本申請是申請日為2014年12月16日、申請?zhí)枮?01480057477.1、發(fā)明名稱為“培養(yǎng)容器、淋巴細胞的培養(yǎng)方法、培養(yǎng)容器的制造方法和固相化裝置”的申請的分案申請。

本發(fā)明涉及細胞的培養(yǎng)技術，特別涉及用于培養(yǎng)淋巴細胞的培養(yǎng)容器、和淋巴細胞的培養(yǎng)方法、固相化有蛋白質的培養(yǎng)容器的制造方法和固相化裝置。

背景技術：

近年來，在醫(yī)藥品的生產(chǎn)、基因治療、再生醫(yī)療、免疫療法等領域中，要求在人工環(huán)境下高效地大量培養(yǎng)細胞和組織、微生物等。

這樣的狀況下，在包含透氣性膜的培養(yǎng)袋中封入細胞和培養(yǎng)液，在封閉系統(tǒng)中大量培養(yǎng)細胞。

但是，為了使淋巴細胞增殖，最初需要使淋巴細胞活化。因此，在固相化有抗cd3抗體的基材上使淋巴細胞活化，之后將活化的淋巴細胞封入培養(yǎng)袋進行增殖。

此時，一般如圖8所示，為了使淋巴細胞活化而使用在底面固相化有抗cd3抗體的燒瓶，在淋巴細胞被活化后，轉移至培養(yǎng)袋中，進行淋巴細胞的培養(yǎng)。這樣操作的理由是，由于淋巴細胞具有如下的性質：為了進行增殖，需要抗cd3抗體所致的刺激，另一方面，若持續(xù)受到抗cd3抗體所致的刺激，則會變得難以進行增殖。因此，在淋巴細胞活化后，需要在沒有固相化有抗cd3抗體的容器中進行培養(yǎng)。

作為用于使淋巴細胞活化的培養(yǎng)容器，例如可舉出專利文獻1所述的封閉系統(tǒng)細胞培養(yǎng)容器等。該封閉系統(tǒng)細胞培養(yǎng)容器在容器內(nèi)的整個面上固相化有抗cd3抗體(0048段、0057段)，能夠高效地使淋巴細胞活化。

另外，如上所述，淋巴細胞的活化一般使用抗cd3抗體來進行。即，在固相化有抗cd3抗體的容器內(nèi)進行淋巴細胞的活化，然后將活化了的淋巴細胞封入未固相化有抗cd3抗體的培養(yǎng)袋內(nèi)進行淋巴細胞的增殖。

因此，在活化淋巴細胞之前，在用于活化淋巴細胞的容器內(nèi)需要固相化(涂布)抗cd3抗體。

作為現(xiàn)有的固相化的方法，一般地說為：在含有抗cd3抗體的溶液中浸漬燒瓶內(nèi)的底面并將其靜置后，除去該溶液，由此進行抗cd3抗體的固相化。

具體地，例如專利文獻2中記載了：在燒瓶內(nèi)的底面均勻地浸漬抗cd3抗體，在冰箱中保存過夜后，去除抗cd3抗體，制備抗體固相化燒瓶(0035～0036段、圖1)。

另外，專利文獻1中記載了：將溶解有抗cd3抗體的溶解液封入容器的收容部，靜置規(guī)定時間，由此將抗cd3抗體固相化到容器的膜表面(0015段、圖1)。

專利文獻1：日本特開2007-175028號公報

專利文獻2：日本專利第4399710號公報

技術實現(xiàn)要素：

發(fā)明要解決的課題

然而，在僅使用專利文獻1中記載的封閉系統(tǒng)細胞培養(yǎng)容器進行淋巴細胞培養(yǎng)的情況下，在淋巴細胞活化后也會持續(xù)受到抗cd3抗體所致的刺激，因此淋巴細胞受到過量刺激而使增殖受到抑制。因此，為了大量高效地培養(yǎng)淋巴細胞，期望使用該封閉系統(tǒng)細胞培養(yǎng)容器作為活化專用容器，在另外的培養(yǎng)容器中進行細胞的增殖。

因此，該現(xiàn)有技術在要大量高效地培養(yǎng)淋巴細胞的情況下，存在轉移活化了的細胞的繁雜性、產(chǎn)生污染風險的問題。

因此，本發(fā)明人等經(jīng)過廣泛深入的研究開發(fā)了一種用于培養(yǎng)淋巴細胞的培養(yǎng)容器，其包含透氣性膜，僅在相對的容器內(nèi)表面的一個面固相化有抗cd3抗體，，具有固相化面和非固相化面。而且，以使固相化面成為底面的方式配置培養(yǎng)容器進行淋巴細胞的活化，然后以使非固相化面成為底面的方式配置培養(yǎng)容器進行淋巴細胞的增殖，由此能夠成功地在單一的容器內(nèi)高效地進行淋巴細胞的活化和增殖。

即，本發(fā)明的目的在于提供能夠通過單一的培養(yǎng)容器高效地進行淋巴細胞的活化和增殖的培養(yǎng)容器、和淋巴細胞的培養(yǎng)方法。

另外，專利文獻1、2中記載的現(xiàn)有固相化方法中存在如下的問題：為了使抗體充分地固相化而需要很長的靜置時間。

進一步，現(xiàn)有方法中存在如下的問題：由于大部分抗體未吸附到容器內(nèi)而殘留在溶液中，因此必須使用量大于固相化量的抗體。例如如后所述存在如下的問題：在將通過現(xiàn)有方法封入有抗體的容器靜置1小時的情況下，吸附到容器內(nèi)的抗體為10％左右，其余約90％未固相化于容器而被廢棄。

在此，抗體等蛋白質不耐熱，若在高溫條件下使其進行吸附，則其功能喪失，因此是不易固相化于容器的材料。另一方面，期望使用少量蛋白質在短時間內(nèi)實現(xiàn)必要量的固相化。另外，抗體一般而言是高價的，因此期望降低無端廢棄的量。

因此，本發(fā)明人等經(jīng)過廣泛深入的研究發(fā)現(xiàn)，通過將蛋白質溶液的液滴與氣體一起封入到容器內(nèi)、并使該液滴在容器內(nèi)表面上移動，由此可將集中在液滴的氣液界面的蛋白質分子高效地吸附于容器，從而完成了本發(fā)明。

即，本發(fā)明的目的在于提供一種培養(yǎng)容器的制造方法，在要將蛋白質固相化于容器內(nèi)表面時，將蛋白質溶液的液滴與氣體一起封入到容器內(nèi)、并使該液滴在容器內(nèi)表面上移動，由此將蛋白質高效地固相化于容器。本發(fā)明的目的還在于提供用于進行上述方法的固相化裝置。

解決課題的方法

為了達成上述目的，本發(fā)明的培養(yǎng)容器為用于培養(yǎng)淋巴細胞的培養(yǎng)容器，包含透氣性膜，僅在相對的容器內(nèi)表面的一個面固相化有抗體，具有固相化面和非固相化面，上述固相化面中，以10～300ng/cm²的濃度固相化有抗cd3抗體。

另外，本發(fā)明的淋巴細胞的培養(yǎng)方法為使用了上述培養(yǎng)容器的淋巴細胞的培養(yǎng)方法，是具有如下工序的方法：活化工序，在上述培養(yǎng)容器中封入淋巴細胞和培養(yǎng)液，以使上述培養(yǎng)容器中的上述固相化面成為底面的方式配置上述培養(yǎng)容器，使淋巴細胞活化；和增殖工序，將上述培養(yǎng)容器反轉，以使上述培養(yǎng)容器中的上述非固相化面成為底面的方式配置上述培養(yǎng)容器，使淋巴細胞擴增。

另外，本發(fā)明的培養(yǎng)容器的制造方法為固相化有蛋白質的培養(yǎng)容器的制造方法，是如下的方法：在上述培養(yǎng)容器中注入溶解有上述蛋白質的液滴，使上述液滴移動到上述培養(yǎng)容器的內(nèi)表面上的一部分或全部。

