本發(fā)明涉及人類疾病分子生物學(xué)檢測領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測ii型糖尿病易感基因creb1單核苷酸多態(tài)性的pcr-rflp方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

糖尿病被認(rèn)為是世界上第五大嚴(yán)重危害人類健康的疾病，其中90%為非胰島素依賴型糖尿病，又稱為ii型糖尿病。該病屬于復(fù)雜的代謝紊亂性疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，是遺傳和環(huán)境互作的結(jié)果，其中遺傳多態(tài)性可能是影響個體間疾病易感性的主要因素。由于ii型糖尿病的早期臨床癥狀不明顯，往往使患者延誤最佳的治療時機(jī)。因此，尋找和鑒定出人類基因組中與ii型糖尿病相關(guān)的遺傳標(biāo)記，將有利于該疾病的早期篩查和診斷，及時控制病程的進(jìn)展。

遺傳標(biāo)記主要分為兩類：ⅰ類是間接反映dna水平遺傳變異的表觀標(biāo)記，如形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞標(biāo)記和生化標(biāo)記；ⅱ類是直接反映dna水平遺傳變異的分子標(biāo)記。分子標(biāo)記是遺傳標(biāo)記的重要組成部分，能夠反映dna水平的各種遺傳變異，包括點(diǎn)突變、缺失、插入、易位、倒位、重排或存在長短與重排不一的重復(fù)多態(tài)性?？傊?，分子標(biāo)記在生命科學(xué)領(lǐng)域中已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，在遺傳標(biāo)記中占主導(dǎo)地位。

基于分子標(biāo)記而發(fā)展起來的診斷技術(shù)能夠準(zhǔn)確地檢測出與人類復(fù)雜疾病相關(guān)的變異位點(diǎn)，是疾病早期篩查和診斷的有效方法。應(yīng)用分子標(biāo)記診斷首先是在dna水平上檢測與疾病臨床檢測指標(biāo)密切相關(guān)的遺傳標(biāo)記，其次是建立該遺傳多態(tài)性的快速檢測方法，最終實(shí)現(xiàn)分子標(biāo)記檢測方法在疾病早期診斷和易感人群篩查中的應(yīng)用。

單核苷酸多態(tài)性（snp）是分子標(biāo)記的重要組成部分，在基因組中廣泛分布。限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（pcr-rflp）是一種檢測snp的有效技術(shù)，根據(jù)snp位點(diǎn)附近的序列信息，如果沒有自然酶切位點(diǎn)，通過pcr引入特定的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)并進(jìn)行切割，然后進(jìn)行瓊脂糖或聚丙烯凝膠電泳分析，就能準(zhǔn)確地鑒別snp位點(diǎn)的不同基因型。pcr-rflp方法不僅具有dna測序法的準(zhǔn)確性，又克服了費(fèi)用昂貴、繁瑣操作、假陽性的缺點(diǎn)，而且對所檢測的序列位點(diǎn)無特殊性要求。

環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白1（creb1）是含有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域的一種重要的轉(zhuǎn)錄因子。細(xì)胞內(nèi)的camp水平升高能夠激活creb1，進(jìn)而調(diào)控含cres元件的下游基因。研究表明，creb1還可以通過募集共刺激分子（如pgc-1）調(diào)控下游基因的表達(dá)，參與血糖和胰高血糖素的代謝過程。herzigs等研究發(fā)現(xiàn)，敲除creb1基因的小鼠表現(xiàn)出脂肪肝表型，且降低胰島素的敏感性（herzigs,hedricks,moranttei,koos-h,galimif,montminym(2003)crebcontrolshepaticlipidmetabolismthroughnuclearhormonereceptorppar-[gamma].nature426:190–193）。由此可見，creb1基因與糖尿病的發(fā)生密切相關(guān)。

