本發(fā)明涉及一種用于鑒別牛病毒腹瀉病毒和牛輪狀病毒的引物組合及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

牛病毒性腹瀉病毒(bovineviraldiarrheadiseasevirus，bvdv)和牛輪狀病毒(bovinerotavirus，brv)是兩種常見(jiàn)牛腹瀉病毒，癥狀相似，難以區(qū)分。bvdv臨床上常出現(xiàn)發(fā)熱、腹瀉、黏膜損傷和趾部損傷，但大多數(shù)感染bvdv的牛以持續(xù)性感染不表現(xiàn)臨床癥狀存在，持續(xù)感染的牛一旦再次接觸抗原相似性抗原便會(huì)繼發(fā)為黏膜病，死亡率100％。持續(xù)性感染的?？赏ㄟ^(guò)血液、排泄物等多種途徑水平傳播病毒，還可通過(guò)生殖道垂直傳播，它們終身帶毒，持續(xù)排毒，成為重要傳染源，是養(yǎng)牛業(yè)潛在的危害。牛輪狀病毒感染1-7日齡的犢牛，可引起犢牛消化道機(jī)能紊亂，臨床上以嘔吐、腹瀉、脫水和酸堿平衡為特征。兩種病毒感染后都會(huì)引起嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，因此急需建立牛病毒性腹瀉和牛輪狀病毒的快速檢測(cè)技術(shù)，為我國(guó)bvdv和brv的防控提供技術(shù)支持。

目前常用的bvdv和brv的診斷方法主要有：病原分離，血清學(xué)方法和分子生物學(xué)方法(rt-pcr和熒光rt-pcr)。環(huán)介導(dǎo)的體外等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)在pcr方法上發(fā)展起來(lái)的新興核酸檢測(cè)技術(shù)，突破了恒溫?cái)U(kuò)增的技術(shù)難點(diǎn)，6條引物同效率時(shí)增，敏感性高，特異性好，已在多種疾病的檢測(cè)上得到應(yīng)用。多重lamp是一種高效的lamp形式，一次lamp反應(yīng)，可同時(shí)檢測(cè)、鑒別多種病原體。但目前國(guó)內(nèi)的多重lamp方法都有一定的局限性，不能確定具體到底是哪一種病原引起的陽(yáng)性結(jié)果，不能實(shí)現(xiàn)真正意義上的鑒別診斷。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種用于鑒別牛病毒腹瀉病毒和牛輪狀病毒的引物組合及其應(yīng)用。

