本發(fā)明涉及atg16l1基因在增強(qiáng)新城疫病毒的復(fù)制能力中的用途。

背景技術(shù)：

早在1962年ashford和porten在電子顯微鏡下就發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞中加入高血糖素后會(huì)出現(xiàn)自噬現(xiàn)象。自噬的發(fā)生受到自噬相關(guān)基因的調(diào)控。atg編碼的蛋白在自噬過(guò)程中幫助自噬體的生成，延伸和再循環(huán)。atg最早在酵母中被發(fā)現(xiàn)，陸續(xù)的在哺乳動(dòng)物中也發(fā)現(xiàn)了同源的自噬基因。這些自噬基因在在不同物種中都有很好的保守性，幾乎任何一種自噬基因的缺失或者突變都可能導(dǎo)致阻斷自噬的發(fā)生。自噬相關(guān)基因atg16l1編碼的蛋白是自噬過(guò)程中所必需的。該基因位于2q37.1，編碼的蛋白包括卷曲螺旋蛋白和色氨酸-天冬氨酸重復(fù)序列，表達(dá)的主要位置在cd4+、cd8+、cd19+淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞等。atg16l1是細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌引起自噬主要的代謝蛋白，其與atg5和atg12形成復(fù)合物處理細(xì)菌的感染。比如它能抑制巨噬細(xì)胞中結(jié)核分枝桿菌。如若atg16l1發(fā)生變異，突變型的基因表達(dá)的蛋白可能影響正常免疫功能而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。哺乳動(dòng)物中，atg16l1是lc3正確定位多必須的。atg16l1基因的缺失會(huì)導(dǎo)致atg5-atg12復(fù)合物無(wú)法結(jié)合和定位到細(xì)胞膜，進(jìn)而影響lc3與pe的結(jié)合，導(dǎo)致自噬小體不能形成，p62蛋白大量堆積，自噬過(guò)程發(fā)生障礙，宿主清除病原體能力下降。因此認(rèn)為atg16l1具有調(diào)節(jié)自噬的功能，與lc3和p62關(guān)系密切。atg16l1與某些病毒粒子共定位發(fā)現(xiàn)它可能對(duì)病毒的復(fù)制有重要的影響。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足。為研發(fā)高效復(fù)制新城疫病毒的技術(shù)，本發(fā)明提供了一種增強(qiáng)新城疫病毒復(fù)制能力的表達(dá)載體的構(gòu)建方法，本發(fā)明提供了該構(gòu)建方法得到的表達(dá)載體及其用途，本發(fā)明還提供了一種繁殖新城疫病毒的細(xì)胞，本發(fā)明還提供了一種增強(qiáng)新城疫病毒復(fù)制能力的方法，本發(fā)明還提供了atg16l1基因的用途。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，所采取的技術(shù)方案：一種增強(qiáng)新城疫病毒復(fù)制能力的表達(dá)載體的構(gòu)建方法，所述方法是將atg16l1基因構(gòu)建到基礎(chǔ)載體上，獲得表達(dá)atg16l1基因的表達(dá)載體。

優(yōu)選地，所述基礎(chǔ)載體是真核表達(dá)載體。

優(yōu)選地，所述基礎(chǔ)載體是帶有g(shù)fp熒光標(biāo)簽的pegfp-n1載體。本發(fā)明通過(guò)將atg16l1基因連接到帶有g(shù)fp熒光標(biāo)簽的pegfp-n1載體上，與普通的繁毒方式相比能大大提高病毒的表達(dá)量，也能通過(guò)熒光標(biāo)簽及時(shí)觀察細(xì)胞狀態(tài)，提高病毒繁殖的成功率。

本發(fā)明提供了一種采用上述所述的構(gòu)建方法得到的表達(dá)載體。

本發(fā)明提供了一種繁殖新城疫病毒的細(xì)胞，所述細(xì)胞轉(zhuǎn)染有如權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體。

本發(fā)明提供了一種增強(qiáng)新城疫病毒復(fù)制能力的方法，所述方法是將上述所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至生產(chǎn)新城疫病毒的細(xì)胞中。本發(fā)明提供了一種利用自噬相關(guān)基因atg16l1基因來(lái)增強(qiáng)新城疫病毒復(fù)制的方法，優(yōu)選地，本發(fā)明所述的atg16l1基因連接于真核表達(dá)載體pegfp-n1載體上，易于生產(chǎn)，成本低，病毒數(shù)量增加效率高，提供穩(wěn)定復(fù)制新城疫病毒的途徑。

本發(fā)明提供了atg16l1基因在增強(qiáng)新城疫病毒的復(fù)制能力中的用途。

本發(fā)明提供了atg16l1基因在制備增強(qiáng)新城疫病毒復(fù)制能力的表達(dá)載體中的用途。

本發(fā)明提供了上述所述的表達(dá)載體在增強(qiáng)新城疫病毒的復(fù)制能力中的用途。

本發(fā)明提供了上述所述的表達(dá)載體在制備生產(chǎn)新城疫病毒的細(xì)胞中的用途。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：