另外，本發(fā)明的固相化裝置為將蛋白質固相化于培養(yǎng)容器的內(nèi)表面的固相化裝置，其構成在于具備：裝載臺，載置溶解有蛋白質的液滴和培養(yǎng)容器；以及驅動單元，移動裝載臺，使培養(yǎng)容器內(nèi)的液滴在培養(yǎng)容器的內(nèi)表面上移動。

發(fā)明效果

根據(jù)本發(fā)明，能夠僅通過單一的培養(yǎng)容器在不使用專用的培養(yǎng)裝置等的情況下高效地進行淋巴細胞的活化和增殖。因此，能夠排除更換的繁雜性、并排除污染的風險，所述更換是用于防止抗體所致的對淋巴細胞的過量刺激的操作。另外，根據(jù)本發(fā)明，能夠提供將蛋白質高效地固相化于容器的培養(yǎng)容器的制造方法、和用于進行該方法的固相化裝置。

附圖說明

圖1為示出本發(fā)明的實施方式所涉及的培養(yǎng)容器的圖。

圖2為示出將本發(fā)明的實施方式所涉及的培養(yǎng)容器在使容器內(nèi)表面貼合的狀態(tài)下保存時的抗體的移動結果的圖表的圖。

圖3a為示出本發(fā)明的實施方式所涉及的培養(yǎng)容器的保存形態(tài)的圖。

圖3b為示出本發(fā)明的實施方式所涉及的培養(yǎng)容器的保存形態(tài)的圖。

圖4為示出本發(fā)明的第一實施方式所涉及的淋巴細胞的培養(yǎng)方法的圖。

圖5為示出本發(fā)明的第二實施方式所涉及的淋巴細胞的培養(yǎng)方法的圖。

圖6為示出本發(fā)明的實施方式所涉及的培養(yǎng)容器、和淋巴細胞的培養(yǎng)方法的實施例和比較例的示意圖。

圖7為示出本發(fā)明的實施方式所涉及的培養(yǎng)容器、和淋巴細胞的培養(yǎng)方法的實施例和比較例的實驗結果的圖表的圖。

圖8為示出現(xiàn)有的淋巴細胞的培養(yǎng)方法的圖。

圖9為用于說明本發(fā)明的實施方式所涉及的培養(yǎng)容器的制造方法中的固相化的原理的圖。

圖10為示出通過本發(fā)明的實施方式所涉及的培養(yǎng)容器的制造方法而得到的抗體固相化培養(yǎng)袋的圖。

圖11為示出本發(fā)明的實施方式所涉及的固相化裝置的圖(俯視圖)。

圖12為示出本發(fā)明的實施方式所涉及的固相化裝置的圖(主視圖)。

圖13為示出利用本發(fā)明的實施方式所涉及的固相化裝置的固相化的樣子的圖。

圖14為示出本發(fā)明的實施方式所涉及的固相化裝置中的保持單元的圖(主視圖和側視圖)。

圖15為示出本發(fā)明的實施方式所涉及的固相化裝置中的保持單元的使用形態(tài)的圖。

圖16為示出本發(fā)明的實施方式所涉及的培養(yǎng)容器(抗體固相化培養(yǎng)袋)的制造方法的實施例和比較例的示意圖。

圖17為示出本發(fā)明的實施方式所涉及的培養(yǎng)容器(抗體固相化培養(yǎng)袋)的制造方法的實施例和比較例的實驗結果的圖表的圖。

圖18為示出本發(fā)明的實施方式所涉及的培養(yǎng)容器(抗體固相化燒瓶)的制造方法的實施例和比較例的示意圖。

圖19為示出本發(fā)明的實施方式所涉及的培養(yǎng)容器(抗體固相化燒瓶)的制造方法的實施例和比較例的實驗結果的圖表的圖。

圖20為示出本發(fā)明的實施方式所涉及的培養(yǎng)容器(纖連蛋白固相化培養(yǎng)袋)的制造方法的實施例和比較例的示意圖。

圖21為示出本發(fā)明的實施方式所涉及的培養(yǎng)容器(纖連蛋白固相化培養(yǎng)袋)的制造方法的實施例和比較例的實驗結果的圖表的圖。

具體實施方式

以下對本發(fā)明的培養(yǎng)容器、和淋巴細胞的培養(yǎng)方法的實施方式詳細地進行說明。首先，參照圖1對本發(fā)明的培養(yǎng)容器的一個實施方式進行說明。該圖中示出將培養(yǎng)容器載置于裝載臺(未圖示)后從上方觀察的簡圖、和從側面觀察的簡圖。

[培養(yǎng)容器]

如圖1所示，本發(fā)明的實施方式所涉及的培養(yǎng)容器10具有上下相對的容器壁。而且，容器內(nèi)表面的一面成為固相化有抗體20的固相化面11(圖1的容器內(nèi)的底面)。另外，容器內(nèi)表面的另一面成為未固相化有抗體20的非固相化面12(圖1的容器內(nèi)的頂面)。此外，培養(yǎng)容器10具備管13，由此進行淋巴細胞和培養(yǎng)液向培養(yǎng)容器10內(nèi)的封入、和所培養(yǎng)的淋巴細胞和培養(yǎng)液的回收。該圖的例中，培養(yǎng)容器10具有1根管13，但也可以具有2根以上。

關于培養(yǎng)容器10，使用具有細胞培養(yǎng)所需要的透氣性的膜，并形成為袋狀(口袋型)。作為這樣的培養(yǎng)容器10的材料，可以適當?shù)厥褂镁垡蚁⒕郾┑染巯N類樹脂。

作為固相化于固相化面11的抗體20，優(yōu)選使用抗cd3抗體。淋巴細胞可以被抗cd3抗體活化并進行增殖。

固相化面11中的抗體20的固相化濃度優(yōu)選設為10～300ng/cm²，更優(yōu)選設為10～40ng/cm²。

這是因為，若使抗體20的固相化濃度為10ng/cm²以上，則能夠有效地使淋巴細胞活化，然后能夠高效地使淋巴細胞增殖。另外是因為，即使使抗體20的固相化濃度大于40ng/cm²，在淋巴細胞的增殖效率方面也沒有顯著的差異，且過量使用抗體會導致容器成本的增大。

固相化面11中的抗cd3抗體的最密填充濃度為300ng/cm²，若為該濃度范圍之內(nèi)，則能夠充分地使淋巴細胞活化，然后高效地使淋巴細胞增殖。另一方面，若抗cd3抗體的固相化濃度超過300ng/cm²，則抗cd3抗體漂浮在培養(yǎng)容器10內(nèi)的培養(yǎng)液中，有時對淋巴細胞造成過量的刺激，因此不優(yōu)選。

本實施方式的培養(yǎng)容器10例如可以如下所示地進行制造。

首先，使用塑料擠出成形裝置將低密度聚乙烯擠出成形，形成膜。然后，使用脈沖熱封機由該膜制造袋狀的培養(yǎng)容器10。如圖1所示，培養(yǎng)容器10以裝有管13的方式進行制造。

然后，將培養(yǎng)容器10載置于裝載臺，封入規(guī)定量的氣體，并且接著封入溶解有抗體20的緩沖液。然后，通過搖動培養(yǎng)容器10等方式，使緩沖液的液滴在培養(yǎng)容器10內(nèi)的底面上移動，使緩沖液中含有的抗體20附著到培養(yǎng)容器10內(nèi)的底面上。由此，使抗體20僅附著于培養(yǎng)容器10內(nèi)的底面，形成固相化面11。此時，培養(yǎng)容器10內(nèi)的頂面以未附著有抗體20的非固相化面12的形式形成。

然后，對本實施方式的培養(yǎng)容器10的保存形態(tài)進行說明。

本實施方式的培養(yǎng)容器10優(yōu)選以使固相化面11與非固相化面12不接觸的形態(tài)保持而保存。

即，在以使固相化面11與非固相化面12接觸的形態(tài)下、以1.6kg的載荷、37℃的條件將培養(yǎng)容器10保持2小時的情況下，如圖2所示，約2成的抗體20從固相化面11轉移至非固相化面12。在淋巴細胞活化后進行增殖時，這樣地移動到非固相化面12的抗體20對淋巴細胞造成過量刺激，從而成為使增殖率降低的主要原因。因此，優(yōu)選盡可能抑制抗體20從固相化面11向非固相化面12的移動。