本發(fā)明首先保護(hù)引物組合，由引物組i和引物組ii組成；

所述引物組i由引物bvdv-f3、引物bvdv-b3、引物bvdv-fip和引物bvdv-bip組成；

所述引物bvdv-f3為如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列1所示的單鏈dna分子；

(a2)將序列1經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有相同功能的dna分子；

所述引物bvdv-b3為如下(a3)或(a4)：

(a3)序列表的序列2所示的單鏈dna分子；

(a4)將序列2經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有相同功能的dna分子；

所述引物bvdv-fip為如下(a5)或(a6)：

(a5)序列表的序列3所示的單鏈dna分子；

(a6)將序列3經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列3具有相同功能的dna分子；

所述引物bvdv-bip為如下(a7)或(a8)：

(a7)序列表的序列4所示的單鏈dna分子；

(a8)將序列4經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列4具有相同功能的dna分子；

所述引物組ii由引物brv-f3、引物brv-b3、引物brv-fip和引物brv-bip組成；

所述引物brv-f3為如下(b1)或(b2)：

(b1)序列表的序列5所示的單鏈dna分子；

(b2)將序列5經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列5具有相同功能的dna分子；

所述引物brv-b3為如下(b3)或(b4)：

(b3)序列表的序列6所示的單鏈dna分子；

(b4)將序列6經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列6具有相同功能的dna分子；

所述引物brv-fip為如下(b5)或(b6)：

(b5)序列表的序列7所示的單鏈dna分子；

(b6)將序列7經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列7具有相同功能的dna分子；

所述引物brv-bip為如下(b7)或(b8)：

(b7)序列表的序列8所示的單鏈dna分子；

(b8)將序列8經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列8具有相同功能的dna分子。

所述引物bvdv-fip的5’端連接有熒光基團(tuán)a。

所述引物brv-fip的5’端連接有熒光基團(tuán)b。

所述熒光基團(tuán)a可為fitc。

所述熒光基團(tuán)b可為cy5.5。

所述引物組合的用途為如下(c1)至(c6)中的任一種：

(c1)鑒別牛病毒腹瀉病毒和牛輪狀病毒；

(c2)制備用于鑒別牛病毒腹瀉病毒和牛輪狀病毒的試劑盒；

(b3)檢測(cè)待測(cè)病原微生物是否為牛病毒腹瀉病毒或牛輪狀病毒；

(c4)制備用于檢測(cè)待測(cè)病原微生物是否為牛病毒腹瀉病毒或牛輪狀病毒的試劑盒；

(c5)檢測(cè)待測(cè)樣本中是否含有牛病毒腹瀉病毒和/或牛輪狀病毒；

(c6)制備用于檢測(cè)待測(cè)樣本中是否含有牛病毒腹瀉病毒和/或牛輪狀病毒的試劑盒。

本發(fā)明還保護(hù)所述引物組合的應(yīng)用，為如下(c1)至(c6)中的任一種：

(c1)鑒別牛病毒腹瀉病毒和牛輪狀病毒；

(c2)制備用于鑒別牛病毒腹瀉病毒和牛輪狀病毒的試劑盒；

(b3)檢測(cè)待測(cè)病原微生物是否為牛病毒腹瀉病毒或牛輪狀病毒；

(c4)制備用于檢測(cè)待測(cè)病原微生物是否為牛病毒腹瀉病毒或牛輪狀病毒的試劑盒；

(c5)檢測(cè)待測(cè)樣本中是否含有牛病毒腹瀉病毒和/或牛輪狀病毒；

(c6)制備用于檢測(cè)待測(cè)樣本中是否含有牛病毒腹瀉病毒和/或牛輪狀病毒的試劑盒。

本發(fā)明還保護(hù)含有所述引物組合的試劑盒；所述試劑盒的用途為如下(d1)-(d3)中的至少一種：

(d1)鑒別牛病毒腹瀉病毒和牛輪狀病毒；

(d2)檢測(cè)待測(cè)病原微生物是否為牛病毒腹瀉病毒或牛輪狀病毒；

(d3)檢測(cè)待測(cè)樣本中是否含有牛病毒腹瀉病毒和/或牛輪狀病毒。

本發(fā)明還保護(hù)所述試劑盒的制備方法，包括將各條引物單獨(dú)包裝的步驟。

本發(fā)明還保護(hù)一種鑒別牛病毒腹瀉病毒和牛輪狀病毒的方法，包括如下步驟：提取待測(cè)病毒的核酸；以所述核酸為模板，采用所述引物組合進(jìn)行二重?zé)晒鈘t-lamp，然后進(jìn)行如下判斷：如果能夠檢測(cè)到具有熒光基團(tuán)a對(duì)應(yīng)的熒光的擴(kuò)增產(chǎn)物、待測(cè)病毒為牛病毒腹瀉病毒，如果夠檢測(cè)到具有熒光基團(tuán)b對(duì)應(yīng)的熒光的擴(kuò)增產(chǎn)物、待測(cè)病毒為牛輪狀病毒。

所述方法中，當(dāng)所述熒光基團(tuán)a為fitc時(shí)，所述熒光基團(tuán)b為cy5.5時(shí)，如果所述擴(kuò)增產(chǎn)物可以在520nm的紫外光下觀察到綠色的dna片段、待測(cè)病毒為牛病毒腹瀉病毒，如果所述擴(kuò)增產(chǎn)物可以在670nm的紫外光下觀察到紅色的dna片段、待測(cè)病毒為牛輪狀病毒。

所述方法中，所述待測(cè)病毒為牛病毒腹瀉病毒或牛輪狀病毒。

本發(fā)明還保護(hù)一種檢測(cè)待測(cè)病原微生物是否為牛病毒腹瀉病毒或牛輪狀病毒的方法，包括如下步驟：提取待測(cè)病原微生物的核酸；以所述核酸為模板，采用所述引物組合進(jìn)行二重?zé)晒鈘t-lamp，然后進(jìn)行如下判斷：如果能夠檢測(cè)到具有熒光基團(tuán)a對(duì)應(yīng)的熒光的擴(kuò)增產(chǎn)物、待測(cè)病原微生物為牛病毒腹瀉病毒，如果夠檢測(cè)到具有熒光基團(tuán)b對(duì)應(yīng)的熒光的擴(kuò)增產(chǎn)物、待測(cè)病原微生物為牛輪狀病毒，如果不能檢測(cè)到具有熒光基團(tuán)a對(duì)應(yīng)的熒光的擴(kuò)增產(chǎn)物且不能檢測(cè)到具有熒光基團(tuán)b對(duì)應(yīng)的熒光的擴(kuò)增產(chǎn)物，待測(cè)病原微生物為非牛病毒腹瀉病毒且非牛輪狀病毒。

