本發(fā)明涉及微生物強化采油及生物轉(zhuǎn)化技術領域，具體涉及一株臺灣假單胞菌及其應用。

背景技術：

微生物強化采油(microbialenhancedoilrecovery，meor)是利用微生物及其代謝產(chǎn)物回收油藏中殘油的三次采油技術。在對meor的研究中，代謝產(chǎn)物的運用及研究較為廣泛，其中表面活性物質(zhì)依靠其親水親油的兩性基團能夠大幅度降低表面及界面張力受到重視。用于meor的能夠產(chǎn)生表面活性物質(zhì)的菌種主要包括多種桿菌屬細菌及假單胞菌屬，其中對烴降解菌銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)所產(chǎn)表面活性物質(zhì)鼠李糖脂研究較多。臺灣假單胞菌(pseudomonastaiwanensis)分離自土壤，能夠降解幾丁質(zhì)、產(chǎn)生抗蟲毒素，其主要用于植物抗蟲領域，對原油降解及強化采油能力未見報道。

瀝青是原油的重要組成成分，在稠油中含量很高，對原油粘度影響很大。uraizee等認為，高含量的瀝青質(zhì)阻礙油滴中可降解組分向油-菌界面?zhèn)鬟f，降低可降解組分的降解速率及降解程度。研究發(fā)現(xiàn)，微生物對瀝青的降解率很低，而瀝青降解將會大幅度降低原油粘度，提高原油采收率。但目前缺乏對瀝青有較強降解能力及同時產(chǎn)表面活性物質(zhì)的強化采油細菌。

技術實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一株臺灣假單胞菌，能以原油為唯一碳源，對原油中瀝青、膠質(zhì)等重質(zhì)分子有較強降解能力、合成表面活性物質(zhì)且對原油具有良好驅(qū)替能力。

為了達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案予以實現(xiàn)。

(一)一株臺灣假單胞菌，具體為pseudomonastaiwanensisc-2，于2016年3月14日保藏于在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為cctccm2016119。

所述pseudomonastaiwanensisc-2的16srdna序列seqidno.1所示。

所述pseudomonastaiwanensisc-2可產(chǎn)表面活性物質(zhì)。

(二)臺灣假單胞菌的應用

(1)pseudomonastaiwanensisc-2在瀝青降解中的應用。

(2)pseudomonastaiwanensisc-2在膠質(zhì)降解中的應用。

(3)pseudomonastaiwanensisc-2在芳香烴降解中的應用。

(4)pseudomonastaiwanensisc-2在原油降解中的應用。

(5)pseudomonastaiwanensisc-2在微生物強化采油中的應用。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明提供的臺灣假單胞菌pseudomonastaiwanensisc-2能以原油為唯一碳源生長，可產(chǎn)生表面活性物質(zhì)，能顯著改善原油乳化性，降低原油附著性及粘度，具有良好的原油驅(qū)替能力，在meor中具有重要的應用潛力；且對瀝青及原油中的重質(zhì)組分有較強的降解轉(zhuǎn)化能力。

附圖說明

下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。

圖1為臺灣假單胞菌pseudomonastaiwanensisc-2的菌落形態(tài)圖；

圖2為臺灣假單胞菌pseudomonastaiwanensisc-2放大5000倍后的細胞形態(tài)圖；

圖3為圖2放大70000倍后的臺灣假單胞菌pseudomonastaiwanensisc-2的單個細胞形態(tài)圖；

圖4為臺灣假單胞菌pseudomonastaiwanensisc-2作用瀝青玻片后瀝青在玻片上的分布形態(tài)圖；

圖5為臺灣假單胞菌pseudomonastaiwanensisc-2處理原油濾紙后濾紙上殘留原油的情況圖；

圖6為臺灣假單胞菌pseudomonastaiwanensisc-2發(fā)酵液對原油驅(qū)替時的驅(qū)油裝置圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領域的技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限制本發(fā)明的范圍。