因此，在保存本實施方式的培養(yǎng)容器10時，優(yōu)選在培養(yǎng)容器10中封入規(guī)定量的氣體來保持使固相化面11與非固相化面12不接觸的形態(tài)。

具體地，所封入的氣體的量優(yōu)選每1cm²的培養(yǎng)容器10內(nèi)的底面積為0.01～4ml。若使所封入的氣體的量為這樣的范圍，則能夠防止固相化面11與非固相化面12接觸。

作為所封入的氣體，沒有特別限定，但優(yōu)選設為不活潑氣體，可以使用空氣、氮氣等。例如可以利用氣體供給裝置經(jīng)由管13將這樣的氣體注入到培養(yǎng)容器10。

作為本實施方式的培養(yǎng)容器10的具體保存形態(tài)，如圖3a所示，優(yōu)選利用具有剛性的外裝容器60來保持培養(yǎng)容器10的形狀。在使用這樣的外裝容器60來保存培養(yǎng)容器10時，僅將少量的氣體封入到培養(yǎng)容器10中，就能夠以不使抗體20轉移的方式保存培養(yǎng)容器10。

另外，如圖3b所示，也優(yōu)選用氣體使培養(yǎng)容器10成為膨脹狀態(tài)并利用包裝容器70進行保存。這樣一來，可以簡易地包裝多個培養(yǎng)容器10，從而以使抗體20不轉移的方式進行保存。

如以上所說明的，本實施方式的培養(yǎng)容器10由透氣性膜構成，僅在相對的容器內(nèi)表面的一個面固相化有抗體20，具有固相化面11和非固相化面12。另外，封入到培養(yǎng)容器10中的淋巴細胞聚集到容器內(nèi)的底部。

因此，在活化淋巴細胞時，以使固相化面11成為底面的方式使用培養(yǎng)容器10，在淋巴細胞增殖時，以使非固相化面12成為底面的方式使用培養(yǎng)容器10，由此可以防止抗體20對淋巴細胞的過量刺激，可以在單一的容器內(nèi)高效地進行淋巴細胞的活化和增殖。其結果是，能夠排除繁雜的轉移、污染的風險。另外，從活化到增殖的工序轉變?yōu)榉崔D容器的簡單操作，因此可以在不使用專用裝置等的情況下簡便地進行。

另外，通過在本實施方式的培養(yǎng)容器10中封入規(guī)定量的氣體來保持使固相化面11與非固相化面12不接觸的形態(tài)，由此能夠在不降低過量刺激淋巴細胞的防止效果的情況下保存培養(yǎng)容器10。

此外，現(xiàn)有的淋巴細胞的活化中使用的燒瓶中，僅在底面固相化有抗cd3抗體，由此能夠使淋巴細胞活化。然而，燒瓶無法以單一容器用于淋巴細胞活化后的增殖工序。其理由在于，燒瓶存在無法使單位面積的細胞數(shù)維持在適當密度的問題。即，為了使淋巴細胞在活化后進行增殖，需要擴大培養(yǎng)面積。若為本實施方式，則例如通過用夾子或輥將培養(yǎng)容器的一部分間隔，并配合著細胞的增殖移動或除去夾子或輥等，由此能夠將培養(yǎng)面積擴大，但是由于燒瓶中無法進行這樣的操作，因此雖然燒瓶能夠用于淋巴細胞的活化，但不適于增殖。

[淋巴細胞的培養(yǎng)方法(第一實施方式)]

然后，參照圖4對本發(fā)明的淋巴細胞的培養(yǎng)方法的第一實施方式進行說明。如該圖所示，本實施方式的淋巴細胞的培養(yǎng)方法具有(1)活化工序、和(2)增殖工序。

(1)活化工序

本實施方式的淋巴細胞的培養(yǎng)方法中的活化工序為如下的工序：在培養(yǎng)容器10中封入淋巴細胞30和培養(yǎng)液40，以使固相化面11成為底面的方式配置培養(yǎng)容器10，使淋巴細胞30活化。

如上所述，固相化面11中固相化有抗體20，作為該抗體20，適合使用抗cd3抗體。

淋巴細胞30的種類沒有特別限制，可以將nk細胞、b細胞、t細胞和單核細胞等作為培養(yǎng)對象。

培養(yǎng)液40可以使用淋巴細胞30的培養(yǎng)中一般使用的培養(yǎng)液，例如可以適合地使用添加了白介素-2的培養(yǎng)液等。

該活化工序中，對于培養(yǎng)容器10內(nèi)的淋巴細胞30而言，其受體分子cd3被固相化在固相化面11上的抗cd3抗體刺激，從而被活化。

(2)增殖工序

本實施方式的淋巴細胞的培養(yǎng)方法中的增殖工序為如下的工序：將培養(yǎng)容器10反轉，以使非固相化面12成為底面的方式配置培養(yǎng)容器10，使淋巴細胞30擴增。

通過這樣地以使非固相化面12成為底面的方式配置培養(yǎng)容器10，由此能夠在培養(yǎng)容器10內(nèi)的非固相化面12側培養(yǎng)淋巴細胞30。

由此，能夠在不受到來自于固相化在固相化面11上的抗cd3抗體的刺激的情況下使淋巴細胞30增殖。因此，能夠防止淋巴細胞30受到來自抗cd3抗體的過量刺激時產(chǎn)生的增殖效率降低。

[淋巴細胞的培養(yǎng)方法(第二實施方式)]

然后，參照圖5對本發(fā)明的淋巴細胞的培養(yǎng)方法的第二實施方式進行說明。如該圖所示，本實施方式的淋巴細胞的培養(yǎng)方法具有(1)活化工序、(2)第一增殖工序、(3)容積擴大工序和(4)第二增殖工序。

即，本實施方式的淋巴細胞的培養(yǎng)方法在增殖工序的過程中具有容積擴大工序，由此，與第一實施方式相比能夠進一步提高淋巴細胞的增殖效率。因此，本實施方式中，將增殖工序細分為上述(2)～(4)的3個工序并進行說明。關于其他方面，可以與第一實施方式相同。

(1)活化工序

本實施方式的淋巴細胞的培養(yǎng)方法中的活化工序中，首先使用間隔構件50將培養(yǎng)容器10隔開，由此將其區(qū)分為培養(yǎng)部10-1和能夠擴大部10-2。

培養(yǎng)部10-1為封入淋巴細胞30和培養(yǎng)液40、并進行淋巴細胞30的活化的室。

能夠擴大部10-2為未封入有淋巴細胞30和培養(yǎng)液40的室，作為用于伴隨淋巴細胞30的增殖將培養(yǎng)部10-1擴大的空間使用。

淋巴細胞30和培養(yǎng)液40無法通過培養(yǎng)部10-1與能夠擴大部10-2之間。

在此，細胞一般具有如下性質：在培養(yǎng)初期若不具有一定以上的細胞密度，則難以進行增殖。因此，優(yōu)選以使培養(yǎng)部10-1的容積在培養(yǎng)初期小，然后增大的方式進行調整。

另外，圖5中示出如下的工序：使用夾子作為間隔構件50隔開培養(yǎng)容器10，然后除去該夾子使培養(yǎng)容器10內(nèi)的整體成為培養(yǎng)部10-1，但培養(yǎng)容器10的間隔方法并不限定于此。例如，也可以使用輥作為間隔構件50，來使培養(yǎng)部10-1能夠連續(xù)地變更，也能夠將培養(yǎng)部10-1多次變更為任意大小。

然后，在培養(yǎng)容器10中的培養(yǎng)部10-1中封入淋巴細胞30和培養(yǎng)液40，以使培養(yǎng)部10-1中的固相化面11成為底面的方式配置培養(yǎng)容器10，使淋巴細胞30活化。