所述方法中，當(dāng)所述熒光基團(tuán)a為fitc時(shí)，所述熒光基團(tuán)b為cy5.5時(shí)，如果所述擴(kuò)增產(chǎn)物可以在520nm的紫外光下觀察到綠色的dna片段、待測(cè)病原微生物為牛病毒腹瀉病毒，如果所述擴(kuò)增產(chǎn)物可以在670nm的紫外光下觀察到紅色的dna片段、待測(cè)病原微生物為牛輪狀病毒，如果所述擴(kuò)增產(chǎn)物無(wú)法在520nm的紫外光下觀察到綠色的dna片段且無(wú)法在670nm的紫外光下觀察到紅色的dna片段、待測(cè)病原微生物為非牛病毒腹瀉病毒且非牛輪狀病毒。

所述方法中，所述待測(cè)病原微生物為牛支原體、牛病毒性腹瀉病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒、口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒、藍(lán)舌病病毒、牛輪狀病毒或小反芻獸疫病毒。

所述牛支原體具體可為牛支原體gl-1株。

所述牛病毒性腹瀉病毒具體可為牛病毒性腹瀉病毒oregon株或牛病毒性腹瀉病毒gx-041株(bvdv-2型)。

所述口蹄疫病毒具體可為口蹄疫病毒a型。

所述水泡性口炎病毒具體可為水泡性口炎病毒nj型或水泡性口炎病毒ind型。

所述藍(lán)舌病病毒具體可為藍(lán)舌病病毒血清4型。

所述牛輪狀病毒具體可為牛輪狀病毒ncdv株。

所述小反芻獸疫病毒具體可為小反芻獸疫病毒nigeria75/1株。

本發(fā)明還保護(hù)一種檢測(cè)待測(cè)樣本中是否含有牛病毒腹瀉病毒和/或牛輪狀病毒的方法，包括如下步驟：提取待測(cè)樣本的核酸；以所述核酸為模板，采用所述引物組合進(jìn)行二重?zé)晒鈘t-lamp，然后進(jìn)行如下判斷：如果能夠檢測(cè)到具有熒光基團(tuán)a對(duì)應(yīng)的熒光的擴(kuò)增產(chǎn)物、待測(cè)樣本中含有牛病毒腹瀉病毒，如果能夠檢測(cè)到具有熒光基團(tuán)b對(duì)應(yīng)的熒光的擴(kuò)增產(chǎn)物、待測(cè)樣本中含有牛輪狀病毒，如果能夠檢測(cè)到具有熒光基團(tuán)a對(duì)應(yīng)的熒光的擴(kuò)增產(chǎn)物且如果能夠檢測(cè)到具有熒光基團(tuán)b對(duì)應(yīng)的熒光的擴(kuò)增產(chǎn)物、待測(cè)樣本中含有牛病毒腹瀉病毒且含有牛輪狀病毒，如果不能檢測(cè)到具有熒光基團(tuán)a對(duì)應(yīng)的熒光的擴(kuò)增產(chǎn)物且不能檢測(cè)到具有熒光基團(tuán)b對(duì)應(yīng)的熒光的擴(kuò)增產(chǎn)物、待測(cè)樣本中不含有牛病毒腹瀉病毒且不含有牛輪狀病毒。