本發(fā)明提供一株臺灣假單胞菌pseudomonastaiwanensisc-2，于2016年3月14日保藏于在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為cctccm2016119，保藏單位地址為中國湖北省武漢市武昌珞珈山，郵編430072。

本實施例所用到的材料具體如下：

細菌分離源：中國陜北延長油田長6組井油油樣及油井旁油污土壤。

原油濾紙：將直徑8.5cm的定性濾紙蘸滿原油后置于直徑9cm培養(yǎng)皿中，121℃滅菌30min。

分離培養(yǎng)基：瓊脂粉10g，nacl5.0g，水1l，121℃滅菌30min，倒皿，待培養(yǎng)基凝固后將滅菌原油濾紙緊貼在培養(yǎng)基表面。

菌種純化及保藏培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基。

初篩培養(yǎng)基：kno35.0g，mgso4·7h2o0.5g，kh2po41.0g，水1000ml，ph值中性，瓊脂粉10.0g，原油20.0g，121℃滅菌30min，搖勻后倒皿。

復篩培養(yǎng)基：nano32.0g，mgso4·7h2o0.5g，kh2po42.0g，(nh4)2so41.0g，水1000ml，ph值中性。取100ml分裝至250ml細口玻璃瓶中，每瓶加入原油2.0g，121℃滅菌30min。

細菌種子液制備：用接種環(huán)從細菌斜面挑取1環(huán)菌體接種至100ml滅菌的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37℃，150r/min搖床振蕩培養(yǎng)3d。

細菌發(fā)酵液制備：于600ml組培瓶中加入150ml牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，121℃滅菌30min，待冷卻后接種5ml細菌種子液，37℃，150r/min搖床振蕩培養(yǎng)5d，4℃保存待用。

ndj-79旋轉(zhuǎn)粘度計：上海平軒科技儀器有限公司生產(chǎn)。

氣相色譜儀：型號為tracegcultra，thermofinnigan公司生產(chǎn)。

瀝青：石油瀝青，為陜西寶利瀝青有限公司生產(chǎn)的重膠瀝青，針入度91(0.1mm)，軟化點46℃，延度于10℃時為45cm，15℃時為102cm。

原油：中國陜北延長油田長6組井油油樣，飽和烴含量612.6g/kg，芳香烴83.6g/kg，膠質(zhì)51.6g/kg，瀝青54.3g/kg，其他成分69.1g/kg。35℃時粘度76.5mpa·s。

模擬驅(qū)油原油：采自中國陜北延長油田，該油樣飽和烴含量為684.50g/kg，芳香烴含量108.33g/kg，膠質(zhì)39.83g/kg，瀝青質(zhì)含量39.50g/kg，未知組分含量為77.00g/kg。

實施例1

菌株的篩選及鑒定

1、試驗方法：

1.1驅(qū)油細菌分離純化

稱取10.0g井口油污土壤加入至90ml無菌水中，手搖振蕩15min，即得10^-1濃度的土壤懸液，靜置30s，吸取1ml土壤懸液加至9ml無菌水管中，連續(xù)稀釋至10^-3，涂布法將3個濃度的菌懸液分別接入分離培養(yǎng)基的原油濾紙上。37℃培養(yǎng)7d，挑取生長快、直徑較大的細菌單菌落，采用稀釋平皿涂抹法純化，即可從原油污染土壤中獲得能以原油為唯一碳源的細菌。

將原油搖勻后吸取0.1ml直接均勻涂布于分離培養(yǎng)基的原油濾紙上，用相同方法培養(yǎng)純化，即可從原油中獲得能以原油為唯一碳源的細菌。將所得菌株保存于牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面。

1.2菌株初篩與復篩

初篩：將分離純化后的菌株接入到初篩培養(yǎng)基中置于37℃，培養(yǎng)7d，觀察并記錄3～7d時菌株在初篩培養(yǎng)基上的生長狀況。

復篩：選取初篩培養(yǎng)基上生長較好的菌株接入復篩培養(yǎng)基中，37℃，120r/min搖床培養(yǎng)10d，觀察原油在瓶壁上的附著性，測定培養(yǎng)瓶中原油的乳化時間、培養(yǎng)液水相的排油圈直徑及ph值。利用公式(1)計算各測定參數(shù)較對照的相對增率(relativegrowthrate，⊿r％)。