(1)本發(fā)明成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pegfp-n1-atg16l1，實(shí)現(xiàn)了雞atg16l1的擴(kuò)增。另外，pegfp-n1載體帶有g(shù)fp熒光蛋白基因，在熒光顯微鏡下能清楚看到目的基因的表達(dá)。不僅可以保證連接上的基因在細(xì)胞中的高效表達(dá)，還能用顯微鏡觀察到轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的生物學(xué)活性。

(2)體外病毒增殖實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所構(gòu)建的真核表達(dá)載體pegfp-n1-atg16l1能有效地增強(qiáng)新城疫病毒復(fù)制能力。不僅在df-1細(xì)胞中新城疫病毒滴度明顯提高，在cef細(xì)胞中也得到相同結(jié)果。因此，該發(fā)明提供了一種成本低、活性高的真核表達(dá)載體pegfp-n1-atg16l1，可有效增強(qiáng)新城疫病毒增殖，為病毒擴(kuò)繁打下了良好的基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

圖1為pcr擴(kuò)增的雞atg16l1基因電泳檢測(cè)結(jié)果圖；其中，泳道m(xù)：dl2000marker；泳道1～11:pcr擴(kuò)增雞atg16l1基因結(jié)果；

圖2為熒光顯微鏡下觀察檢測(cè)其表達(dá)的結(jié)果圖；其中，a：轉(zhuǎn)染pegfp-n1-atg16l1；b:空白載體pegfp-n1；

圖3為q-pcr檢測(cè)其病毒復(fù)制的結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

為更好的說(shuō)明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)，下面將結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。

實(shí)施例1：雞pegfp-n1-atg16l1真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

1.引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)genbank中提供的雞atg16l1基因預(yù)測(cè)序列(genbankxm_015277206.1)，設(shè)計(jì)引物gaatg16l1-f和gaatg16l1-r，用于擴(kuò)增雞atg16l1基因。再用ncbi設(shè)計(jì)用于q-pcr檢測(cè)新城疫的引物。

atg16l1的擴(kuò)增引物序列如下：

gaatg16l1-f：atggcgtcggggctgcac；

gaatg16l1-r：tcagaactcagaccacaggacagcctt；

熒光定量pcr檢測(cè)新城疫的引物序列如下：

ndv-f：agtgatgtgctcggaccttc；

ndv-r：cctgaggaggcatttgcta；

2.雞atg16l1基因基因的擴(kuò)增

從雞腎臟細(xì)胞中抽提rna，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，得到擴(kuò)增雞atg16l1基因的cdna模板，以此cdna為模板，分別用上述gaatg16l1-f和gaatg16l1-r引物，擴(kuò)增出所需雞atg16l1目的基因，pcr反應(yīng)體系為50μl，其中5xq5反應(yīng)緩沖液10μl，5xq5highgcenhancer10μl，q5高保真酶0.5μl，10nmoldntps1μl，ddh2022.5μl，上、下游引物各2.5μl，cdna1μl。pcr反應(yīng)條件為：預(yù)變性98℃30sec；98℃10sec，72℃30sec，72℃20sec/kb，30個(gè)循環(huán)，延伸72℃2min。凝膠電泳使用1﹪瓊脂糖，紫外燈下觀察結(jié)果，如圖1所示。可見約1875kb的擴(kuò)增條帶，大小與預(yù)期的結(jié)果相符。

3.雞atg16l1目的基因回收

用潔凈的刀片在長(zhǎng)波紫外燈下切取含有目的基因的瓊脂糖膠塊，放入1.5ml離心管中；按每100mg瓊脂糖膠加入200μlbindingbuffer，置55℃～65℃水浴10分鐘，其間每隔2-3分鐘混勻一次；使瓊脂糖塊完全溶化；將溶化后的瓊脂糖膠移入hibindtmdna柱子,室溫下，10,000×g離心1min，棄去液體；將柱子重新套回收集管中，加300μlbindingbuffer至hibinddna柱子中；室溫下，10,000×g離心1分鐘，去棄濾出液；將柱子重新套回收集管中，加入700μlspwwashbuffer至hibinddna柱子中，室溫下，10,000×g離心1分鐘，去棄濾出液。將柱子重新套回收集管中，重復(fù)加入700μlspwwashbuffer至hibinddna柱子中，室溫下，10,000×g離心1分鐘，去棄濾出液；棄去液體，將空柱子重新套回收集管中，10,000×g離心1min以甩干柱基質(zhì)殘余的液體；把柱子裝在一個(gè)干凈的1.5ml離心管上，加入30～50μl洗脫液或滅菌水上柱子膜上，10,000×g離心1分鐘，離心管中的溶液即純化的dna產(chǎn)物，保存于-20度。