所述方法中，當(dāng)所述熒光基團(tuán)a為fitc時(shí)，所述熒光基團(tuán)b為cy5.5時(shí)，如果所述擴(kuò)增產(chǎn)物可以在520nm的紫外光下觀察到綠色的dna片段、待測(cè)樣本中含有牛病毒腹瀉病毒，如果所述擴(kuò)增產(chǎn)物可以在670nm的紫外光下觀察到紅色的dna片段、待測(cè)樣本中含有牛輪狀病毒，如果所述擴(kuò)增產(chǎn)物可以在520nm的紫外光下觀察到綠色的dna片段并且可以在670nm的紫外光下觀察到紅色的dna片段、待測(cè)樣本中含有牛病毒腹瀉病毒且含有牛輪狀病毒，如果所述擴(kuò)增產(chǎn)物無(wú)法在520nm的紫外光下觀察到綠色的dna片段并且無(wú)法在670nm的紫外光下觀察到紅色的dna片段、待測(cè)樣本中不含有牛病毒腹瀉病毒且不含有牛輪狀病毒。

所述方法中，所述待測(cè)樣本為離體的動(dòng)物組織，例如牛肉、牛肉加工制成的食品、牛內(nèi)臟，牛內(nèi)臟加工制成的食品等等。

以上任一所述核酸為dna、rna、或dna和rna的混合物。

以上任一所述提取待測(cè)樣本的核酸或待測(cè)病毒的核酸為使用rna/dna共提試劑盒提取得到的核酸。

以上任一所述二重?zé)晒鈘t-lamp的初始反應(yīng)體系為(25μl)：模板1μl、10×buffer2.5μl、bstdna聚合酶15u、amv逆轉(zhuǎn)錄酶20u、引物bvdv-fip-240pmol、引物bvdv-bip40pmol、引物brv-fip-240pmol、引物brv-bip40pmol、引物bvdv-f35pmol、引物bvdv-b35pmol、引物brv-f35pmol、引物brv-b35pmol，余量為水。

所述10×buffer的成分為：tris-hcl(ph8.8)200mm、kcl100mm、mgso480mm、(nh4)2so4100mm、1％(體積百分比)tween20、甜菜堿8m、dntps14m。

以上任一所述二重?zé)晒鈘t-lamp的反應(yīng)程序?yàn)椋?2℃20min，62℃90min，80℃5min。

本發(fā)明首次在lamp方法中引入了熒光基團(tuán)，建立了鑒定bvdv和brv的二重?zé)晒鈘t-lamp方法，通過(guò)擴(kuò)增產(chǎn)物顏色觀察可同時(shí)鑒別診斷兩種病毒。本發(fā)明建立的二重rt-lamp方法特異性好，能高效擴(kuò)增目的基因，而對(duì)其它病原核酸無(wú)擴(kuò)增，敏感性好，最低能檢測(cè)到100個(gè)混合模板拷貝/反應(yīng)，是一種簡(jiǎn)便，快速，低成本的診斷方法，適用于大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查。

附圖說(shuō)明

圖1為引物組i和引物組ii示意圖。

圖2為實(shí)施例3的結(jié)果。

圖3為實(shí)施例5的電泳結(jié)果。

圖4為實(shí)施例5的濁度檢測(cè)結(jié)果。

圖5為實(shí)施例6的結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

實(shí)施例中用到的各個(gè)毒株見(jiàn)表1。

表1

10×buffer：sigma公司。成分為：tris-hcl(ph8.8)200mm、kcl100mm、mgs0480mm、(nh4)2so4100mm、1％(體積百分比)tween20、甜菜堿8m、dntps14m。

bstdna聚合酶：newengland。

amv逆轉(zhuǎn)錄酶：takara。

peasy-t1載體：全世金生化科技(北京)有限公司。

牛腎細(xì)胞(mdbk)：中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

實(shí)施例1、引物組合的設(shè)計(jì)和制備

進(jìn)行大量序列分析、比對(duì)獲得了用于鑒別牛病毒腹瀉病毒(bvdv)和牛輪狀病毒(brv)的若干引物。將各個(gè)引物進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，比較靈敏度、特異性等性能，最終得到用于鑒別bvdv和brv的2套引物組。每套引物組由外引物f3、外引物b3、內(nèi)引物fip(flc+f2)和內(nèi)引物bip(blc+b2)組成。