式(1)中：ws與wck分別為處理與對照所對應的乳化時間，排油圈直徑及ph值。

綜合初篩與復篩結(jié)果，選取在初篩、復篩培養(yǎng)基上生長良好、乳化時間長及原油在瓶壁上附著少的菌株進行后續(xù)試驗。

1.3菌株鑒定

形態(tài)特征：菌落形態(tài)，通過稀釋平皿涂抹法獲得單菌落，觀察菌落形態(tài)、大小、邊緣狀況、隆起程度、表面光澤、粘稠度及菌落顏色等特征。細胞形態(tài)：掃描電鏡觀察。16srdna序列分析獲取序列后，在ncbi數(shù)據(jù)庫中通過blast程序進行相似度搜索，采用mega5.0軟件中的neighbor-joining法將同源性較高的菌株序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2、試驗結(jié)果：

從延長油田原油及油污土壤中共分離到32株細菌，其中有1株分離自原油的細菌c-2，在含原油培養(yǎng)基中生長良好，對原油的物理及化學性質(zhì)影響顯著。菌落形態(tài)和細胞形態(tài)如圖1-圖3所示，c-2菌落直徑為3.2～4.0mm，菌落白色，半透明，顏色均勻，圓形，邊緣整齊，表面濕潤光滑，微凸起，細胞長0.8-1.2μm，寬0.4-0.6μm。

pseudomonastaiwanensisc-2的16srdna序列如下：

atgcaagtcgagcggatgacgggagcttgctccttgattcagcggcggacgggtgagtaatgcctaggaatctgcctggtagtgggggacaacgtttcgaaaggaacgctaataccgcatacgtcctacgggagaaagcaggggaccttcgggccttgcgctatcagatgagcctaggtcggattagctagttggtggggtaatggctcaccaaggcgacgatccgtaactggtctgagaggatgatcagtcacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcgaaagcctgatccagccatgccgcgtgtgtgaagaaggtcttcggattgtaaagcactttaagttgggaggaagggcagtaagttaataccttgctgttttgacgttaccgacagaataagcaccggctaactctgtgccagcagccgcggtaatacagagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcgcgtaggtggtttgttaagttggatgtgaaagccccgggctcaacctgggaactgcatccaaaactggcaagctagagtacggtagagggtggtggaatttcctgtgtagcggtgaaatgcgtagatataggaaggaacaccagtggcgaaggcgaccacctggactgatactgacactgaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcaactagccgttggaatccttgagattttagtggcgcagctaacgcattaagttgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggccttgacatgcagagaactttccagagatggattggtgccttcgggaactctgacacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgtaacgagcgcaacccttgtccttagttaccagcacgttatggtgggcactctaaggagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacggcctgggctacacacgtgctacaatggtcggtacagagggttgccaagccgcgaggtggagctaatctcacaaaaccgatcgtagtccggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagtcggaatcgctagtaatcgcgaatcagaatgtcgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaccagaagtagctagtctaaccttcgggaggacggttacc。

經(jīng)鑒定，細菌c-2為pseudomonastaiwanensis，在genbank的登錄號為kt189157。

實施例2

菌種的應用

1、試驗方法

1.1對原油的作用

將18.00g原油加入到500ml三角瓶中，每瓶加入200ml牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，121℃滅菌30min，待冷卻后接種100ml細菌種子液，以加300ml純水代替發(fā)酵液為對照。37℃靜置培養(yǎng)5d，期間每4小時搖動1次。處理結(jié)束后將培養(yǎng)瓶置4℃冰箱靜置，待原油凝固后分別收集原油及發(fā)酵液水相，原油用于測定細菌處理原油理化性質(zhì)，發(fā)酵液水相用于發(fā)酵液驅(qū)油特性測定。