該活化工序中，培養(yǎng)部10-1內(nèi)的淋巴細胞30被固相化在固相化面11上的抗cd3抗體活化。

(2)第一增殖工序

然后，將培養(yǎng)容器10反轉，以使非固相化面12成為底面的方式配置培養(yǎng)容器10，使淋巴細胞30擴增。

即，以使非固相化面12成為底面的方式配置培養(yǎng)容器10，由此能夠在培養(yǎng)部10-1中的非固相化面12側培養(yǎng)淋巴細胞30，從而能夠在不受到來自固相化于固相化面11的抗cd3抗體的刺激的情況下使淋巴細胞30增殖。因此，能夠在單一的容器內(nèi)使淋巴細胞高效地增殖。

(3)容積擴大工序

容積擴大工序為如下的工序：通過移動或除去間隔構件50，由此將培養(yǎng)部10-1的容積擴大。

由此，能夠根據(jù)所增殖的淋巴細胞30的細胞數(shù)來調整培養(yǎng)部10-1的容積。因此，能夠更進一步地提高淋巴細胞30的增殖效率。

(4)第二增殖工序

第二增殖工序為如下的工序：在將培養(yǎng)容器10中的培養(yǎng)部10-1擴大的狀態(tài)下連續(xù)進行淋巴細胞30的培養(yǎng)。此時，培養(yǎng)容器10為以使非固相化面12成為底面的方式配置的狀態(tài)。

由此，能夠在不受到來自于固相化在固相化面11上的抗cd3抗體的刺激的情況下使淋巴細胞30增殖，并且能夠防止由于培養(yǎng)部10-1內(nèi)的淋巴細胞30的密度過高造成淋巴細胞30的增殖效率降低的情況。

此外，也能夠使用多個夾子、輥作為間隔構件50并多次重復(3)和(4)，從而階段性進行培養(yǎng)部10-1的容積擴大。

如以上所說明的，根據(jù)本發(fā)明的實施方式所涉及的淋巴細胞的培養(yǎng)方法，可以使用本發(fā)明的實施方式所涉及的培養(yǎng)容器10，以使固相化面11成為底面的方式配置來進行淋巴細胞30的活化，然后，以使非固相化面12成為底面的方式配置來進行淋巴細胞30的增殖。

因此，能夠防止淋巴細胞30受到來自抗體20的過量刺激，能夠在單一的容器內(nèi)高效地進行淋巴細胞30的活化和增殖。

另外，能夠根據(jù)所增殖的淋巴細胞30的細胞數(shù)來調整培養(yǎng)容器10中的培養(yǎng)部10-1的容積，能夠更進一步地提高淋巴細胞30的增殖效率。

然后，對本發(fā)明的培養(yǎng)容器的制造方法、和固相化裝置的一個實施方式詳細地進行說明。

[培養(yǎng)容器的制造方法]

本實施方式的培養(yǎng)容器的制造方法的特征在于，為固相化有蛋白質的培養(yǎng)容器的制造方法，在培養(yǎng)容器中注入溶解有所述蛋白質的液滴(drop)，使液滴移動到培養(yǎng)容器的內(nèi)表面上的一部分或全部。

首先，參照圖9對本實施方式的培養(yǎng)容器的制造方法中的、能夠使蛋白質高效地固相化于培養(yǎng)容器的內(nèi)表面的原理進行說明。

靜置溶解有蛋白質的溶液時，蛋白質具有吸附于該溶液的氣液界面的性質(bunsekikagakuvol.59，no.6.pp.437-445(2010))。因此，本實施方式的培養(yǎng)容器的制造方法中，使溶解有蛋白質的液滴在基材上移動，并使集中在氣液界面的蛋白質分子積極地與基材接觸。

這樣地，在容器內(nèi)滾動液滴，使氣液界面在容器內(nèi)移動，由此在氣體、液體、材料的界線上，蛋白質吸附于基材。蛋白質吸附于基材時，液滴中的蛋白質吸附于新生的氣液界面。而且，液滴在容器內(nèi)表面上移動時，通過蛋白質濃度高的氣液界面與容器內(nèi)表面的接觸，蛋白質以高概率吸附到容器內(nèi)表面。

由此，根據(jù)本實施方式的培養(yǎng)容器的制造方法，能夠使蛋白質高效地固相化于容器內(nèi)表面。

另外，例如在使蛋白質僅固相化于容器底面的情況下，也能夠防止蛋白質向容器頂面的吸附所致的蛋白質的損失。

本實施方式中，培養(yǎng)容器是指細胞培養(yǎng)中使用的整個容器，包括細胞活化和/或細胞增殖中使用的容器。

本實施方式中的培養(yǎng)容器的形態(tài)沒有特別限制，可以適當?shù)厥褂糜绍洶b材料構成的袋狀的培養(yǎng)袋、玻璃或聚苯乙烯制的燒瓶等。

例如，可以適當?shù)厥褂迷谌萜鲀?nèi)表面具有相對的容器壁的培養(yǎng)袋，使蛋白質固相化于該培養(yǎng)袋的內(nèi)表面的一面或兩面中的一部分或全部，從而可以制造本實施方式中的培養(yǎng)容器。

具體地，如圖10所示，可以使培養(yǎng)袋100中的相對的內(nèi)表面的一個面為固相化有蛋白質200的固相化面110(圖10的容器內(nèi)底面)，使培養(yǎng)袋內(nèi)表面的另一個面為未固相化有蛋白質200的非固相化面120(圖10的容器內(nèi)頂面)。

此外，培養(yǎng)袋100具備管130，經(jīng)由該管130，可以向培養(yǎng)袋100內(nèi)導入溶解有蛋白質的液滴和氣體，或者將它們除去。該圖的例中，培養(yǎng)袋100具有2根管130，但也可以具有1根或3根以上。

另外，培養(yǎng)袋100優(yōu)選使用具有細胞培養(yǎng)所需要的透氣性的膜來形成。作為這樣的培養(yǎng)袋100的材料，可以適當?shù)厥褂镁垡蚁┖途郾┑染巯N類樹脂。

本實施方式中，作為固相化于培養(yǎng)袋100的蛋白質200，沒有特別限制，例如可以使用抗cd3抗體等抗體、或者纖連蛋白、膠原、層粘連蛋白等細胞粘附性蛋白?？筩d3抗體適合用于使淋巴細胞活化。另外，細胞粘附性蛋白適合用于使粘附性細胞高效地粘附到培養(yǎng)基材上。

在要將作為蛋白質200的抗cd3抗體固相化的情況下，抗cd3抗體的固相化濃度優(yōu)選設為10～300ng/cm²。這是因為，若使抗cd3抗體的固相化濃度為10ng/cm²以上，則能夠有效地使淋巴細胞活化，然后能夠高效地使淋巴細胞增殖。另一方面，若抗cd3抗體的固相化濃度大于300ng/cm²，則抗cd3抗體漂浮在培養(yǎng)袋100內(nèi)的培養(yǎng)液中，有時對淋巴細胞造成過量的刺激，因此不優(yōu)選。

作為本實施方式中的溶解蛋白質的液滴，沒有特別限定，但可以適當?shù)厥褂昧姿峋彌_液。

另外，本實施方式中的溶解有蛋白質的液滴的大小(液滴量)優(yōu)選設為1cc～20cc。這是因為，當液滴在培養(yǎng)袋100的內(nèi)表面移動時，在液滴與內(nèi)表面之間產(chǎn)生摩擦力，因此若液滴的大小過小，則無法適宜地進行移動。另外，若液滴過大，則液滴中的蛋白質濃度降低，并且液滴的每單位體積的氣液界面的面積減少，因此吸附效率降低。從這樣的觀點出發(fā)，更優(yōu)選將液滴的大小設為1cc～10cc，進一步優(yōu)選設為1cc～5cc，更進一步優(yōu)選設為2cc左右。

本實施方式中，作為封入到培養(yǎng)袋100的氣體，沒有特別限定，但優(yōu)選設為不活潑氣體，可以使用空氣、氮氣等。例如可以利用氣體供給裝置經(jīng)由管130將這樣的氣體注入到培養(yǎng)容器100。

另外，封入到培養(yǎng)袋100的氣體的量更優(yōu)選設為每1cm²的培養(yǎng)袋100內(nèi)的底面積為0.1～4ml，進一步優(yōu)選設為1～3ml。若使所封入的氣體的量為這樣的范圍，則能夠防止培養(yǎng)袋100的內(nèi)表面中相對的容器壁發(fā)生接觸，因此能夠使溶解有蛋白質200的液滴在培養(yǎng)袋100內(nèi)高效地移動。

