本發(fā)明屬于植物分子生物學領域，具體涉及一種大麥基因表達研究的內參基因及其應用。

背景技術：

熒光定量pcr已經被廣泛用于植物基因表達變化的研究，從而來揭示植物相關機理。

特別是近年來，全基因組水平的rna測序技術的發(fā)展，利用該技術，可以大規(guī)模的發(fā)現(xiàn)表達差異基因，進而為相關機理研究服務，對于rna測序的驗證，也基本都是首先使用熒光定量pcr。而熒光定量pcr檢測準確性的關鍵在于有一個或一組非常可靠的內參基因。

大麥是世界上第四大禾谷類作物，分布廣、適應性好、耐逆性強，而且也是研究禾谷類作物的模式植物。盡管有一些內參基因已經被用于大麥耐低氮定量pcr分析，但是，并沒有對其穩(wěn)定性進行研究，如果直接把一些所謂的內參基因拿來用，在低氮處理的樣品中可能并不穩(wěn)定，因此，用這樣的內參基因來研究目標基因的表達情況也未必準確。

盡管也有一些內參基因篩選的研究，但是，由于所基于的大麥基因型、實驗條件、低氮脅迫程度并不一致，所以，篩選的內參基因也可能表現(xiàn)出不穩(wěn)定或者不是最穩(wěn)定、最佳的，因此，有必要對即將開展的大麥耐低氮基因表達研究篩選鑒定出穩(wěn)定表達的內參基因。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種用于大麥基因表達研究的內參基因及其應用，該內參基因可以提高大麥相關基因(如低氮脅迫、抗旱脅迫)表達檢測的準確性，表達量高，表達穩(wěn)定，其ct值在20-30間。

為了達到上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案；

用于大麥基因表達研究的內參基因，其為泛素綴合酶e2、延長因子ef2和/或微管蛋白β-tubulin6的基因片段，其中，所述泛素綴合酶e2基因片段的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述延長因子ef2基因片段的核苷酸序列如seqidno.2所示，所述微管蛋白β-tubulin6基因片段的核苷酸序列如seqidno.3所示。

所述的內參基因用于大麥的耐低氮基因表達研究。

本發(fā)明提供一種檢測大麥耐低氮基因表達的方法，包括以下步驟：

1)低氮脅迫處理及取樣

取培養(yǎng)至三葉一心期的大麥幼苗，置于低氮營養(yǎng)液中，進行低氮脅迫處理，分別取處理0小時、1～6小時和24小時后大麥的莖葉部分作為樣品；

其中，所述的低氮營養(yǎng)液中，nh4no3的濃度為0.1～1.0mm；

2)提取rna、反轉錄合成cdna

提取樣品rna，進行反轉錄，合成cdna；

3)進行熒光定量pcr反應

以步驟2)中獲得的cdna為模板，以擴增上述內參基因的引物對為引物，進行熒光定量pcr擴增，進行定量pcr擴增，擴增產物與熒光染料結合，由熒光強弱反映擴增情況，獲得ct值；

4)表達分析

利用ct值和各引物對的擴增效率，根據以下公式得出耐低氮基因的標準化相對表達量nrq；

其中，nrq(normalizedrelativequantification)即標準化相對表達量；et為目的基因擴增效率，er為內參基因擴增效率；ct目的基因為目的基因ct值，ct內參基因為內參基因的ct值；n為使用的內參基因個數(shù)及第n個內參基因。

進一步，所述步驟3)中，用于擴增內參基因的引物對如下：擴增泛素綴合酶e2基因片段的引物序列為：

f1：5'-tttttggccctgatgatagc-3'；

r1：5'-ccgaactgttggtggcttat-3'；

擴增延長因子ef2基因片段的引物序列為：

f2：5'-aatcaaggactccgttgtgg-3'；

r2：5'-cgtcacagacctcaaagcaa-3'；

擴增微管蛋白β-tubulin6基因片段的引物序列為：

f3：5'-tcccgaacaatgtcaagtca-3'；

r3：5'-gtggagttgccaatgaaggt-3'。

又進一步，pcr擴增的反應體系為：各引物對中，每條引物序列的濃度為300-800nm，cdna模板濃度為1-10ng/μl。

優(yōu)選地，所述的pcr擴增反應體系中，各引物對中，每條引物序列的濃度為600nm。

進一步，所述步驟3)中，pcr擴增反應程序為：50℃2分鐘，95℃2分鐘，40個循環(huán)的95℃15秒和60℃1分鐘。

又優(yōu)選地，步驟1)所述的低氮營養(yǎng)液中，nh4no3的濃度為0.24mm。

所謂的低氮脅迫，就是比正常供氮的氮源低并且發(fā)現(xiàn)植物的生長明顯受到抑制即為低氮脅迫，氮源的形式可以不同，濃度可以不同，本發(fā)明利用大麥耐低氮的轉錄組分析數(shù)據，選擇出3個大麥內參基因e2、ef2和β-tubulin6，這3個基因在對應的低氮脅迫樣品中表現(xiàn)為表達無差異。