目前，國內(nèi)外對creb1基因的研究主要集中在其功能和調(diào)控機(jī)制方面，關(guān)于creb1基因遺傳變異及其與ii型糖尿病的相關(guān)性尚未見報道。因此，開展ii型糖尿病易感基因creb1多態(tài)性的研究十分必要，在creb1基因序列中鑒定出與ii型糖尿病相關(guān)的分子標(biāo)記，用于ii型糖尿病的早期篩查和診斷，具有重大的實(shí)際意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測ii型糖尿病易感基因creb1單核苷酸多態(tài)性的pcr-rflp方法，并以該多態(tài)位點(diǎn)作為分子標(biāo)記，應(yīng)用于ii型糖尿病的早期篩查和診斷。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：用于檢測ii型糖尿病易感基因creb1單核苷酸多態(tài)性的pcr-rflp方法，以糖尿病患者和正常人的血液基因組dna為模板，在taqdna聚合酶、緩沖環(huán)境、mg^＋＋、dntps存在的情況下，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物對p進(jìn)行pcr擴(kuò)增，然后利用限制性內(nèi)切酶對其進(jìn)行酶切，再通過電泳檢測即可準(zhǔn)確鑒定待測樣本的單核苷酸多態(tài)性；

所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物對p為：

上游引物p-f：5’-cctggagtaccaggaaggacagc-3’23nt

下游引物p-r：5’-ttacacgtatgagccacc-3’18nt

引物p-f中帶有下劃線的堿基為錯配堿基，目的是引入hhai的酶切位點(diǎn)；

pcr擴(kuò)增后，將產(chǎn)物一分為二，一部分pcr產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶hhai進(jìn)行消化，再對酶切后的片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定creb1基因第-1354位的堿基多態(tài)性；另一部分pcr產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶xspi進(jìn)行消化，再對酶切后的片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定creb1基因第-1343位的堿基多態(tài)性。

所述的pcr擴(kuò)增條件是：20μl反應(yīng)體系，包括0.625utaqdna聚合酶，2×buffer10μl（內(nèi)含mg⁺⁺、dntps等），0.45μl基因組dna，10pmol/μl上、下游引物各0.5μl和滅菌超純水8.3μl；

所述的pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?5^oc預(yù)變性5min；94^oc變性30s，54.5^oc退火30s，72^oc延伸35s，35個循環(huán)；72^oc延伸10min。

所述的瓊脂糖凝膠的濃度都為3.0%。

檢測到的人creb1基因啟動子區(qū)多態(tài)性為：基因組第-1354位t>g突變；基因組第-1343位t>a突變。

通過電泳判定creb1基因第-1354位的堿基多態(tài)性為：tt基因型表現(xiàn)為161bp條帶；tg基因型表現(xiàn)為161、139和22bp條帶；gg基因型表現(xiàn)為139和22bp條帶。

通過電泳判定creb1基因第-1343位的堿基多態(tài)性為：aa基因型表現(xiàn)為161bp條帶；at基因型表現(xiàn)為161、125和36bp條帶；tt基因型表現(xiàn)為125和36bp條帶。

本發(fā)明還提供所述的creb1基因單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記在ii型糖尿病的早期篩查和診斷中的應(yīng)用。

前述的應(yīng)用是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：

（1）提取ii型糖尿病患者和正常人的血液基因組dna；

（2）根據(jù)權(quán)利要求1-6中所述的pcr-rflp方法，檢測不同群體中creb1基因-1354位和-1343位的單核苷酸多態(tài)性；

（3）根據(jù)pcr-rflp的檢測結(jié)果，分析creb1基因-1354位和-1343位的多態(tài)位點(diǎn)在ii型糖尿病群體中的易感基因型，建立準(zhǔn)確的分子診斷體系，應(yīng)用于ii型糖尿病的臨床檢測。

所述的應(yīng)用包括以下步驟：

（1）采用dna池測序技術(shù)篩查creb1基因的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，檢測到的多態(tài)位點(diǎn)包括：啟動子區(qū)-1354位t>g的突變和-1343位t>a的突變；

（2）利用pcr-rflp技術(shù)，檢測creb1基因的2個單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)在ii型糖尿病患者和正常人中的分布情況，鑒定出與ii型糖尿病易感性相關(guān)的基因型；

（3）利用spss20.0軟件將creb1基因的2個單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)與空腹血糖、糖化血紅蛋白水平ii型糖尿病相關(guān)臨床指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，如果-1354位的基因型為gg、-1343位的基因型為aa，則待測個體對糖尿病更易感，患病癥狀更嚴(yán)重，如果-1354位的基因型為tg、-1343位的基因型為tt，待測個體的糖尿病癥狀較輕。以此作為依據(jù)，應(yīng)用于ii型糖尿病的篩查和臨床診斷。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明把dna池測序篩查snp與pcr-rflp結(jié)合起來解決了sscp的繁瑣和不穩(wěn)定性，提供了一種簡單、快速、低成本、精確度高的，便于推廣應(yīng)用的在dna水平上篩查和檢測與ii型糖尿病易感性相關(guān)的遺傳標(biāo)記，可用于ii型糖尿病的臨床檢測和疾病篩查。