培養(yǎng)袋100例如可以如下所述地進行制造。

首先，使用塑料擠出成形裝置將低密度聚乙烯擠出成形，形成膜。然后，使用脈沖熱封機由該膜制造培養(yǎng)袋100。如圖10所示，培養(yǎng)袋100以裝有管130的方式進行制造。

然后，將培養(yǎng)袋100載置于裝載臺，封入規(guī)定量的氣體，并且接著封入溶解有蛋白質200的緩沖液。然后，通過搖動培養(yǎng)袋100等方式，使緩沖液的液滴在培養(yǎng)袋100內(nèi)的底面上移動。由此，可以使緩沖液中含有的蛋白質200附著到培養(yǎng)袋100內(nèi)的底面上，得到固相化有蛋白質200的培養(yǎng)袋100。

[固相化裝置]

然后，參照圖11～圖15對能夠在本實施方式的培養(yǎng)容器的制造方法中適當?shù)厥褂玫谋緦嵤┓绞降墓滔嗷b置、和該固相化裝置中使用的保持構件進行說明。圖11示出固相化裝置的俯視圖，圖12示出其主視圖。圖13示出利用固相化裝置的固相化的樣子。圖14示出保持單元的主視圖和側視圖，圖15示出保持單元的使用形態(tài)。

圖11中，下側示出固相化裝置300的正面?zhèn)?，上側示出固相化裝置300的背面?zhèn)龋髠仁境龉滔嗷b置300的左側，右側示出固相化裝置300的右側。另外，該圖中，將左右方向(后述的裝載臺的長邊方向)設為x軸方向，將上下方向(同裝載臺的短邊方向)設為y軸方向。

固相化裝置300具備x軸方向移動用支承臺310、和y軸方向移動用支承臺360。培養(yǎng)袋100中封入溶解有蛋白質的液滴和規(guī)定量的氣體后載置于y軸方向移動用支承臺360。這些x軸方向移動用支承臺310與y軸方向移動用支承臺360一體地進行運動。以下，有時將x軸方向移動用支承臺310和y軸方向移動用支承臺360總稱為裝載臺。

x軸方向移動用支承臺310通過固定于基臺400而立設的二個支承柱320在長邊方向的中央在正面?zhèn)群捅趁鎮(zhèn)冗@兩側得到支承。

另外，x軸方向移動用支承臺310經(jīng)由x軸方向移動用齒輪箱340與x軸方向移動用伺服電動機330(長邊方向移動用驅動單元)連接。

通過驅動該x軸方向移動用伺服電動機330，由此x軸方向移動用支承臺310能夠以y軸方向為中心軸左轉和右轉交替地進行旋轉運動。由此，x軸方向移動用支承臺310可以左右地進行所謂的蹺蹺板運動。

因此，載置于裝載臺的培養(yǎng)袋100內(nèi)的溶解有蛋白質的液滴可以在培養(yǎng)袋100內(nèi)從左端至右端左右地進行往復運動。

此時，x軸方向移動用支承臺310的旋轉運動的角度相對于水平方向可以設為例如-10°～+10°的范圍。此外，圖11、12中，將左側變高時稱作負(-)，將右側變高時稱作正(+)。

另外，x軸方向移動用支承臺310的旋轉運動的速度可以設為如下的速度：使培養(yǎng)袋100內(nèi)的溶解有蛋白質的液滴例如以5m/分鐘～15m/分鐘的速度在培養(yǎng)袋100內(nèi)進行移動的速度。

y軸原點限度檢測傳感器350用于檢測y軸的原點和限度。

y軸方向移動用支承臺360通過立設于x軸方向移動用支承臺310的左右端部的二個支承部在短邊方向的中央在左側和右側這兩側受到支承。

另外，y軸方向移動用支承臺360經(jīng)由y軸方向移動用齒輪箱380與y軸方向移動用伺服電動機370(短邊方向移動用驅動單元)連接。

通過驅動該y軸方向移動用伺服電動機370，由此y軸方向移動用支承臺360能夠與x軸方向移動用支承臺310一起以x軸方向為中心軸左轉和右轉交替地進行旋轉運動。由此，裝載臺可以左右地(圖11中為上下地)進行所謂的蹺蹺板運動。

因此，載置于裝載臺的培養(yǎng)袋100內(nèi)的溶解有蛋白質的液滴可以在培養(yǎng)袋100內(nèi)從下端至上端地進行移動。

此時，y軸方向移動用支承臺360的旋轉運動的角度相對于水平方向可以設為例如-50°～+50°的范圍。此外，圖11中，將正面?zhèn)茸兏邥r稱作負(-)，將背面?zhèn)茸兏邥r稱作正(+)。

另外，期望液滴沿y軸方向的移動每次以液滴的大小以下的距離進行。通過這樣地使液滴在y軸方向上移動、并且在x軸方向上在培養(yǎng)袋100內(nèi)從左端至右端地移動，由此能夠使液滴移動到培養(yǎng)袋100內(nèi)的整個底面，能夠使液滴中含有的蛋白質高效地吸附到培養(yǎng)袋100。

x軸原點限度檢測傳感器390用于檢測x軸的原點和限度。

然后，對使用了本實施方式的固相化裝置300的培養(yǎng)袋100的制造方法進行說明。

首先，將培養(yǎng)袋100載置于裝載臺后封入規(guī)定量的空氣，接著注入溶解有蛋白質的液滴。然后，驅動y軸方向移動用伺服電動機370，如圖13所示，以x軸方向為中心軸使裝載臺向正面?zhèn)刃D移動，使液滴移動到培養(yǎng)袋100內(nèi)的正面?zhèn)榷瞬俊?/p>

然后，驅動x軸方向移動用伺服電動機330，以y軸方向為中心軸，使裝載臺左右地旋轉運動，從而使液滴在培養(yǎng)袋100內(nèi)在左端與右端之間左右地移動。

然后，驅動y軸方向移動用伺服電動機370，使裝載臺向背面?zhèn)壬晕⑿D移動，使液滴向背面?zhèn)壬陨砸苿樱缓?，再次驅動x軸方向移動用伺服電動機330，使裝載臺左右地旋轉運動，從而使液滴在培養(yǎng)袋100內(nèi)在左端與右端之間左右地移動。重復進行以上的動作，直至液滴移動到培養(yǎng)袋100內(nèi)的背面?zhèn)榷瞬?，從而在左端與右端之間左右地移動。

這樣地使用固相化裝置300使蛋白質吸附到培養(yǎng)袋100內(nèi)，由此能夠進一步提高蛋白質的固相化效率。

此外，本實施方式的固相化裝置300不僅能夠適合地用于在培養(yǎng)袋100中將蛋白質固相化的情況，也能夠適合地用于在燒瓶、其他容器中將蛋白質固相化的情況。

然后，對本實施方式的固相化裝置中使用的保持構件進行說明。

保持構件為用于以使培養(yǎng)容器的底面形成半圓筒形狀的方式保持培養(yǎng)容器的構件，保持構件被固定于裝載臺，或者與裝載臺一體地形成。

如圖14所示，保持構件500具備主體部510、上蓋部520和擠壓部530。

主體部510具備用于使培養(yǎng)袋100彎曲地保持的半圓筒形狀的凹部510-1。上蓋部520覆蓋該凹部510-1地安裝于主體部510。上蓋部520向主體部510的安裝方法沒有特別限制，例如可以進行螺絲固定。

在上蓋部520安裝有用于從外面擠壓培養(yǎng)袋100的擠壓部530。通過使該擠壓部530向下方移動，由此對配置于主體部510的凹部510-1的培養(yǎng)袋100進行擠壓，從而能夠使培養(yǎng)袋100的底面穩(wěn)定地呈半圓筒形狀。

關于擠壓部530向上蓋部520的安裝，只要能夠使擠壓部530向下方移動從而擠壓培養(yǎng)袋100，則沒有特別限定，例如可以通過將上蓋部520與擠壓部530螺絲締合。