在pcr反應過程中，反應體系里含有可以結合雙鏈dna并且能夠發(fā)光的熒光標記物，在60℃1分鐘階段，擴增產物會形成雙鏈dna，這樣就會產生熒光，雙鏈dna越多，熒光強度就越強，在熒光信號呈現(xiàn)指數(shù)變化階段時讀取ct值，利用本發(fā)明的內參基因檢測大麥相關基因檢測時ct值為20～30。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有的有益效果：

1)本發(fā)明利用轉錄組測序分析結果，結合內參基因篩選軟件篩選出針對大麥合適的內參基因，利用篩選出的內參基因，可以提高檢測大麥相關基因(如低氮脅迫、抗旱脅迫等等)表達的準確性。

2)本發(fā)明在檢測大麥耐低氮基因表達情況時，在nh4no3的濃度為0.1～1.0mm低氮營養(yǎng)液中，對不同基因型的大麥進行低氮脅迫處理，進行熒光定量pcr反應時，反應體系中cdna模板濃度及引物濃度的設置，使ct值不會太小或太大，同時保證不出現(xiàn)非特異擴增，節(jié)省模板cdna的用量。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1中e2內參基因的熔解曲線。

圖2為本發(fā)明實施例1中ef2內參基因的熔解曲線。

圖3為本發(fā)明實施例1中β-tubulin6內參基因的熔解曲線。

圖4為本發(fā)明實施例2中各內參基因引物的定量pcr擴增產物。

圖5為本發(fā)明實施例2中利用genorm軟件分析平均表達穩(wěn)定m值的結果。

圖6為本發(fā)明實施例2中內參基因配對變異分析結果。

圖7為本發(fā)明實施例3中pr1基因在大麥基因型bi-04中以e2和β-tubulin6為內參基因計算的表達情況。

圖8為本發(fā)明實施例3在大麥基因型bi-04中根據轉錄組測序中pr1基因的轉錄本的個數(shù)計算的表達情況。

圖9為為本發(fā)明實施例3中pr1基因在大麥基因型bi-45中以e2和β-tubulin6為內參基因計算的表達情況。

圖10為本發(fā)明實施例3在大麥基因型bi-45中根據轉錄組測序中pr1基因的轉錄本的個數(shù)計算的表達情況。

具體實施方式

以下結合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。

實施例1大麥內參基因的獲得

本發(fā)明利用大麥耐低氮相關轉錄組測序分析結果，選擇出3個表達穩(wěn)定的大麥內參基因e2、ef2和β-tubulin6，其中，所述泛素綴合酶e2基因片段的基因序列來源為mloc_9934.1，其核苷酸序列如seqidno.1所示，所述延長因子ef2基因片段的基因序列來源為mloc_15661.3，其核苷酸序列如seqidno.2所示，所述微管蛋白β-tubulin6基因片段的基因序列來源mloc_74587.1，其核苷酸序列如seqidno.3所示。

通過primer3軟件(http://primer3.wi.mit.edu/)設計引物，引物信息如下：

擴增泛素綴合酶e2基因片段的引物序列為：

f1：5'-tttttggccctgatgatagc-3'；

r1：5'-ccgaactgttggtggcttat-3'；

擴增延長因子ef2基因片段的引物序列為：

f2：5'-aatcaaggactccgttgtgg-3'；

r2：5'-cgtcacagacctcaaagcaa-3'；

擴增微管蛋白β-tubulin6基因片段的引物序列為：

f3：5'-tcccgaacaatgtcaagtca-3'；

r3：5'-gtggagttgccaatgaaggt-3'。

之后利用定量pcr熔解曲線和瓊脂糖電泳(2％瓊脂糖凝膠，100v，30分鐘)檢驗引物的特異性，結果參見圖1-3，由圖1-3可見，每對引物的擴增產物熔解曲線只有1個峰，說明只有1個擴增產物，并且，瓊脂糖凝膠電泳對其擴增產物檢測也只有1條帶，即只有1個產物。