用于鑒定bvdv的引物組由如下四條引物組成(5’→3’)：

bvdv-f3(序列表的序列1)：tgcccttagtaggactagca；

bvdv-b3(序列表的序列2)：agcaccctatcaggctgta；

bvdv-fip(序列表的序列3)：cgaaccactgacgactaccctgggtagcaacagtggtgagtt；

bvdv-bip(序列表的序列4)：caagcctcgagatgccacgtccgttttcacctgaacgacc；

在引物bvdv-fip的5’端連接熒光基團(tuán)fitc。

用于鑒定brv的引物組由如下四條引物組成(5’→3’)：

brv-f3(序列表的序列5)：actcatgtgcaataaacgc；

brv-b3(序列表的序列6)：gtttagtagaaactctatttcaacg；

brv-fip(序列表的序列7)：tctttctgcatctggtaaaagagtttaatacgcaacaatttgagca；

brv-bip(序列表的序列8)：ccaagagtgattaattcagctgacgggtctaagaatcactggattg；

在引物brv-fip的5’端連接熒光基團(tuán)cy5.5。

用于鑒定bvdv的引物組命名為引物組i，示意圖如圖1a所示。

用于鑒定bvdv的引物組命名為引物組ii，示意圖如圖1b所示。

上述各條引物組成引物組合。

實(shí)施例2、檢測(cè)方法的建立

1、采用rna/dna共提試劑盒提取待測(cè)樣本的核酸。

2、取步驟1得到的核酸作為模板，采用實(shí)施例1制備的引物組合進(jìn)行二重?zé)晒鈘t-lamp。

初始反應(yīng)體系為(25μl)：模板1μl、10×buffer2.5μl、bstdna聚合酶15u、amv逆轉(zhuǎn)錄酶20u、引物bvdv-fip40pmol、引物bvdv-bip40pmol、引物brv-fip40pmol、引物brv-bip40pmol、引物bvdv-f35pmol、引物bvdv-b35pmol、引物brv-f35pmol、引物brv-b35pmol，余量為水。

反應(yīng)程序?yàn)椋?2℃20min，62℃90min，80℃5min。

3、取步驟2的產(chǎn)物，進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，分別在波長(zhǎng)為520nm和670nm的紫外燈下觀察。

實(shí)施例3、特異性實(shí)驗(yàn)

待測(cè)樣本為：表1中的牛病毒性腹瀉病毒oregon株、牛病毒性腹瀉病毒gx-041株(bvdv-2型)、牛輪狀病毒ncdv株、牛病毒性腹瀉病毒oregon株和牛輪狀病毒ncdv株的混合物(混合物i)、口蹄疫病毒a型、水泡性口炎病毒nj型、水泡性口炎病毒ind型、藍(lán)舌病病毒血清4型、小反芻獸疫病毒nigeria75/1株、牛傳染性鼻氣管炎病毒和牛支原體gl-1株。

按照實(shí)施例2建立的方法進(jìn)行檢測(cè)。

設(shè)置用ddh20作為模板作為待測(cè)樣本的空白對(duì)照。

設(shè)置用牛腎細(xì)胞(mdbk)的核酸作為待測(cè)樣本的陰性對(duì)照。

結(jié)果如圖2所示。圖2a為520nm通道的電泳圖，條帶為黃綠色。圖2b為670nm通道的電泳結(jié)果，條帶為大紅色。圖2c為520nm和670nm雙通道的電泳結(jié)果，條帶為紅綠混合色。泳道1對(duì)應(yīng)牛病毒性腹瀉病毒oregon株，泳道2對(duì)應(yīng)牛病毒性腹瀉病毒gx-041株(bvdv-2型)，泳道3對(duì)應(yīng)牛輪狀病毒ncdv株，泳道4對(duì)應(yīng)牛病毒性腹瀉病毒oregon株和牛輪狀病毒ncdv株的混合物(混合物i)，泳道5對(duì)應(yīng)口蹄疫病毒a型，泳道6對(duì)應(yīng)水泡性口炎病毒nj型，泳道7對(duì)應(yīng)水泡性口炎病毒ind型，泳道8對(duì)應(yīng)藍(lán)舌病病毒血清4型，泳道9對(duì)應(yīng)小反芻獸疫病毒nigeria75/1株，泳道10對(duì)應(yīng)牛傳染性鼻氣管炎病毒，泳道11對(duì)應(yīng)牛支原體gl-1株，泳道12對(duì)應(yīng)空白對(duì)照，泳道13對(duì)應(yīng)陰性對(duì)照。

結(jié)果表明，采用實(shí)施例2建立的方法只擴(kuò)增bvdv和brv核酸，以及bvdv和brv混合模板。bvdv陽(yáng)性呈黃綠色，僅在520通道下能看到；brv陽(yáng)性呈紅色，僅在670通道下能看到；bvdv和brv混合模板呈紅綠混合色，且在520和670通道下都能觀察到。而對(duì)其它牛病毒和陰性對(duì)照均無(wú)擴(kuò)增，特異性好。

