技術(shù)領(lǐng)域：
:本發(fā)明涉及一種真菌擬盤(pán)多毛孢提取物及其應(yīng)用，屬于應(yīng)用微生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：:阿爾茨海默氏病(alzheimer’sdisease,ad)，又稱(chēng)老年性癡呆癥，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)，起病隱襲的神經(jīng)變異性疾病，表現(xiàn)為一種慢性進(jìn)行性過(guò)程，是常見(jiàn)的與年齡相關(guān)的疾病之一。繼心血管疾病，癌癥和中風(fēng)之后，ad成為威脅老年人健康的又一大殺手锏，給病患帶來(lái)極大的痛苦，也給患者家庭和社會(huì)帶來(lái)非常沉重的負(fù)擔(dān)。而在老年性癡呆癥發(fā)病機(jī)制研究中，膽堿能缺失學(xué)說(shuō)認(rèn)為老年性癡呆癥患者大腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)—乙酰膽堿的缺失是導(dǎo)致ad疾病的關(guān)鍵原因。缺乏乙酰膽堿導(dǎo)致ad患者認(rèn)知功能下降，記憶力減退。乙酰膽堿酯酶是一個(gè)關(guān)鍵的生物神經(jīng)傳導(dǎo)酶，執(zhí)行神經(jīng)傳導(dǎo)的重要功能。同時(shí)它是治療ad的一個(gè)目標(biāo)靶點(diǎn)，乙酰膽堿酯酶抑制劑可以明顯改善和緩解ad病人的癥狀，也是臨床上治療阿爾茨海默癥最有效的藥物之一。因此尋找乙酰膽堿酯酶抑制劑是治療該病的重要來(lái)源之一。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，未發(fā)現(xiàn)與本技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：相同文獻(xiàn)的公開(kāi)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種真菌擬盤(pán)多毛孢提取物及其應(yīng)用。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：1.本發(fā)明使用的真菌菌株是擬盤(pán)多毛孢(pestalotiopsissp.)glgs-5,菌株glgs-5已于2017年1月9日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；保藏單位地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；保藏號(hào)：cgmccno.13577。2.擬盤(pán)多毛孢(pestalotiopsissp.)glgs-5提取物的制備培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(pda)為常規(guī)培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的組成和配制方法如下:馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(pda)：馬鈴薯200g切成小塊加水煮沸半小時(shí)后，過(guò)濾取濾液用自來(lái)水定容至1l，加入葡萄糖20g和瓊脂20g，121℃滅菌20分鐘。用pda培養(yǎng)基，在25℃對(duì)真菌擬盤(pán)多毛孢(pestalotiopsissp.)glgs-5進(jìn)行固體培養(yǎng)20天后，將平板上的培養(yǎng)基連同菌體一起切成均勻小塊放入錐形瓶中，用乙酸乙酯:甲醇:乙酸＝80:15:5(v/v/v)混合溶劑浸泡提取，浸泡3d后過(guò)濾，重復(fù)提取3次，合并過(guò)濾后的上清液，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干后得粗提物，4℃保存?zhèn)溆谩?.乙酰膽堿酯酶抑制活性測(cè)定方法a.乙酰膽堿酯酶(ache)溶液的配制:500u的乙酰膽堿酯酶被溶解于5ml無(wú)菌水中，即得100u/ml的酶溶液。100u/ml的酶液用ph＝8.0的pbs稀釋成0.1u/ml的酶液供ellman法使用。0.1m的na2hpo4溶液：稱(chēng)取na2hpo4·12h2o共3.58g加水溶解至100ml。