以上結果表明，上述內參基因的引物特異性較好，可用于后續(xù)定量pcr實驗。

實施例2利用現(xiàn)有的內參基因對穩(wěn)定性及準確性進行驗證

1.植物生長和低氮脅迫處理

取2種基因型(bi-04和bi-45)的大麥種子若干，用1％naclo消毒30分鐘，然后用清水沖洗3遍，再用清水浸種4個小時，然后取出種子催芽，過夜。取出芽一致的種子直接播種于含有蛭石的盆缽里，待一葉一心期時，把幼苗包裹上海綿條固定在鉆有孔的泡沫板上，把泡沫板轉入含有營養(yǎng)液的培養(yǎng)箱內繼續(xù)生長，營養(yǎng)液含有114.3mg/l(1.43mm)的nh4no3，50.4mg/l的nah2po4·2h2o，89.3mg/l的k2so4，110.8mg/l的cacl2，405.0mg/l的mgso4，1.6mg/l的mnso4·h2o，18.8μg/l的na2moo4·h2o，1.2mg/l的h3bo3，43.8μg/l的znso4·7h2o，38.8μg/l的cuso4·5h2o，15.0mg/l的檸檬酸鐵。待三葉一心期時，對大麥幼苗進行低氮脅迫，即把上述營養(yǎng)液中的nh4no3降低到19.21mg/l(0.24mm)。

整個生長期，營養(yǎng)液的ph保持在6.2左右，每天光照為16小時，溫度為20℃左右，濕度為70％。在低氮脅迫處理0小時、1小時、24小時分別取兩個大麥基因型地上部作為樣品，液氮冷凍后保存于-80℃超低溫冰箱，每個樣品3次生物學重復。

2.提取rna和反轉錄cdna

使用invitrogen的trizol試劑完成rna的提取，具體程序參考試劑盒說明書。

然后使用promega的rq1dna酶試劑盒進行dna處理，再使用takara的primescriptⅱcdna第一鏈合成試劑盒進行cdna的合成，具體程序參考試劑盒說明書，每個反轉錄反應為20μl，使用1μgrna進行。

對合成獲得的cdna樣品用一對跨內含子設計的引物來進行pcr，然后對dna去除情況進行驗證，同時來確定cdna的合成情況，根據實驗需要來調整cdna的濃度。

3.熒光定量pcr反應

分別利用現(xiàn)有的6個內參基因(snorna14、snorna23、adp、gapdh-1、gapdh-2、actin)和實施例1的3個內參基因(e2、ef2和β-tubulin6)與各自對應的引物進行熒光定量pcr反應，在7500fast定量pcr平臺上進行，并且使用powerup熒光混合液(sybrgreenmastermix)來進行定量pcr反應，獲得各內參基因對應的ct值，使用linreg軟件計算每對引物的擴增效率，相關成分及程序參考說明書，熒光定量pcr反應中的引物及擴增效率參見表1。

反應體系為：10μl的總反應體系中，熒光混合液2×powerupsybrgreenmastermix5μl，水3.4μl，10μm引物混合物(包含正反引物)0.6μl，稀釋10倍的cdna1μl。

反應程序為：50℃2分鐘，95℃2分鐘，40個循環(huán)的95℃15秒和60℃1分鐘。

4.分析驗證

使用officeexcel2003來整理數(shù)據，使用genorm、normfinder和bestkeeper三種內參基因篩選軟件對內參基因進行分析比較，相關使用參考各自說明書。

1)使用genorm軟件對候選內參基因進行分析

genorm軟件分析結果參見表2和圖5，圖5中，縱坐標為m值，橫坐標為內參基因，從左往右，表示內參基因越來越穩(wěn)定，對應的m值也是由大變小，9個內參基因的m值都小于1.5，表明這些內參基因都比較穩(wěn)定，其中，內參基因β-tubulin6和gapdh-2的m值最低為0.129，說明這兩個內參基因最穩(wěn)定，而相對最不穩(wěn)定的內參基因snorna14的m值最高，為0.306。

進一步，通過進行內參基因配對變異分析來確定內參基因的配合使用個數(shù)，一般內參基因會同時選用3個，比如v3/4表示3個內參基因的基礎上再增加一個是否必要，若配對變異系數(shù)小于判定值0.15，就表明不必要，參見圖6，縱坐標為配對變異系數(shù)，橫坐標為基因個數(shù)，由圖6中可知，v3/4對應的配對變異系數(shù)為0.044(<0.15)，就表明不必要，以此類推，而本發(fā)明中，v2/3對應的配對變異系數(shù)為0.059也小于0.15，表明在大麥低氮脅迫中，使用2個內參基因就足夠了，穩(wěn)定性符合內參基因的使用要求。

2)使用normfinder軟件對候選內參基因進行分析

normfinder軟件分析結果參見表3，由表3可見，內參基因adp的穩(wěn)定值(stabilityvalue，sv)最低，為0.047，表明該內參基因最穩(wěn)定，而snorna14的sv值最高，為0.244，表明它們作為大麥低氮脅迫樣品內參基因相對最不穩(wěn)定，這和genorm軟件分析的結果一致。