實(shí)施例4、標(biāo)準(zhǔn)品制備

bvdv標(biāo)準(zhǔn)品：將序列表的序列9所示的雙鏈dna分子與peasy-t1載體連接，得到重組質(zhì)粒，參照t7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(fermentas)說(shuō)明書(shū)將重組質(zhì)粒酶切線(xiàn)性化，用dna酶消除其中dna的污染，體外轉(zhuǎn)錄為rna，測(cè)定rna濃度，根據(jù)阿弗加德羅常數(shù)將濃度轉(zhuǎn)換為拷貝數(shù)，得到bvdv標(biāo)準(zhǔn)品。

brv標(biāo)準(zhǔn)品：將序列表的序列10所示的雙鏈dna分子與peasy-t1載體連接，得到重組質(zhì)粒，參照t7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(fermentas)說(shuō)明書(shū)將重組質(zhì)粒酶切線(xiàn)性化，用dna酶消除其中dna的污染，體外轉(zhuǎn)錄為rna，測(cè)定rna濃度，根據(jù)阿弗加德羅常數(shù)將濃度轉(zhuǎn)換為拷貝數(shù)，得到brv標(biāo)準(zhǔn)品。

實(shí)施例5、敏感性實(shí)驗(yàn)

1、將實(shí)施4制備的bvdv標(biāo)準(zhǔn)品和brv標(biāo)準(zhǔn)品等拷貝數(shù)混合，得到混合液。

2、用ddh2o10倍梯度稀釋步驟2得到的混合液，得到各個(gè)稀釋液。

3、將步驟2得到的稀釋液作為模板，采用實(shí)施例2建立的方法進(jìn)行檢測(cè)。

由于采用的稀釋液的稀釋度不同，形成如下不同的反應(yīng)體系：

反應(yīng)體系1中，bvdv標(biāo)準(zhǔn)品和brv標(biāo)準(zhǔn)品的初始濃度均為10⁶拷貝/μl；

反應(yīng)體系2中，bvdv標(biāo)準(zhǔn)品和brv標(biāo)準(zhǔn)品的初始濃度均為10⁵拷貝/μl；

反應(yīng)體系3中，bvdv標(biāo)準(zhǔn)品和brv標(biāo)準(zhǔn)品的初始濃度均為10⁴拷貝/μl；

反應(yīng)體系4中，bvdv標(biāo)準(zhǔn)品和brv標(biāo)準(zhǔn)品的初始濃度均為10³拷貝/μl；

反應(yīng)體系5中，bvdv標(biāo)準(zhǔn)品和brv標(biāo)準(zhǔn)品的初始濃度均為10²拷貝/μl；

反應(yīng)體系6中，bvdv標(biāo)準(zhǔn)品和brv標(biāo)準(zhǔn)品的初始濃度均為10拷貝/μl。

反應(yīng)體系7中，bvdv標(biāo)準(zhǔn)品和brv標(biāo)準(zhǔn)品的初始濃度均為1拷貝/μl。

設(shè)置用ddh2o作為模板作的空白對(duì)照。

結(jié)果如圖3所示。圖3a為520nm通道的電泳圖，條帶為黃綠色。圖3b為670nm通道的電泳結(jié)果，條帶為大紅色。圖3c為520nm和670nm雙通道的電泳結(jié)果，條帶為紅綠混合色。泳道1-7依次對(duì)應(yīng)反應(yīng)體系1-7，泳道8對(duì)應(yīng)空白對(duì)照。

將反應(yīng)產(chǎn)物使用實(shí)時(shí)濁度儀loopamla-320c生成650nm下的實(shí)時(shí)濁度圖，如圖4所示。曲線(xiàn)1-7依次對(duì)應(yīng)反應(yīng)體系1-7，曲線(xiàn)8對(duì)應(yīng)空白對(duì)照。

上述結(jié)果表明，采用實(shí)施例2建立的方法檢測(cè)bvdv和brv混合模板標(biāo)準(zhǔn)品，當(dāng)檢測(cè)體系中模板濃度低至100拷貝/μl時(shí)，也可以檢測(cè)出bvdv和brv，方法靈敏性高。