1.2驅(qū)油特性

發(fā)酵液ph：用雷磁phs-3d型酸度計測定1.1收集的發(fā)酵液水相ph值。

排油圈直徑：指培養(yǎng)瓶中液體培養(yǎng)液水相對液體石蠟的排油圈大小，采用排油圈法測定1.1收集的發(fā)酵液水相的排油圈直徑。測值愈大，表示發(fā)酵液水相的表面活性愈強，細菌生長代謝產(chǎn)生的表面活性物質(zhì)多或表面活性強。

附著性：①液體培養(yǎng)瓶壁上的附著狀況，通過觀察1.1中原油在瓶壁上附著的原油量確定。原油附著愈少、瓶壁愈干凈，表示細菌發(fā)酵液對原油附著性的降低作用愈大，該發(fā)酵液用于原油生產(chǎn)時提高采收率的潛力愈大。②原油濾紙的附著狀況，將快速定性濾紙裁剪成4.5cm×4.5cm的濾紙片，依照文獻《bacterialdegradationofcrudeoilusingsolidformulationsofbacillusstrainsisolatedfromoil-contaminatedsoiltowardsmicrobialenhancedoilrecoveryapplication》中的方法測定發(fā)酵液對原油濾紙的脫附作用?；厥杖〕鲈蜑V紙后的水相，測定對照及細菌處理發(fā)酵液水相的ph值及排油圈直徑。將濾紙解吸的原油量占濾紙初始吸附原油量的比率定義為濾紙吸附原油脫附率(oilremovalefficiency,ore％)，按式(2)計算。

式(2)中：m0、m1及m2分別指濾紙片質(zhì)量、濾紙與原油總質(zhì)量及反應后殘余原油與濾紙總質(zhì)量。

乳化性：原油乳化時間，指將1.1培養(yǎng)瓶中的油水混合液體培養(yǎng)物充分搖勻后靜置于實驗臺并開始計時，至油、水層分離且界限清晰所需時間。該值可反映細菌培養(yǎng)液對原油的乳化程度及其穩(wěn)定性。

粘度：以1.1細菌處理后原油為材料，依照文獻《bacterialdegradationofcrudeoilusingsolidformulationsofbacillusstrainsisolatedfromoil-contaminatedsoiltowardsmicrobialenhancedoilrecoveryapplication》中的方法測定發(fā)酵液對原油粘度的影響。按式(3)計算驅(qū)油細菌的降黏率(viscosityreductionrate,vrr％)。

式中：vs與vck分別為處理與對照的粘度測值。

以上測定均重復3次。

1.3細菌發(fā)酵液處理原油瀝青質(zhì)、膠質(zhì)、飽和烴及芳香烴含量測定

瀝青質(zhì)：將2.00g經(jīng)細菌處理后原油溶解于35ml正己烷中，靜置沉降24h，3500r/min離心5min，分別收集沉淀和有機液相上清液。將沉淀置干燥器中干燥稱重，即得瀝青質(zhì)質(zhì)量。

膠質(zhì)、飽和烴及芳香烴質(zhì)量(族組成)：采用氧化鋁柱層析法測定有機液相上清液中的膠質(zhì)及烴類質(zhì)量。

未知組分質(zhì)量：柱層析結(jié)束后回收層析柱內(nèi)氧化鋁，脫脂棉及硫酸銨，烘干稱重，計算層析結(jié)束后柱內(nèi)氧化鋁等吸附介質(zhì)與初始質(zhì)量的差值，即得洗脫過程中柱內(nèi)氧化鋁等吸附介質(zhì)中殘留的未知組分質(zhì)量。據(jù)式(4)計算各組分在原油總質(zhì)量中的含量p，據(jù)式(1)計算各組分較對照的相對增率。