3)使用bestkeeper軟件對候選內參基因進行分析

bestkeeper軟件分析結果參見表4，由表4可見，所有的候選內參基因cp值的標準差都小于1，表明所有這些內參基因表達都相對比較穩(wěn)定，這和genorm軟件分析的結果一致。其中，內參基因e2對應的標準差最小，為0.38，表明該內參基因相對最穩(wěn)定，而內參基因snorna23對應的標準差最高，為0.59，這表明該內參基因相對最不穩(wěn)定。

對9個內參基因的穩(wěn)定性進行排序，參見表5，由表5可以看出，本發(fā)明的三個內參基因均較為穩(wěn)定，其中genorm軟件分析排序中β-tubulin6進入前3，normfinder和bestkeeper軟件分析排序中β-tubulin6和e2兩個進入了前3，因此新擴充的大麥內參基因不僅增加了大麥內參基因的選擇范圍，而且還使得大麥的基因表達研究更加準確。

實施例3利用內參基因對大麥低氮脅迫基因進行檢測

一種檢測大麥低氮脅迫下病程相關蛋白基因pr1(genbank:z21494.1)表達的方法，包括以下步驟：

1)低氮脅迫處理及取樣

分別取兩種大麥基因型(bi-04和bi-45)培養(yǎng)至三葉一心期的大麥幼苗，置于低氮營養(yǎng)液中，進行低氮脅迫處理，分別取處理0小時、1～6小時和24小時后大麥的莖葉部分作為樣品；

其中，所述的低氮營養(yǎng)液中，nh4no3的濃度為0.1～1.0mm；

2)提取rna、反轉錄合成cdna

使用invitrogen的trizol試劑完成rna的提取，具體程序參考試劑盒說明書。

然后使用promega的rq1dna酶試劑盒進行dna處理，再使用takara的primescriptⅱcdna第一鏈合成試劑盒進行cdna的合成，具體程序參考試劑盒說明書，每個反轉錄反應為20μl，使用1μgrna進行。

對合成獲得的cdna樣品用一對跨內含子設計的引物來進行pcr，然后對dna處理進行驗證，同時來確定cdna的合成情況，根據實驗需要來調整cdna的濃度。

3)進行熒光定量pcr反應

以步驟2)中獲得的cdna為模板，以擴增泛素綴合酶e2和微管蛋白β-tubulin6的引物對(參見表1)、以及擴增大麥病程相關蛋白基因pr1的引物對為引物，進行pcr擴增，分別獲得ct值；

其中，擴增大麥病程相關蛋白基因pr1的引物序列為：

f10：5'-ggactacgactacggctcca-3'；

r10：5'-ggctcgtagttgcaggtgat-3'；

其擴增效率為1.767。

反應體系為：10μl的總反應體系中，熒光混合液2×powerupsybrgreenmastermix5μl，水3.4μl，10μm引物混合物(包含正反引物)0.6μl，稀釋10倍的cdna1μl。

反應程序為：50℃2分鐘，95℃2分鐘，40個循環(huán)的95℃15秒和60℃1分鐘。

4)表達分析

利用ct值和擴增效率(參見表1)，根據上述nrq計算公式得出耐低氮基因的標準化相對表達量nrq，參見圖7-10。

由圖7-10可以看出，基于內參基因的定量pcr分析表明，低氮脅迫下pr1基因在bi-04中是上調表達的，盡管相對于0小時表達變化的倍數(shù)不完全相同，但其趨勢和轉錄組測序的結果相一致；同樣，低氮脅迫下pr1基因在bi-45中是下調表達的，這也和轉錄組測序結果非常相似。

可見，本發(fā)明提供的泛素綴合酶e2和微管蛋白β-tubulin6內參基因，通過定量pcr檢測能夠準確反映低氮脅迫下目標基因的變化趨勢。

<110>上海市農業(yè)科學院

<120>用于大麥基因表達研究的內參基因及其應用

<130>1711110

<160>3

<170>patentinversion3.5

<210>seqidno.1

<211>939

<212>dna

<213>大麥(hordeumvulgarel.)

<400>1

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tccatgctctaggacaacgagcacgcgggagcctacatctccaccaccaccgccggccgc240

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tgtgagtttgtaagttgtatcacatcacattgactctga939

<210>seqidno.2

<211>2968

<212>dna

<213>大麥(hordeumvulgarel.)

<400>2

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<210>seqidno.3

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<213>大麥(hordeumvulgarel.)

<400>3

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