本發(fā)明檢測到的2個creb1基因snp位點(diǎn)位于啟動子區(qū)，啟動子是基因序列5’端重要的順式作用元件，能夠通過與多種反式作用因子結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控基因的表達(dá)水平。當(dāng)啟動子序列發(fā)生突變時，可能使原有的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)消失，也可能產(chǎn)生新的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，最終影響啟動子活性和creb1蛋白的表達(dá)水平。

creb1基因在血糖代謝和胰島素合成、分泌過程中具有重要的調(diào)控作用，將creb1基因的snp位點(diǎn)與ii型糖尿病的臨床指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析表明，空腹血糖、糖化血紅蛋白受到顯著影響，因此，creb1基因的-1354位和-1343位的snp位點(diǎn)可以作為ii型糖尿病早期篩查和診斷的分子標(biāo)記。

本發(fā)明提供的檢測方法為creb1基因多態(tài)性與ii型糖尿病關(guān)系的建立奠定了基礎(chǔ)，creb1基因的兩個位點(diǎn)可以作為分子診斷標(biāo)記，用于ii型糖尿病的臨床檢測。

附圖說明

圖1為本發(fā)明中通過dna池測序篩選到的creb1基因-1354位t>g突變的snp多態(tài)性測序結(jié)果圖。

圖2為本發(fā)明中通過dna池測序篩選到的creb1基因-1343位t>a突變的snp多態(tài)性測序結(jié)果圖。

圖3為creb1基因-1354和-1343的多態(tài)位點(diǎn)在ii型糖尿病患者和正常人中的分布情況。

具體實(shí)施方式

下面對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。若未特別指明，均按照常規(guī)的實(shí)驗(yàn)條件或按照制造廠商說明書建議的條件。

用于檢測ii型糖尿病易感基因creb1單核苷酸多態(tài)性的pcr-rflp方法，其特征在于：以糖尿病患者和正常人的血液基因組dna為模板，以引物對p（f、r）為引物，pcr擴(kuò)增creb1基因，然后利用限制性內(nèi)切酶對其進(jìn)行酶切，再通過電泳檢測即可準(zhǔn)確鑒定待測樣本的單核苷酸多態(tài)性；即在taqdna聚合酶、緩沖環(huán)境、mg^＋＋、dntps存在的情況下，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物對p進(jìn)行pcr擴(kuò)增，然后利用限制性內(nèi)切酶對其進(jìn)行酶切，再通過電泳檢測即可準(zhǔn)確鑒定待測樣本的單核苷酸多態(tài)性；

所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物對p為：

上游引物p-f：5’-cctggagtaccaggaaggacagc-3’23nt

下游引物p-r：5’-ttacacgtatgagccacc-3’18nt

引物p-f中帶有下劃線的堿基為錯配堿基，目的是引入hhai的酶切位點(diǎn)；

pcr擴(kuò)增后，將產(chǎn)物一分為二，一部分pcr產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶hhai進(jìn)行消化，再對酶切后的片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定creb1基因第-1354位的堿基多態(tài)性；另一部分pcr產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶xspi進(jìn)行消化，再對酶切后的片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定creb1基因第-1343位的堿基多態(tài)性。

其中，所述的pcr擴(kuò)增條件是：20μl反應(yīng)體系，包括0.625utaqdna聚合酶，2×buffer10μl（內(nèi)含mg⁺⁺、dntps等），0.45μl基因組dna，10pmol/μl上、下游引物各0.5μl和滅菌超純水8.3μl；

所述的pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?5^oc預(yù)變性5min；94^oc變性30s，54.5^oc退火30s，72^oc延伸35s，35個循環(huán)；72^oc延伸10min。