式中：w2及w1分別表示組分接受瓶與瓶內(nèi)某組分質(zhì)量之和及空瓶質(zhì)量，wck為原油總質(zhì)量。

1.4細菌發(fā)酵液對純?yōu)r青的降解

降解：準確稱取3.000g純?yōu)r青，溶解于30ml四氯化碳中制成均一的瀝青溶液。加5滴瀝青溶液于已稱重載玻片(質(zhì)量為m0)上，小心轉(zhuǎn)動載玻片鋪平瀝青溶液，待四氯化碳自然揮發(fā)，純?yōu)r青即均勻附著于載玻片上，此時瀝青載玻片質(zhì)量為m1。將瀝青載玻片置紫外線照射下滅菌30min后，水平放置于已滅菌的含100ml牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的500ml玻璃瓶中，待冷卻后接種10ml細菌種子液，37℃培養(yǎng)35d，每天輕輕搖動組培瓶4次。待培養(yǎng)結(jié)束后，取出瀝青載玻片，蒸餾水輕柔沖洗3次，自然風干，稱取此時瀝青載玻片質(zhì)量m2；向培養(yǎng)液中加入100ml四氯化碳，充分搖勻，使作用過程中進入培養(yǎng)液的瀝青溶于有機相，回收有機相，蒸干稱重(m3)，則細菌發(fā)酵液對瀝青的降解量為m1+m3-m2。試驗每個處理重復3次。將發(fā)酵液對瀝青的降解量占初始瀝青附著質(zhì)量的比率定義為瀝青降解率(asphaltdegradationefficiency,ade％)，據(jù)式(5)計算。據(jù)式(1)計算細菌發(fā)酵液處理較對照的增率。

族組成：將培養(yǎng)結(jié)束后瀝青載玻片表面的瀝青(質(zhì)量為m2-m0)用30ml正己烷溶解，按照1.3方法測定細菌發(fā)酵液處理瀝青族組成。

瀝青微形態(tài)：將細菌作用后的瀝青載玻片分別于放大2倍(反射光)，20倍(透射光)及40倍(透射光)拍照，觀察載玻片表面附著瀝青微形態(tài)變化。

1.5細菌發(fā)酵液對原油的驅(qū)替

1.5.1驅(qū)油材料及裝置

模擬驅(qū)油用油：采自中國陜北延長油田，該油樣飽和烴含量為684.50g/kg，芳香烴含量108.33g/kg，膠質(zhì)39.83g/kg，瀝青質(zhì)含量39.50g/kg，未知組分含量為77.00g/kg。

pseudomonastaiwanensisc-2發(fā)酵液(fermentationbroth,fb)：于600ml組培瓶中加入150ml驅(qū)油用細菌培養(yǎng)基，121℃滅菌30min，待冷卻后接種5mlpseudomonastaiwanensisc-2種子液(用接種環(huán)從細菌斜面挑取1環(huán)菌體接種至100ml滅菌的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37℃，150r/min搖床振蕩培養(yǎng)3d)，37℃，150r/min搖床振蕩培養(yǎng)5d，4℃保存待用。

模擬驅(qū)油裝置：包括驅(qū)油裝置基本組成、驅(qū)油管結(jié)構和采氣裝置，具體為：壓力表a1、壓縮空氣入口b1、壓縮空氣出口c1、模擬驅(qū)油管d1、上端進出閥門a2、下端進出閥門e2、驅(qū)替液貯存管b2、快裝卡箍c2、油沙管d2、不銹鋼濾板g2、棉質(zhì)濾布h2、密封墊圈f2、采氣管密封玻棒a3、采氣注射器針頭b3、驅(qū)油管上端出口連接的導管c3，各部件詳見圖6。

1.5.2模擬驅(qū)油驅(qū)油管準備

油沙管填充材料：細沙，粒徑0.15-0.25mm(60-100目)，其中，石英為78％，長石6％，重質(zhì)礦物16％。用2mol/l稀鹽酸溶液浸泡細沙12h，用大量自來水沖洗，以除掉其中的caco3等酸溶鹽及水溶性鹽，再用純水除去殘留的礦質(zhì)離子；80℃烘干后用磁鐵去除沙粒中的鐵屑，密封裝袋備用。用排水法測定真體積，計算得真密度ρ為2.56g/cm³。