實(shí)施例6、干擾性實(shí)驗(yàn)

1、將實(shí)施4制備的bvdv標(biāo)準(zhǔn)品和brv標(biāo)準(zhǔn)品等拷貝數(shù)混合，得到混合液。

2、用ddh2o10倍梯度稀釋步驟2得到的混合液，得到各個(gè)稀釋液。

3、將步驟2得到的稀釋液作為模板，采用實(shí)施例2建立的方法進(jìn)行檢測(cè)。

由于采用的稀釋液的稀釋度不同，形成如下不同的反應(yīng)體系：

反應(yīng)體系1中，bvdv標(biāo)準(zhǔn)品的初始濃度均為10⁵拷貝/μl，brv標(biāo)準(zhǔn)品的初始濃度均為10²拷貝/μl；

反應(yīng)體系2中，bvdv標(biāo)準(zhǔn)品的初始濃度均為10⁷拷貝/μl，brv標(biāo)準(zhǔn)品的初始濃度均為10³拷貝/μl；

反應(yīng)體系3中，bvdv標(biāo)準(zhǔn)品的初始濃度均為10²拷貝/μl，brv標(biāo)準(zhǔn)品的初始濃度均為10⁶拷貝/μl；

反應(yīng)體系4中，bvdv標(biāo)準(zhǔn)品的初始濃度均為10³拷貝/μl，brv標(biāo)準(zhǔn)品的初始濃度均為10⁶拷貝/μl。

結(jié)果如圖5所示。圖5a為520nm通道的電泳圖，條帶為黃綠色。圖5b為670nm通道的電泳結(jié)果，條帶為大紅色。圖5c為520nm和670nm雙通道的電泳結(jié)果，條帶為紅綠混合色。泳道1-4依次對(duì)應(yīng)反應(yīng)體系1-4。

結(jié)果表明，對(duì)不同濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)一個(gè)模板濃度高而另一個(gè)模板濃度較低時(shí)，二重?zé)晒鈘t-lamp仍然可同時(shí)檢測(cè)到兩個(gè)模板，不影響彼此擴(kuò)增效率，干擾性小。

實(shí)施例7、臨床樣品檢測(cè)

待測(cè)樣本為：144份臨床樣本(腹瀉牛的糞便棉拭子)。

提取待測(cè)樣本的核酸，按照實(shí)施例2的方法進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)將陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序以驗(yàn)證結(jié)果的正確性。

采用實(shí)施例2的方法進(jìn)行檢測(cè)，共檢測(cè)出14份bvdv陽(yáng)性樣本和9份brv陽(yáng)性樣本。將陽(yáng)性樣本進(jìn)行測(cè)序，所有陽(yáng)性結(jié)果均為真陽(yáng)性，無(wú)非特異性擴(kuò)增的假陽(yáng)性。

<110>廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所

<120>用于鑒別牛病毒腹瀉病毒和牛輪狀病毒的引物組合及其應(yīng)用

<160>10

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

tgcccttagtaggactagca20

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

agcaccctatcaggctgta19

<210>3

<211>42

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

cgaaccactgacgactaccctgggtagcaacagtggtgagtt42

<210>4

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

caagcctcgagatgccacgtccgttttcacctgaacgacc40

<210>5

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

actcatgtgcaataaacgc19

<210>6

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

gtttagtagaaactctatttcaacg25

<210>7

<211>46

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

tctttctgcatctggtaaaagagtttaatacgcaacaatttgagca46

<210>8

<211>46

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

ccaagagtgattaattcagctgacgggtctaagaatcactggattg46

<210>9

<211>228

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>9

tgcccttagtaggactagcaaaacaaggagggtagcaacagtggtgagttcgttggatgg60

ctgaagccctgagtacagggtagtcgtcagtggttcgacgctttgtgcgacaagcctcga120

gatgccacgtggacgagggcatgcccacagcacatcttaacctgagcgggggtcgttcag180

gtgaaaacggtttaaccaaccgctacgaatacagcctgatagggtgct228

<210>10

<211>215

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>10

actcatgtgcaataaacgcgccagctaatacgcaacaatttgagcatattgtacagcttc60

gaggggtgttgactacagctacaataactcttttaccagatgcagaaagatttagttttc120

caagagtgattaattcagctgacggagcgactacatggtacttcaatccagtgattctta180

gaccaaataacgttgaaatagagtttctactaaac215