其中，所述的瓊脂糖凝膠的濃度都為3.0%。

進(jìn)一步，檢測到的人creb1基因啟動子區(qū)多態(tài)性為：基因組第-1354位t>g突變；基因組第-1343位t>a突變。通過電泳判定creb1基因第-1354位的堿基多態(tài)性為：tt基因型表現(xiàn)為161bp條帶；tg基因型表現(xiàn)為161、139和22bp條帶；gg基因型表現(xiàn)為139和22bp條帶。通過電泳判定creb1基因第-1343位的堿基多態(tài)性為：aa基因型表現(xiàn)為161bp條帶；at基因型表現(xiàn)為161、125和36bp條帶；tt基因型表現(xiàn)為125和36bp條帶。

本發(fā)明還提供所述的creb1基因單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記在ii型糖尿病的早期篩查和診斷中的應(yīng)用。

前述的應(yīng)用是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：

（1）提取ii型糖尿病患者和正常人的血液基因組dna；

（2）根據(jù)權(quán)利要求1-6中所述的pcr-rflp方法，檢測不同群體中creb1基因-1354位和-1343位的單核苷酸多態(tài)性；

（3）根據(jù)pcr-rflp的檢測結(jié)果，分析creb1基因-1354位和-1343位的多態(tài)位點(diǎn)在ii型糖尿病群體中的易感基因型，建立準(zhǔn)確的分子診斷體系，應(yīng)用于ii型糖尿病的臨床檢測。

進(jìn)一步，所述的應(yīng)用包括以下步驟：

（1）采用dna池測序技術(shù)篩查creb1基因的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，檢測到的多態(tài)位點(diǎn)包括：啟動子區(qū)-1354位t>g的突變和-1343位t>a的突變；

（2）利用pcr-rflp技術(shù)，檢測creb1基因的2個單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)在ii型糖尿病患者和正常人中的分布情況，鑒定出與ii型糖尿病易感性相關(guān)的基因型；

（3）利用spss20.0軟件將creb1基因的2個單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)與空腹血糖、糖化血紅蛋白水平ii型糖尿病相關(guān)臨床指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，如果-1354位的基因型為gg、-1343位的基因型為aa，則待測個體對糖尿病更易感，患病癥狀更嚴(yán)重，如果-1354位的基因型為tg、-1343位的基因型為tt，待測個體的糖尿病癥狀較輕；

以此作為依據(jù)，應(yīng)用于ii型糖尿病的篩查和臨床診斷。

本發(fā)明利用pcr-rflp方法對ii型糖尿病易感基因creb1的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行檢測。

1、血液樣本采集

本發(fā)明具體以ii型糖尿病患者和正常個體作為檢測對象，126個ii型糖尿病患者的血液樣本采自武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院內(nèi)分泌科，100個正常人血液樣本采自武漢大學(xué)校醫(yī)院體檢科。本實(shí)驗(yàn)內(nèi)容已通過武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。

2、基因組dna的分離、提取、純化

參考文獻(xiàn)sambrocketal(2002)方法。

3、dna池的構(gòu)建

用紫外分光光度計測定dna樣品在260nm、280nm處的od值。計算dna含量和od260/od280的比值。如od260/od280比值小于1.6，說明樣品中含有較多的蛋白質(zhì)或酚，則應(yīng)進(jìn)行純化；若比值大于1.8，則應(yīng)該考慮去除rna。

dna濃度（ng）=50×od260值×稀釋倍數(shù)

dna檢測完畢后，取出一定的量稀釋至50ng/μl，然后分別從ii型糖尿病患者和正常人中隨機(jī)選擇30個個體，取每個個體的dna樣品10μl混合構(gòu)建成dna池。

4、creb1基因多態(tài)位點(diǎn)篩查

pcr擴(kuò)增creb1基因啟動子區(qū)

從ncbi數(shù)據(jù)庫中（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得creb1基因（nc_000002.12）的序列信息，利用primer5.0設(shè)計擴(kuò)增creb1基因啟動子區(qū)的引物，其引物信息如下：