4.雞atg16l1目的基因克隆至pmd-19tvector

將上述回收產(chǎn)物連接到pmd-19t載體上，連接反應(yīng)體系為：ligationsolutionⅰ5μl，pmd-19tvector0.5μl，pcr純化產(chǎn)物4.5μl，16℃連接過(guò)夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至dh5a感受態(tài)細(xì)菌，接種于氨芐青霉素抗性的lb平板上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑選菌落于氨芐青霉素抗性的lb培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)6h，用菌液pcr方法篩選出陽(yáng)性克隆。菌液pcr反應(yīng)體系為rtaq10μl，ddh2o8.4μl，上、下游引物各0.2μl，菌液1.2μl。反應(yīng)參數(shù)為：預(yù)變性94℃4min，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，循環(huán)反應(yīng)條件為94℃30s、55℃35s、72℃2min，最后72℃延伸10min。pcr產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳觀察，選取部分陽(yáng)性樣品測(cè)序鑒定，將測(cè)序結(jié)果正確的菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，獲取陽(yáng)性質(zhì)粒pmd-19t-ifnα-linker-ifnγ。

5.重組真核表達(dá)質(zhì)粒pegfp-n1-atg16l1的構(gòu)建。

將目的基因連接到pmd-19t后轉(zhuǎn)化提取質(zhì)粒用去掉終止子的引物pcr擴(kuò)增目的基因，膠回收后同時(shí)用限制性內(nèi)切酶ecori、xhoi分別對(duì)pmd19-t-gaatg12、pmd19-t-gaatg16l1重組質(zhì)粒和pegfp-n1載體進(jìn)行雙酶切。膠回收獲得酶切后的基因片段和載體片段，應(yīng)用t4連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，其中：10×ligationbuffer1μl，t4dnaligase1μl，gaatg16l10.5μl，pegfp-n15μl，ddh2o2.5μl。酶切后的目的片段與載體以mol比為3:1的比例加入，反應(yīng)總體積為10μl。16℃連接過(guò)夜。

6.重組表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、鑒定

將獲得的連接產(chǎn)物10μl加到100μl感受態(tài)細(xì)胞dh5α中，輕輕混勻，冰浴30min。42℃熱應(yīng)激90s后，迅速冰浴2min。加900μllb液體培養(yǎng)基，置于搖床中，37℃，150r/min搖動(dòng)1h。5000r/min離心5min。棄去培養(yǎng)基，再加入200μl新鮮的lb液體培養(yǎng)基重懸，取重懸的菌液涂布于卡那霉素lb固體培養(yǎng)基平皿上待菌液完全吸收后放入溫箱，37℃倒置培養(yǎng)12～16h。培養(yǎng)后，挑取菌落于卡那霉素抗性的lb培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，應(yīng)用菌液pcr方法篩選出陽(yáng)性克隆，獲得重組真核表達(dá)質(zhì)粒。

7.重組表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染

選擇對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，將細(xì)胞傳代至6孔板中，培養(yǎng)的df-1細(xì)胞在24內(nèi)達(dá)到70％-80％的密度可以用于轉(zhuǎn)染。將3μltianfect轉(zhuǎn)染試劑稀釋于100μl的opti培養(yǎng)基中，輕彈混勻，再分別加入2ug質(zhì)粒振蕩混勻后室溫放置15min。靜置過(guò)程中用opti培養(yǎng)基將6孔板中的細(xì)胞清洗一遍，做好標(biāo)記。置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-6h，更換含2％fbs的dmem，繼續(xù)培養(yǎng)24-72h，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑诓煌瑫r(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行接種新城疫高明毒株。接毒24h后在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，收集細(xì)胞提取rna用于后續(xù)檢測(cè)。

8.轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中新城疫病毒的檢測(cè)

提取上述細(xì)胞中的rna，反轉(zhuǎn)成dna后用熒光定量pcr檢測(cè)細(xì)胞中新城疫病毒的復(fù)制量。按照以下劑量配置pcr溶液：2xquantifastsybrgreenpcrmastermix5μl，上游引物1μm，下游引物1μm，模版dna100ng，去離子水1μl。熒光定量pcr程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min，95℃變性10s，60℃30s，40個(gè)循環(huán)。

對(duì)轉(zhuǎn)染了pegfp-n1-gaatg16l1以及空載體質(zhì)粒的df-1細(xì)胞24h后觀察發(fā)現(xiàn)均能成功傳染至df-1細(xì)胞中，再接毒gm，再經(jīng)過(guò)24h在熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖2所示。

測(cè)試結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用構(gòu)建的pegfp-n1-gaatg16l1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至df-1細(xì)胞中接種新城疫病毒后。細(xì)胞在24h內(nèi)轉(zhuǎn)染率達(dá)80％，24h內(nèi)病毒復(fù)制數(shù)量明顯上升，比對(duì)照組的病毒復(fù)制增強(qiáng)了22.9倍，結(jié)果如圖3所示。顯著增強(qiáng)了病毒的復(fù)制能力，發(fā)揮了理想的復(fù)制載體效果。

最后所應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。