃30s，72℃1min，38個循環(huán)，72℃，5min，鑒定結(jié)果如圖5所示。

LUC報告基因檢測：選取轉(zhuǎn)基因植株，均勻噴灑1mM的熒光素底物后，放置到CCD熒光照相系統(tǒng)的暗室中拍照，曝光時間為10min，選取第三張照片觀測熒光信號。檢測結(jié)果如圖6所示。

PCR鑒定和報告基因檢測都為陽性的植株為轉(zhuǎn)基因植株。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進和變形，這些改進和變形也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。