上游引物1-f：5’-tgggaggtgggacatgaaag-3’20nt

下游引物1-r：5’-tcagaggtctctcaggacgg-3’20nt

以構(gòu)建好的dna池為模版，用上述設(shè)計的引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，pcr反應(yīng)體系采用混合加樣法，即根據(jù)每一個反應(yīng)體系所需的各種組分的數(shù)量和1次反應(yīng)所需的pcr反應(yīng)的個數(shù)，算出各種反應(yīng)組分的總量，加入到1個1.5ml離心管中，充分混勻后瞬時離心，再分裝到每個0.2mleppendorfpcr管中，然后加入模板dna，再瞬時離心后進(jìn)行pcr擴(kuò)增。

pcr反應(yīng)體系為：20μl反應(yīng)體系，包括0.625utaqdna聚合酶，2×buffer10μl（內(nèi)含mg⁺⁺、dntps等），0.45μl基因組dna，10pmol/μl上、下游引物各0.5μl和滅菌超純水8.3μl。

pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?5^oc預(yù)變性5min；94^oc變性30s，61.0^oc退火30s，72^oc延伸1min30s，35個循環(huán)；72^oc延伸10min。

dna池測序分析

將上述pcr擴(kuò)增產(chǎn)物送武漢擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行切膠純化并測序，對測序峰圖進(jìn)行分析，其中在同一位點(diǎn)有兩個不同峰的是發(fā)生了單核苷酸突變；如圖1左起第3個位點(diǎn)出現(xiàn)了t、g兩種檢測結(jié)果、圖2所左起第3個位點(diǎn)出現(xiàn)了t、a兩種檢測結(jié)果，即本發(fā)明篩查到了creb1基因的2個snp位點(diǎn)，分別為：在creb1基因第-1354位為t或g的堿基多態(tài)性，可以表示為-1354t>g；在第-1343位為t或a的堿基多態(tài)性，可以表示為-1343t>a。

5、creb1基因多態(tài)位點(diǎn)的pcr-rflp檢測

多態(tài)位點(diǎn)分析

當(dāng)creb1基因第-1354位點(diǎn)發(fā)生t>g突變時，原本的t堿基附近的其他序列不能形成內(nèi)切酶識別序列，這時需要通過引物引入錯配，使得引物3’端和此處的突變型“g”在pcr擴(kuò)增后形成一個hhai限制性內(nèi)切酶識別序列g(shù)cgc，這樣當(dāng)?shù)?1354位點(diǎn)發(fā)生t>g突變時，即t突變?yōu)間，gctg序列相應(yīng)的變成內(nèi)切酶識別序列g(shù)cgc，從而形成了hhai限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)，該處突變可以用hhai-pcr-rflp方法檢測；當(dāng)creb1基因第-1343位點(diǎn)發(fā)生t>a突變時，原來的xspi限制性內(nèi)切酶識別序列ctag相應(yīng)的變成了gaag，該位點(diǎn)屬于自然酶切位點(diǎn)，可直接用xspi-pcr-rflp方法檢測。

pcr-rflp引物設(shè)計

針對creb1基因第-1354位的t>g突變，利用引入酶切位點(diǎn)技術(shù)設(shè)計錯配引物對p，其中上游引物序列為：

p-f:5’-cctggagtaccaggaaggacagc-3’23nt

g為引入錯配堿基，它與突變型“g”形成hhai限制性內(nèi)切酶識別序列；

另外，由于creb1基因第-1343位t>a的突變能夠使原本的xspi限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)消失，屬于自然酶切位點(diǎn)，且該位點(diǎn)與-1354位t>g的突變位點(diǎn)在基因組上距離僅相差12bp，因此，本發(fā)明創(chuàng)新性地用一對引物（p）同時檢測2個突變位點(diǎn)，與傳統(tǒng)方法相比，具有簡單、快速、節(jié)約成本等優(yōu)點(diǎn)。

引物對p的pcr反應(yīng)體系為：20μl反應(yīng)體系，包括0.625utaqdna聚合酶，2×buffer10μl（內(nèi)含mg⁺⁺、dntps等），0.45μl基因組dna，10pmol/μl上、下游引物各0.5μl和滅菌超純水8.3μl。

引物對p的pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?5^oc預(yù)變性5min；94^oc變性30s，54.5^oc退火30s，72^oc延伸35s，35個循環(huán)；72^oc延伸10min。

pcr產(chǎn)物酶切及rflp檢測

將20μl的pcr產(chǎn)物一分為二，分別用hhai和xspi進(jìn)行酶切，然后根據(jù)電泳結(jié)果判定其snp多態(tài)性。

1）酶切體系為20μl，包括：10μlpcr產(chǎn)物，1μl（10u/μl）限制性內(nèi)切酶，2μl酶切buffer，7μl滅菌蒸餾水。

2）酶切消化條件：37^oc恒溫培養(yǎng)箱中消化5~10h。

3）酶切消化后將樣品置于65^oc水浴5min終止酶切反應(yīng)，120v電壓進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，eb染色檢測酶切結(jié)果，用bio-radgeldoc2000凝膠成像分析系統(tǒng)照相分析，并判型、記錄其基因型。