另外，擠壓部530的形狀并不限定為圖14所示的棒狀，也可以為其他形狀。例如，也優(yōu)選使擠壓部530的下方前端部分枝、或者為使下方呈曲面的半球狀，由此將培養(yǎng)袋100的底面進一步穩(wěn)定地維持為半圓筒形狀。

另外，圖14中示出在上蓋部520安裝了3個擠壓部530的狀態(tài)，但擠壓部530的安裝個數(shù)沒有特別限制，也可以為1個、2個或4個以上。

圖15示出保持構件500的使用形態(tài)，示出了使培養(yǎng)袋100保持于保持構件500的樣子。

首先，在保持構件500的主體部510的凹部510-1配置培養(yǎng)袋100。此時，以使培養(yǎng)袋100的底面沿凹部510-1成為曲而的方式進行配置。

然后，在主體部510安裝上蓋部520，使擠壓部530向下方移動。由此，能夠將培養(yǎng)袋100的底面維持為半圓筒形狀。

保持構件500以使凹部510-1的半圓筒形狀的中心軸的方向與裝載臺的長邊方向為相同方向的方式固定于固相化裝置300的裝載臺后使用。另外，也可以以這樣的位置關系將保持構件500與裝載臺一體地形成。

將培養(yǎng)袋100的底面維持為半圓筒形狀地保持于這樣的保持構件500、并使培養(yǎng)袋100內(nèi)的液滴沿y軸方向移動時，液滴通常位于保持構件500中凹部510-1的最下部，因此能夠精密地控制液滴在y軸方向上的移動。

如以上所說明的，根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)容器的制造方法，能夠將蛋白質高效地固相化于培養(yǎng)容器內(nèi)表面，能夠縮短固相化所需要的時間，并能夠提高向培養(yǎng)容器的吸附率，能夠以少量的蛋白質進行必要量的固相化。因此，能夠降低未固相化而被廢棄的蛋白質量。另外，通過使用本實施方式的固相化裝置，能夠更進一步提高蛋白質的固相化效率。進一步，通過使用保持構件，能夠更精密地控制液滴的移動，能夠更進一步提高蛋白質的固相化效率。

實施例

以下參照圖6和圖7對本發(fā)明的實施方式所涉及的培養(yǎng)容器、和淋巴細胞的培養(yǎng)方法的實施例和比較例進行說明。圖6為示出實施例和比較例的示意圖，圖7為示出實施例和比較例的實驗結果的圖表的圖。此外，圖6為用于示出實施例和比較例的區(qū)別的圖，省略了培養(yǎng)部容積的擴大。

[實驗1：培養(yǎng)容器的制造]

(實施例1)

使用laboplastomill(株式會社東洋精機制作所制)作為塑料擠出成形裝置，將低密度聚乙烯擠出成形，成形出厚度100μm的膜。然后，使用脈沖熱封機，用該膜制作11cm×22.5cm(約225cm²)的袋，對該袋進行γ射線滅菌后供于實驗。

然后，在該袋中封入空氣約600ml，并且接著封入溶解有50μg的抗cd3抗體(miltenyibiotec株式會社制)的磷酸緩沖液(japanlifetechnologies株式會社制)10ml。此時，以使磷酸緩沖液的液滴僅與袋內(nèi)表面的一面(固相化面)接觸的方式進行。

然后，在26℃的條件下手動搖動袋1分鐘，使磷酸緩沖液的液滴以10m/分鐘的速度在袋內(nèi)的底面上移動，在袋內(nèi)形成固相化面，制造培養(yǎng)容器。

此外，制造2個該培養(yǎng)容器，一個用于固相化濃度的測定，另一個用于淋巴細胞的培養(yǎng)試驗。其他實施例和比較例也與此相同。

以下述方式進行固相化濃度的測定。

首先，除去培養(yǎng)容器內(nèi)的液體，使固相化面與包含1％十二烷基硫酸鈉(日本西格瑪奧德里奇合同會社制)的磷酸緩沖液(同上)500μl接觸，靜置30分鐘后，用presentmixer(tietech株式會社制)施加強振動，剝離所吸附的抗體。使用microbcatmproteinassaykit(thermofisherscientific株式會社制)測定剝離液中的抗體量，并用其除以固相化面積，由此算出吸附濃度。

實施例1的培養(yǎng)容器中，僅在其內(nèi)側的一面固相化有抗cd3抗體。

關于實施例1的培養(yǎng)容器的固相化濃度的測定結果是，固相化面中的抗cd3抗體的濃度為40ng/cm²。

(實施例2)

與實施例1同樣地制作11cm×22.5cm(約225cm²)的袋。

然后，在該袋中封入空氣約600ml，并且接著封入溶解有5μg的抗cd3抗體(miltenyibiotec株式會社制)的磷酸緩沖液(japanlifetechnologies株式會社制)10ml。此外進行與實施例1同樣的處理，制造實施例2的培養(yǎng)容器。

實施例2的培養(yǎng)容器中，僅在其內(nèi)側的一面固相化有抗cd3抗體。

關于實施例2的培養(yǎng)容器的固相化濃度的測定結果，固相化面中的抗cd3抗體的濃度為11ng/em²。

(比較例1)

與實施例1同樣地制作11cm×22.5cm(約225cm²)的袋。

然后，在該袋中封入溶解有50μg的抗cd3抗體(miltenyibiotec株式會社制)的磷酸緩沖液(japanlifetechnologies株式會社制)10ml，使磷酸緩沖液的液滴與袋內(nèi)的上下兩面接觸，在26℃靜置60分鐘。然后，用磷酸緩沖液40ml進行3次袋內(nèi)的清洗，制造比較例1的培養(yǎng)容器。

比較例1的培養(yǎng)容器在其內(nèi)側的兩面固相化有抗cd3抗體。

關于比較例1的培養(yǎng)容器的固相化濃度的測定結果，容器內(nèi)表面的抗cd3抗體的濃度為25ng/cm²。

(比較例2)

與實施例1同樣地制作11cm×22.5cm(約225cm²)的袋。

然后，在該袋中封入空氣約600ml，并且接著封入溶解有5μg的抗cd3抗體(miltenyibiotec株式會社制)的磷酸緩沖液(japanlifetechnologies株式會社制)10ml。此時，以使磷酸緩沖液的液滴僅與袋內(nèi)表面的一面(固相化面)接觸的方式進行。

然后，在26℃的條件下手動搖動袋1分鐘，使磷酸緩沖液的液滴以10m/分鐘的速度在袋內(nèi)的底面上移動，在袋內(nèi)形成固相化面。進一步，用磷酸緩沖液10ml進行3次袋內(nèi)的清洗，制造比較例2的培養(yǎng)容器。

比較例2的培養(yǎng)容器中，僅在其內(nèi)側的一面固相化有抗cd3抗體。

關于比較例2的培養(yǎng)容器的固相化濃度的測定結果，固相化面中的抗cd3抗體的濃度為8ng/cm²。

[實驗2：淋巴細胞的培養(yǎng)]

(活化工序)

對于由實驗1的實施例1、2和比較例1、2得到的培養(yǎng)容器，使用夾子分別以使培養(yǎng)部為5cm×11cm的方式進行劃分。

然后，將人末梢血單核細胞(cellapplications株式會社制)5.8×10⁴個懸浮于加入有10％小牛血清(japanlifetechnologies株式會社制)的alys505n-7培養(yǎng)基(株式會社細胞科學研究所制)，將4ml封入培養(yǎng)容器。然后，直接在37℃靜置75小時，進行淋巴細胞的活化工序。

此時，實施例1、2和比較例2以使培養(yǎng)容器的固相化面朝下的方式進行。此外，如上所述，比較例1的培養(yǎng)容器中在其內(nèi)側的上下兩面固相化有同量的抗cd3抗體，沒有上下的區(qū)別，即沒有固相化面與非固相化面的區(qū)別。

(增殖工序)

在結束了活化工序的培養(yǎng)容器中追加上述培養(yǎng)基4ml，將培養(yǎng)容器上下反轉，直接在37℃靜置26小時，進行淋巴細胞的增殖(第二實施方式中的第一增殖工序)。

