本發(fā)明涉及一種蠶絲蛋白的制備方法，具體涉及一種用于護(hù)膚品的蠶絲素低聚肽制備方法，屬于生物高分子材料技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

蠶絲是高分子動(dòng)物蛋白(絲素蛋白)，富含18種氨基酸，具有保濕、透氣、抗菌、防靜電、防紫外線等優(yōu)良特性。早在明代，李時(shí)珍在其醫(yī)學(xué)巨著《本草綱目》中就記載了蠶絲的美容護(hù)膚作用。隨著科技的進(jìn)步與發(fā)展，人們對(duì)蠶絲蛋白的認(rèn)識(shí)越來(lái)越深入，蠶絲新用途的研究與開(kāi)發(fā)受到人們的高度關(guān)注。

天然蠶絲素蛋白分子量較大，約350000da(道爾頓)，以纖維狀存在，不適合直接用于護(hù)膚品或化妝品的原料。目前常規(guī)的方法，是將生絲原料(蠶繭或廢絲)通過(guò)精煉除膠后置于溴化鋰、硝酸鎂和氯化鈣之類(lèi)的高濃度溶解性鹽中加熱溶解，然后進(jìn)行過(guò)濾和透析脫鹽等處理過(guò)程，使得絲纖維的結(jié)晶結(jié)構(gòu)受到破壞，成為絲蛋白水溶液。所得的絲素蛋白分子量在100000da以上，而且重金屬含量較高，直接用于護(hù)膚品原料，一方面絲素蛋白分子量較大，肌膚的吸收效率低，影響美容護(hù)膚效果；另一方面，由于重金屬含量較高影響到產(chǎn)品的使用安全，如中國(guó)專(zhuān)利cn201510071886.3公開(kāi)的“一種家蠶絲素蛋白溶液制備及鑒定方法”，中國(guó)專(zhuān)利cn201410352789.7公開(kāi)了的“一種陽(yáng)離子化絲素蛋白及其制備方法”等。

有報(bào)道利用蛋白酶水解蠶絲蛋白，主要有堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等對(duì)蠶絲蛋白進(jìn)行酶解，如，徐瑩、何國(guó)慶“bacillussp.el31410產(chǎn)彈性蛋白水解絲素蛋白特性的研究”(食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，6:28-29)報(bào)道，彈性蛋白酶水解絲素蛋白的最適作用溫度是45-55℃，最適ph是9.0，水解產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量主要在1000d以上，以大分子的多肽物質(zhì)為主，技術(shù)工藝要求高，流程復(fù)雜，可控程度低。代君君等“木瓜蛋白酶的降解作用研究”(北方蠶業(yè)，2015，09：11-13)表明ph8-9、溫度60-70℃，木瓜蛋白酶的活性為20-25u時(shí)絲素蛋白水解效果較好，酶的作用時(shí)間越長(zhǎng)效果越好，但所得產(chǎn)物為混合物，有氨基酸、小肽、多肽及部分大分子蛋白質(zhì)。張桂征等“一株放線菌對(duì)絲素纖維的降解作用”(蠶業(yè)科學(xué)，2007，33:241-245)，培養(yǎng)42d時(shí)，絲素纖維已完全降解，所得產(chǎn)物以小分子的氨基酸為主，寡肽含量比例在10％以下。研究表明，小分子或氨基酸類(lèi)物質(zhì)有利于胃腸道的吸收，低聚肽(分子量800-500da)分子有利于肌膚的吸收。為開(kāi)發(fā)蠶絲美容護(hù)膚品，蠶絲低聚肽制備技術(shù)尤為關(guān)鍵。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

解決的技術(shù)問(wèn)題：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種用于護(hù)膚品的蠶絲素低聚肽制備方法，運(yùn)用堿性蛋白酶和放線菌酶雙酶解，并結(jié)合膜分離技術(shù)，通過(guò)嚴(yán)格控制用酶量和酶解條件制備蠶絲素低聚肽。

技術(shù)方案：本發(fā)明提供的用于護(hù)膚品的蠶絲素低聚肽制備方法，包括以下制備步驟：

(1)脫膠：取蠶繭用0.5-0.8％na2co3溶液浸漬脫膠30-40min，然后用清水洗滌，重復(fù)浸漬、清洗2-3遍，自然晾干或烘干，得到脫膠蠶絲，所述蠶繭與na2co3溶液的固液質(zhì)量比為1:200，；