0.1m的nah2po4溶液：稱(chēng)取nah2po4·2h2o共1.56g加水溶解至100ml。0.1m的ph＝8.0的pbs:取5.3ml0.1mnah2po4溶液和94.7ml0.1mna2hpo4溶液，充分混合即為0.1mph＝8.0的pbs。b.活性測(cè)定：6.25mmdtnb的配制：24.77mgdtnb先用500μl的無(wú)水乙醇溶解，再加1.5mgnahco3，然后用pbs定容到10ml。6.25mmatci的配制：18.07mgatci加蒸餾水溶解并定容至10ml，4℃冰箱保存10-15d。他克林溶液的配置：1.56mg的他克林用pbs稀釋成6.66μm的待用溶液。待測(cè)樣液的配置：取準(zhǔn)確稱(chēng)重浸膏20mg，用1mldmso溶解，然后用pbs稀釋至2.67mg/ml，混勻，得待測(cè)樣品溶液，臨用前配置。ache能夠催化使其底物類(lèi)似物碘化硫代乙酰膽堿(atci)發(fā)生降解，從而能生成硫代膽堿和乙酸，反應(yīng)生成的硫代膽堿與顯色劑dtnb反應(yīng)能生成黃色物質(zhì)，在波長(zhǎng)為405nm處有特異光吸收。待測(cè)物與乙酰膽堿酯酶的混合液在37℃反應(yīng)，如果待測(cè)物對(duì)ache有抑制作用，那么ache就能催化底物類(lèi)似物atci從而使降解的量減少，相應(yīng)的與dtnb反應(yīng)生成的黃色物質(zhì)就會(huì)減少，即在405nm處的光吸收值就會(huì)變小，以此來(lái)篩選具有抑制ache活性的化合物。c.實(shí)驗(yàn)過(guò)程：用準(zhǔn)備好的備用溶液進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)在96孔板中進(jìn)行，向96孔板中依次加入下列試劑(加入試劑的體積為一個(gè)反應(yīng)的體積)，每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)；鋪板：200ul/體系，體系如表1所示，每孔內(nèi)化合物的終濃度為2.67mg/ml，他克林的終濃度為0.333μm。表1反應(yīng)體系加入顯色劑和底物后1小時(shí)內(nèi)，每30秒鐘檢測(cè)一次405nm吸光值。選擇nc組吸光值平均值約為1時(shí)的樣品吸光值，計(jì)算化合物吸光值平均值(化合物測(cè)定值-背景值)，并按照(nc-化合物吸光值平均值)/nc*100％來(lái)計(jì)算化合物ache抑制率。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：擬盤(pán)多毛孢(pestalotiopsissp.)glgs-5固體發(fā)酵提取物活性很好，對(duì)ache抑制率達(dá)61.8％。能夠作為制備乙酰膽堿酯酶抑制劑應(yīng)用。具體實(shí)施方式：以下是本發(fā)明的實(shí)施例，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。實(shí)施例的擬盤(pán)多毛孢(pestalotiopsissp.)glgs-5發(fā)酵提取物的制備過(guò)程及乙酰膽堿酯酶抑制活性測(cè)定方法同
發(fā)明內(nèi)容部分的描述。實(shí)施例1：將擬盤(pán)多毛孢(pestalotiopsissp.)glgs-5菌塊接種到pda固體培養(yǎng)基上，在25℃培養(yǎng)20天后，將培養(yǎng)基連同菌體一起切成均勻小塊放入錐形瓶中，用乙酸乙酯:甲醇:乙酸＝80:15:5(v/v/v)混合溶劑浸泡提取，浸泡3d后過(guò)濾，重復(fù)提取3次，合并過(guò)濾后的上清液，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干后得粗提物，4℃保存?zhèn)溆?。?yīng)用ellman法測(cè)定了擬盤(pán)多毛孢(pestalotiopsissp.)glgs-5固體發(fā)酵提取物對(duì)ache的抑制作用，結(jié)果用百分率表示，樣品終濃度為2.67mg/ml。表1ache抑制率樣本ta提取物濃度(mg/ml)0.0662.67抑制率(％)60.5861.8抑制活性++++測(cè)定結(jié)果表明，擬盤(pán)多毛孢(pestalotiopsissp.)glgs-5固體發(fā)酵提取物活性很好，對(duì)ache抑制率達(dá)61.8％。能夠作為制備乙酰膽堿酯酶抑制劑應(yīng)用。當(dāng)前第1頁(yè)12