然后，去掉夾子，將培養(yǎng)容器培養(yǎng)部的容積擴大(第二實施方式中的容積擴大工序)，追加上述培養(yǎng)基20ml，直接在37℃靜置62小時，繼續(xù)進行淋巴細胞的增殖(第二實施方式中的第二增殖工序)。

在距離培養(yǎng)開始的上述各操作的時刻(75小時后、75+26(＝101)小時后、75+26+62(＝163)小時后)、以及去掉夾子后的18小時后(75+26+18(＝119))，計數(shù)各培養(yǎng)容器中的淋巴細胞數(shù)目。其結果如圖7所示。

如圖7所示，僅在培養(yǎng)容器內(nèi)的一面分別固相化有40ng/cm²、11ng/cm²的抗cd3抗體的實施例1、2中，在增殖工序中能夠使淋巴細胞顯著增殖。此時，在固相化濃度為40ng/cm²的情況(實施例1)與11ng/cm²的情況(實施例2)之間，在增殖效率方面沒有看到顯著的差異。

另一方面，在培養(yǎng)容器內(nèi)的兩面固相化有抗cd3抗體的比較例1中，與實施例1、2相比，可知增殖工序中的淋巴細胞的增殖效率大幅降低。

另外，與實施例2相比稍微減少了所固相化的抗cd3抗體的濃度的比較例2中，在增殖工序中幾乎無法使淋巴細胞增殖。由此可知，優(yōu)選使固相化于培養(yǎng)容器的固相化面的抗cd3抗體的濃度為約10ng/cm²以上。

然后，參照圖16～圖21對本發(fā)明的實施方式所涉及的培養(yǎng)容器的制造方法的實施例和比較例進行說明。圖16、18、20為示出實施例和比較例的示意圖，圖17、19、21為示出實施例和比較例的實驗結果的圖表的圖。

[實驗3：抗體固相化培養(yǎng)袋的制造]

(實施例3)

使用laboplastomill(株式會社東洋精機制作所制)作為塑料擠出成形裝置，將低密度聚乙烯擠出成形，成形出厚度100μm的膜。然后，使用脈沖熱封機，用該膜制作11cm×22.5cm(約225cm²)的袋，對該袋進行γ射線滅菌后供于實驗。

然后，將該袋載置于裝載臺后封入空氣約600ml，并且接著以液滴的狀態(tài)封入溶解有50μg的抗cd3抗體(miltenyibiotec株式會社制)的磷酸緩沖液(japanlifetechnologies株式會社制)10ml。此時，以使該磷酸緩沖液的液滴僅與袋內(nèi)表面的底面接觸的方式進行。

然后，在26℃的條件下手動搖動袋1分鐘，使磷酸緩沖液的液滴以10m/分鐘的速度在袋內(nèi)的底面上移動，使抗體吸附于袋內(nèi)的底面，制造抗體固相化培養(yǎng)袋。

固相化濃度的測定以下述方式進行。

首先，除去培養(yǎng)容器內(nèi)的液滴，使固相化面與包含1％十二烷基硫酸鈉(日本西格瑪奧德里奇合同會社制)的磷酸緩沖液(同上)500μl接觸，靜置30分鐘后，用presentmixer(tietech株式會社制)施加強振動，剝離所吸附的抗體。使用microbcatmproteinassaykit(thermofisherscientific株式會社制)測定剝離液中的抗體量，并用其除以固相化面積，由此算出單位面積的蛋白質吸附量(以下稱為吸附濃度)。

實施例3的培養(yǎng)容器中，僅在其內(nèi)側的一面(底面)固相化有抗cd3抗體。關于實施例3的培養(yǎng)容器的固相化濃度的測定結果，抗cd3抗體的吸附濃度為41.5ng/cm²。

(實施例4)

與實施例3同樣地制作11cm×22.5cm(約225cm²)的袋。

然后，在該袋中封入空氣約600ml，并且接著以液滴的狀態(tài)封入溶解有50μg的抗cd3抗體(miltenyibiotec株式會社制)的磷酸緩沖液(japanlifetechnologies株式會社制)10ml。

然后，在26℃的條件下手動搖動袋2.5分鐘，使磷酸緩沖液的液滴以10m/分鐘的速度在袋內(nèi)的底面上移動，使抗體吸附于袋內(nèi)的底面。然后，將袋上下反轉，再次手動搖動袋2.5分鐘，使上述液滴以10m/分鐘的速度在袋內(nèi)的底面(上下反轉前的頂面)上移動。由此，使抗體吸附于袋內(nèi)壁的兩面，制造抗體固相化培養(yǎng)袋。

實施例4的培養(yǎng)容器在其內(nèi)側的兩面固相化有抗cd3抗體。關于實施例4的培養(yǎng)容器的固相化濃度的測定結果，抗cd3抗體的吸附濃度為31.2ng/cm²。

(比較例3)

與實施例3同樣地制作11cm×22.5cm(約225cm²)的袋。

然后，在不在該袋中封入空氣的情況下封入溶解有50μg的抗cd3抗體(miltenyibiotec株式會社制)的磷酸緩沖液(japanlifetechnologies株式會社制)10ml，使該磷酸緩沖液與袋內(nèi)的上下兩面接觸，在26℃靜置60分鐘。然后，用磷酸緩沖液40ml進行3次袋內(nèi)的清洗，制造抗體固相化培養(yǎng)袋。

比較例3的培養(yǎng)容器在其內(nèi)側的兩面固相化有抗cd3抗體。關于比較例3的培養(yǎng)容器的固相化濃度的測定結果，抗cd3抗體的吸附濃度為26.1ng/cm²。

(比較例4)

與實施例3同樣地制作11cm×22.5cm(約225cm²)的袋。

然后，在不在該袋中封入空氣的情況下以液滴的狀態(tài)封入溶解有50μg的抗cd3抗體(miltenyibiotec株式會社制)的磷酸緩沖液(japanlifetechnologies株式會社制)10ml。然后，在26℃的條件下手動搖動袋5分鐘，使磷酸緩沖液的液滴以10m/分鐘的速度在袋內(nèi)移動，使抗體吸附于袋的內(nèi)表面。進一步，用磷酸緩沖液10ml進行3次袋內(nèi)的清洗，制造抗體固相化培養(yǎng)袋。

比較例4的培養(yǎng)容器在其內(nèi)側的兩面固相化有抗cd3抗體。關于比較例4的培養(yǎng)容器的固相化濃度的測定結果，抗cd3抗體的吸附濃度為23.8ng/cm²。

如圖17所示，實施例3、實施例4、比較例3和比較例4中抗體對培養(yǎng)容器底面的單位面積的吸附效率(吸附濃度×225cm²/50000ng×100)分別為19％、14％、12％、11％。

即，根據(jù)實施例3的方法，即使固相化時間為1分鐘，與固相化時間為60分鐘的比較例3的結果相比，吸附效率也增大60％左右。

另一方面，在不在培養(yǎng)容器中封入氣體的情況下使液滴移動從而進行固相化的比較例4中，與比較例3的結果相比，吸附效率小。

另外，認為實施例4的吸附效率之所以小于實施例3的吸附效率，是因為實施例4的吸附面積為實施例3的吸附面積的2倍。

進一步，對實施例4與比較例4的結果進行比較可知，通過在培養(yǎng)容器中放入氣體的基礎上使液滴移動來進行固相化，由此能夠將吸附效率提高30％左右。

這樣地，根據(jù)本實施方式的培養(yǎng)容器的制造方法，即使在與以往相比更短的時間內(nèi)，也能夠將更多的抗體固相化于培養(yǎng)容器。另外，也能夠使用比以往更少量的抗體將更多的抗體固相化于培養(yǎng)容器。

[實驗4：抗體固相化燒瓶的制造]

(實施例5)

在漂浮培養(yǎng)用燒瓶800(sumimotobakelite，聚苯乙烯制，底面積225cm²)中以液滴的狀態(tài)封入溶解有50μg的抗cd3抗體(miltenyibiotec株式會社制)的磷酸緩沖液(japanlifetechnologies株式會社制)10ml。在26℃的條件下手動搖動燒瓶5分鐘，使磷酸緩沖液的液滴以10m/分鐘的速度在袋內(nèi)的底面上移動，使抗體吸附于燒瓶內(nèi)的底面，制造抗體固相化燒瓶。實施例5的抗體固相化燒瓶的抗cd3抗體的濃度為27.9ng/cm²。