(2)鹽解：將步驟(1)所得脫膠蠶絲放入50-60％cacl2的溶液中加熱至沸騰后溶解20-30min，冷卻后離心20-30min，得到鹽解液，所述脫膠蠶絲與cacl2溶液的固液質(zhì)量比為1:20；

(3)透析：將步驟(2)所得鹽解液用截留分子量15000-10000da的透析袋流水透析2-3天，得到低分子量絲素溶液；

(4)雙酶解：按固液質(zhì)量比(100-110):1將復(fù)合酶與步驟(3)所得低分子量絲素溶液混合，在ph8-8.5下酶解60-70min，得到絲素酶解液，所述復(fù)合酶是由堿性蛋白酶和放線菌酶按質(zhì)量比堿性蛋白酶:放線菌酶＝(2.0-2.5):1混合而成；

(5)再透析：將步驟(4)所得絲素酶解液用截留分子量1500-300da的透析袋流水透析2-3天，獲得低分子量絲素酶解液；

(6)膜分離：對(duì)步驟(5)所得低分子量絲素酶解液進(jìn)行濃縮，用雙蒸水進(jìn)行梯度洗脫，然后用膜分離柱進(jìn)行分離、收集組分，即獲得分子量在800-500da的蠶絲素低聚肽溶液；

(7)將步驟(6)所得蠶絲素低聚肽溶液經(jīng)-80℃冷凍干燥，得到蠶絲素低聚肽粉。

步驟(1)所述烘干溫度為60-70℃。步驟(2)所述離心轉(zhuǎn)速為3500-4000r/min。步驟(4)所述堿性蛋白酶與放線菌酶的活力單位均為10000u。步驟(6)所述膜分離柱為葡聚糖凝膠層析柱sephadexg-15。

有益效果：(1)提取物產(chǎn)出率高，1g蠶絲可以提取0.513g蠶絲素低聚肽粉末。

(2)絲素低聚肽分子量集中，93％以上集中在800-500da之間。

(3)絲素低聚肽生物學(xué)活性高，易被肌膚吸收，體現(xiàn)出良好的保濕、抗菌、抗氧化、抗紫外損傷等功能。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明的工藝流程圖；

圖2為脫膠蠶絲電子顯微鏡掃描圖；

圖3為雙酶解蠶絲電子顯微鏡掃描圖。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例的方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不因此局限于下述實(shí)施例，而是由本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)限定。

實(shí)施例1

一種用于護(hù)膚品的蠶絲素低聚肽制備方法，制備步驟如下：

(1)脫膠：將蠶繭剪成1～2cm²，用0.5-0.8％na2co3溶液浸漬脫膠30min，固液質(zhì)量比為1:200，然后用清水洗滌，重復(fù)浸漬、清洗2-3遍，自然晾干或60℃烘干，得到脫膠蠶絲；

(2)鹽解：將步驟(1)所得脫膠蠶絲放入50-60％cacl2的溶液中加熱至沸騰后溶解20min，固液質(zhì)量比為1:20，冷卻后以轉(zhuǎn)速3500r/min離心20min，得到鹽解液；

(3)透析：將步驟(2)所得鹽解液用截留分子量15000-10000da的透析袋流水透析2-3天，得到低分子量絲素溶液；

(4)雙酶解：按固液質(zhì)量比100:1將復(fù)合酶與步驟(3)所得低分子量絲素溶液混合，在ph8-8.5下酶解60min，得到絲素酶解液，所述復(fù)合酶是由堿性蛋白酶和放線菌酶按質(zhì)量比2:1混合而成，堿性蛋白酶與放線菌酶的活力單位均為10000u；

(5)再透析：將步驟(4)所得絲素酶解液用截留分子量1500-300da的透析袋流水透析2-3天，獲得低分子量絲素酶解液；

(6)膜分離：對(duì)步驟(5)所得低分子量絲素酶解液進(jìn)行濃縮，用雙蒸水進(jìn)行梯度洗脫，然后用葡聚糖凝膠層析柱sephadexg-15進(jìn)行分離、收集組分，即獲得分子量在800-500da的蠶絲素低聚肽溶液；