creb1基因第-1354位的堿基多態(tài)性為：tt基因型表現(xiàn)為161bp條帶；tg基因型表現(xiàn)為161、139和22bp條帶；gg基因型表現(xiàn)為139和22bp條帶。

creb1基因第-1343位的堿基多態(tài)性為：aa基因型表現(xiàn)為161bp條帶；at基因型表現(xiàn)為161、125和36bp條帶；tt基因型表現(xiàn)為125和36bp條帶。

6、creb1基因多態(tài)位點(diǎn)在群體中的分布差異

creb1基因多態(tài)位點(diǎn)在ii型糖尿病患者（t2d，n=126）和正常個體（control，n=100）中的基因型分布如圖3所示，對于-1354位突變位點(diǎn)，gg基因型在糖尿病患者中屬于優(yōu)勢基因型，而在正常人中頻率最低；對于-1343位突變位點(diǎn)，aa基因型在糖尿病患者中屬于優(yōu)勢基因型，而在正常人中的優(yōu)勢基因型為ta。由此可見，-1354位點(diǎn)的gg基因型和-1343位的aa基因型可能與ii型糖尿病易感性相關(guān)。

7、creb1基因多態(tài)位點(diǎn)與ii型糖尿病臨床指標(biāo)的關(guān)聯(lián)分析

臨床數(shù)據(jù)：空腹血糖和糖化血紅蛋白水平。

關(guān)聯(lián)分析模型：先對數(shù)據(jù)進(jìn)行描述分析，確定是否存在離群值，再利用最小二乘分析對數(shù)據(jù)校正；根據(jù)數(shù)據(jù)特征，應(yīng)用spss20.0軟件分析各基因型間的生產(chǎn)性狀效應(yīng)。在對基因型效應(yīng)進(jìn)行分析時采用了固定模型：

yij=μ+genotypei+eij，

其中：yij為性狀觀察值，μ為總體均值，genotypei為第i個基因型的固定效應(yīng)，eij為隨機(jī)誤差。各組數(shù)據(jù)間的差異性采用lsd多重比較進(jìn)行檢驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果以mean±se形式表示。

關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明（見表1），在hhai檢測的-1354t>g位點(diǎn)，gg型個體的空腹血糖和糖化血紅蛋白水平都明顯高于tg型和tt型，且表現(xiàn)顯著或極顯著水平（p<0.05或p<0.01）；在xspi檢測的-1343t>a位點(diǎn)，aa基因型個體的空腹血糖顯著高于ta和tt基因型個體（p<0.05），aa和ta基因型個體的糖化血紅蛋白水平極顯著高于tt基因型個體（p<0.01）。因此，本發(fā)明首次成功利用hhai-pcr-rflp和xspi-pcr-rflp方法檢測了creb1基因-1354t>g和-1343t>a的2個多態(tài)位點(diǎn)。并通過關(guān)聯(lián)分析驗(yàn)證，creb1基因的2個位點(diǎn)均可作為ii型糖尿病臨床檢測的分子標(biāo)記。

表1creb1基因兩個多態(tài)位點(diǎn)與ii型糖尿病臨床檢測指標(biāo)的關(guān)聯(lián)分析

注：具有相同字母表示差異不顯著（p>0.05），具有不同小寫字母的表示差異顯著（p<0.05），不同大寫字母的表示差異極顯著（p<0.01）。

8、上述snp標(biāo)記在ii型糖尿病臨床篩查和診斷中的應(yīng)用

鑒定的creb1基因-1354和-1343位的snp可作為重要的分子遺傳標(biāo)記，其中，-1354位的gg基因型和-1343位的aa基因型，可作為ii型糖尿病早期篩查和診斷的重要指征。

sequencelisting

<110>武漢科技大學(xué)

<120>用于檢測ii型糖尿病易感基因creb1單核苷酸多態(tài)性的pcr-rflp方法及應(yīng)用

<160>4

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>1

cctggagtaccaggaaggacagc23

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>2

ttacacgtatgagccacc19

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>3

tgggaggtgggacatgaaag19

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

400>4

tcagaggtctctcaggacgg20