(比較例5)

在漂浮培養(yǎng)用燒瓶800(sumimotobakelite，聚苯乙烯制，底面積225cm²)中裝入溶解有50μg的抗cd3抗體(miltenyibiotec株式會社制)的磷酸緩沖液(japanlifetechnologies株式會社制)10ml，使抗體溶液遍布整個底面，在26℃靜置60分鐘。由此，使抗體吸附于燒瓶的底面，制造抗體固相化燒瓶。比較例5的抗體固相化燒瓶的抗cd3抗體的濃度為27.6ng/cm²。

(比較例6)

在漂浮培養(yǎng)用燒瓶800(sumimotobakelite，聚苯乙烯制，底面積225cm²)中裝入溶解有50μg的抗cd3抗體(miltenyibiotec株式會社制)的磷酸緩沖液(japanlifetechnologies株式會社制)10ml，使抗體溶液遍布整個底面，在26℃靜置5分鐘。由此，使抗體吸附于燒瓶的底面，制造抗體固相化燒瓶。比較例6的抗體固相化燒瓶的抗cd3抗體的濃度為21.8ng/cm²。

如圖19所示，實施例5、比較例5和比較例6中，燒瓶的單位面積的抗體吸附效率分別為13％、12％、10％。

即，如比較例5所示，現(xiàn)有的基于靜置的抗體的固相化方法中，在固相化時間為60分鐘的條件下，吸附效率為12％，與此相對，如實施例5所示，本實施方式的培養(yǎng)容器的制造方法中，能夠在固相化時間為5分鐘的條件下使吸附效率為13％。

因此可知，根據(jù)本實施方式的培養(yǎng)容器的制造方法，即使在將蛋白質固相化于燒瓶的情況下，也能夠以比現(xiàn)有方法更短的時間將同等量的蛋白質固相化。

[實驗5：纖連蛋白固相化培養(yǎng)袋的制造]

(實施例6)

與實施例3同樣地制作11cm×22.5cm(約225cm²)的袋。

然后，在該袋中封入空氣約600ml，并且接著以液滴的狀態(tài)封入溶解有50μg來自于人血漿的纖連蛋白(日本西格瑪奧德里奇合同會社制)的磷酸緩沖液(japanlifetechnologies株式會社制)10ml。

然后，在26℃的條件下手動搖動袋1分鐘，使磷酸緩沖液的液滴以10m/分鐘的速度在袋內(nèi)的底面上移動，使抗體吸附于袋內(nèi)的底面，制造纖連蛋白固相化培養(yǎng)袋。

實施例6的培養(yǎng)容器中，僅在其內(nèi)側的一面(底面)固相化有纖連蛋白。關于實施例6的培養(yǎng)容器的固相化濃度的測定結果，纖連蛋白的吸附濃度為53.6ng/cm²。

(比較例7)

與實施例3同樣地制作11cm×22.5cm(約225cm²)的袋。

然后，在不在該袋中封入空氣的情況下封入溶解有50μg來自于人血漿的纖連蛋白(日本西格瑪奧德里奇合同會社制)的磷酸緩沖液(japanlifetechnologies株式會社制)10ml，使磷酸緩沖液的液滴與袋內(nèi)的上下兩面接觸，在26℃靜置60分鐘。然后，用磷酸緩沖液40ml進行3次袋內(nèi)的清洗，制造纖連蛋白固相化培養(yǎng)袋。

比較例7的培養(yǎng)容器在其內(nèi)側的兩面固相化有纖連蛋白。關于比較例7的培養(yǎng)容器的固相化濃度的測定結果，纖連蛋白的吸附濃度為30.7ng/cm²。

如圖21所示，實施例6和比較例7中，培養(yǎng)容器的單位面積的抗體吸附效率分別為24％、14％。

即，使用纖連蛋白作為蛋白質的情況下，根據(jù)本實施方式的培養(yǎng)容器的制造方法，能夠以比現(xiàn)有方法高70％以上的吸附效率將纖連蛋白固相化于培養(yǎng)容器。

因此可知，根據(jù)本實施方式的培養(yǎng)容器的制造方法，即使是抗體以外的蛋白質，也能夠在短時間內(nèi)將其高效地固相化于培養(yǎng)容器。

[實驗6：使用了固相化裝置的抗體固相化培養(yǎng)袋的制造]

(實施例7)

與實施例3同樣地制作8cm×20cm(約160cm²)的袋。

然后，將該袋載置于固相化裝置中的保持構件，使用擠壓部，以使底面為半圓筒狀的方式進行固定。然后，封入空氣約280ml，并且接著以液滴的狀態(tài)封入溶解有10μg抗cd3抗體(miltenyibiotec株式會社制)的磷酸緩沖液(japanlifetechnologies株式會社制)2ml。

然后，如圖13所示，將固相化裝置中的裝載臺在y軸方向上傾斜-50°(以x軸方向為中心軸進行旋轉移動)，使液滴達到培養(yǎng)袋內(nèi)的端部，然后在x軸方向上以-10°～10°的范圍旋轉裝載臺(以y軸方向為中心軸進行旋轉移動)，使液滴在x軸方向上移動，使其從培養(yǎng)袋內(nèi)的左端至右端左右地往復移動。

然后，在y軸方向上使裝載臺旋轉10°，使液滴稍微向背面?zhèn)纫苿?，然后再次在x軸方向上在-10°～10°的范圍旋轉裝載臺，使液滴在x軸方向上移動，使其從培養(yǎng)袋內(nèi)的左端至右端左右地往復移動。

重復以上的動作直至y軸方向的旋轉角(x軸旋轉角)達到50°，使液滴在培養(yǎng)袋的整個底面移動。將其作為1個循環(huán)，進行4個循環(huán)(固相化時間為3.5分鐘，溫度26℃)，測定固相化量。

實施例7的培養(yǎng)容器中，僅在其內(nèi)側的一面(底面)固相化有抗cd3抗體。關于實施例7的培養(yǎng)容器的固相化濃度的測定結果是，抗cd3抗體的吸附濃度為30.1ng/cm²。

因此，實施例7的培養(yǎng)容器中，單位面積的抗體吸附效率(吸附濃度×160cm²/10000ng×100)為48％。這與比較例3的培養(yǎng)容器的該吸附效率12％相比，達到4倍。

可見，通過使用本實施方式的固相化裝置來制造培養(yǎng)容器，由此能夠在短時間內(nèi)得到顯示出以往無法實現(xiàn)水平的高吸附效率的培養(yǎng)容器。

本發(fā)明并不限定于以上的實施方式或實施例，自然可以在本發(fā)明的范圍內(nèi)實施各種變更。

例如，能夠將培養(yǎng)容器的大小、淋巴細胞的種類、培養(yǎng)基和蛋白質的種類等適當變更為與實施例不同的情況。

產(chǎn)業(yè)上可利用性

本發(fā)明能夠適當?shù)赜糜谕ㄟ^使用單一的培養(yǎng)容器，來在排除活化后細胞的更換的繁雜性、污染風險的同時，大量培養(yǎng)淋巴細胞的情況。另外，本發(fā)明能夠適當?shù)赜糜谠诙虝r間內(nèi)高效地制造在內(nèi)表面固相化有蛋白質的培養(yǎng)容器。

符號說明

10培養(yǎng)容器

11固相化面

12非固相化面

13管

20抗體

30淋巴細胞

40培養(yǎng)液

50間隔構件

60外裝容器

70包裝容器

100培養(yǎng)袋

110固相化面

120非固相化面

130管

200蛋白質

300固相化裝置

310x軸方向移動用支承臺

320支承柱

330x軸方向移動用伺服電動機

340x軸方向移動用齒輪箱

350y軸原點限度檢測傳感器

360y軸方向移動用支承臺

370y軸方向移動用伺服電動機

380y軸方向移動用齒輪箱

390x軸原點限度檢測傳感器

400基臺

500保持構件

510主體部

510-1凹部

520上蓋部

530擠壓部