(7)將步驟(6)所得蠶絲素低聚肽溶液經(jīng)-80℃冷凍干燥，得到蠶絲素低聚肽粉。

實(shí)施例2

一種用于護(hù)膚品的蠶絲素低聚肽制備方法，制備步驟如下：

(1)脫膠：將蠶繭剪成1～2cm²，用0.5-0.8％na2co3溶液浸漬脫膠35min，固液質(zhì)量比為1:200，然后用清水洗滌，重復(fù)浸漬、清洗2-3遍，自然晾干或65℃烘干，得到脫膠蠶絲；

(2)鹽解：將步驟(1)所得脫膠蠶絲放入50-60％cacl2的溶液中加熱至沸騰后溶解25min，固液質(zhì)量比為1:20，冷卻后以轉(zhuǎn)速3800r/min離心25min，得到鹽解液；

(3)透析：將步驟(2)所得鹽解液用截留分子量15000-10000da的透析袋流水透析2-3天，得到低分子量絲素溶液；

(4)雙酶解：按固液質(zhì)量比105:1將復(fù)合酶與步驟(3)所得低分子量絲素溶液混合，在ph8-8.5下酶解65min，得到絲素酶解液，所述復(fù)合酶是由堿性蛋白酶和放線菌酶按質(zhì)量比2:1混合而成，堿性蛋白酶與放線菌酶的活力單位均為10000u；

(5)再透析：將步驟(4)所得絲素酶解液用截留分子量1500-300da的透析袋流水透析2-3天，獲得低分子量絲素酶解液；

(6)膜分離：對(duì)步驟(5)所得低分子量絲素酶解液進(jìn)行濃縮，用雙蒸水進(jìn)行梯度洗脫，然后用葡聚糖凝膠層析柱sephadexg-15進(jìn)行分離、收集組分，即獲得分子量在800-500da的蠶絲素低聚肽溶液；

(7)將步驟(6)所得蠶絲素低聚肽溶液經(jīng)-80℃冷凍干燥，得到蠶絲素低聚肽粉。

實(shí)施例3

一種用于護(hù)膚品的蠶絲素低聚肽制備方法，制備步驟如下：

(1)脫膠：將蠶繭剪成1～2cm²，用0.5-0.8％na2co3溶液浸漬脫膠40min，固液質(zhì)量比為1:200，然后用清水洗滌，重復(fù)浸漬、清洗2-3遍，自然晾干或70℃烘干，得到脫膠蠶絲；

(2)鹽解：將步驟(1)所得脫膠蠶絲放入50-60％cacl2的溶液中加熱至沸騰后溶解30min，固液質(zhì)量比為1:20，冷卻后以轉(zhuǎn)速4000r/min離心30min，得到鹽解液；

(3)透析：將步驟(2)所得鹽解液用截留分子量15000-10000da的透析袋流水透析2-3天，得到低分子量絲素溶液；

(4)雙酶解：按固液質(zhì)量比110:1將復(fù)合酶與步驟(3)所得低分子量絲素溶液混合，在ph8-8.5下酶解70min，得到絲素酶解液，所述復(fù)合酶是由堿性蛋白酶和放線菌酶按質(zhì)量比2.5:1混合而成，堿性蛋白酶與放線菌酶的活力單位均為10000u；

(5)再透析：將步驟(4)所得絲素酶解液用截留分子量1500-300da的透析袋流水透析2-3天，獲得低分子量絲素酶解液；

(6)膜分離：對(duì)步驟(5)所得低分子量絲素酶解液進(jìn)行濃縮，用雙蒸水進(jìn)行梯度洗脫，然后用葡聚糖凝膠層析柱sephadexg-15進(jìn)行分離、收集組分，即獲得分子量在800-500da的蠶絲素低聚肽溶液；

(7)將步驟(6)所得蠶絲素低聚肽溶液經(jīng)-80℃冷凍干燥，得到蠶絲素低聚肽粉。

實(shí)施例中蠶絲素低聚肽的分子量分布的測(cè)定方法采用高效凝膠過(guò)濾色譜法，測(cè)試結(jié)果表明本發(fā)明提供的蠶絲素低聚肽的相對(duì)分子質(zhì)量主要集中在800-500da，低聚肽含量超過(guò)93％。

實(shí)施例1獲得的蠶絲素低聚肽經(jīng)sem電鏡掃描；圖2為脫膠后蠶絲的電鏡掃描結(jié)果，蠶絲結(jié)構(gòu)完整，分子量大；圖3為脫膠蠶絲經(jīng)雙酶解處理后的蠶絲結(jié)構(gòu)，蠶絲被分解成細(xì)碎的顆粒狀，大小相對(duì)均勻。