油沙管準備及驅(qū)油管組裝：在空油沙管下端鋪好濾布、不銹鋼濾板后加硅膠墊圈，與下端閥門準確對接后用快裝卡箍將二者組合，垂直放置；將300.0g細沙分次從空油沙管上端均勻裝填到油沙管中，每次裝填后均用直徑為24mm的平頭圓木棒搗實。待全部細沙裝填完畢，用木棒自下而上環(huán)油沙管均勻敲擊油沙管外壁5min，保證管內(nèi)細沙達到致密狀態(tài)；在裝滿細沙的油沙管上端加濾布、不銹鋼濾板及硅膠墊圈，再用快裝卡箍將油沙管與驅(qū)替液貯存管及上端閥門連接，組裝成完整的模擬驅(qū)油管。在制備好的油沙管中，沙芯柱高290mm，直徑29mm，容重1.57g/cm³，根據(jù)公式(6)計算，沙芯柱的孔隙度為38.8％。沙芯孔隙體積(porevolume,pv)為74.3cm³。

原油填充：將100ml原油加入到200ml燒杯中，60℃水浴溶化，擦干燒杯外壁，稱量燒杯與原油的初始總質(zhì)量(m1)；關閉驅(qū)油管下端開關，將約100ml原油灌入驅(qū)替液貯存管；加墊圈后用快裝卡箍將驅(qū)替液貯存管與上端閥門及壓縮空氣導管連接；將此燒杯置于油沙管下端出口，打開驅(qū)油管上下開關，從驅(qū)替液貯存管上端通入0.1mpa壓縮空氣，將驅(qū)替液貯存管內(nèi)原油壓入油沙管內(nèi)，使原油進入沙芯孔隙中并附著在組成多孔體的沙粒載體表面；繼續(xù)通入壓縮空氣，使油沙管內(nèi)多余原油流入下端的接收燒杯中，直至出口不再有油滴滴下繼續(xù)用壓縮空氣驅(qū)替30min，保證沙芯柱孔隙中的游離態(tài)原油盡可能被空氣驅(qū)出。關閉驅(qū)油管上下開關，稱量此時燒杯及杯內(nèi)原油總質(zhì)量(m2)，m1與m2之差為油沙管內(nèi)沙芯多孔體吸附的原油質(zhì)量。將驅(qū)油管置28℃培養(yǎng)箱老化24h，使油沙管沙芯多孔體中的原油進一步均勻分布于沙粒載體表面。

松結(jié)合態(tài)原油驅(qū)除：保溫老化結(jié)束后取出驅(qū)油管，向驅(qū)替液貯存管中加入100ml45℃純水，將已定量(m3)的250ml三角瓶c1置于油沙管下端出口，打開驅(qū)油管上下開關，從驅(qū)替液貯存管上端持續(xù)通入0.1mpa壓縮空氣，至驅(qū)油管下端出口不再有水滴流出時關閉空氣壓縮機，此時隨純水流出的原油為沙芯多孔體孔隙中可用水驅(qū)出的松結(jié)合態(tài)原油。將c1置于4℃冰箱中冷卻，待原油凝固后小心倒出三角瓶c1內(nèi)純水，使原油附著到三角瓶c1瓶壁上，自然風干三角瓶c1，稱取c1質(zhì)量(m4)，m4與m3之差為水驅(qū)松結(jié)合態(tài)原油質(zhì)量。(m2-m1)-(m4-m3)為油沙管初始含油量。

1.5.3原油驅(qū)替

方案：對照組ck，連續(xù)2批次均為水驅(qū)；實驗組c-2，連續(xù)2批次均為發(fā)酵液fb驅(qū)。每批次培養(yǎng)7d，溫度40℃。

驅(qū)替方法：

fb驅(qū)替：向驅(qū)油管的驅(qū)替液貯存管中加入100mlfb，將已定量(m5)的250ml三角瓶c2置于油沙管下端出口下方，開打驅(qū)油管上下端開關，從驅(qū)油管上端緩慢通入0.1mpa壓縮空氣，待發(fā)酵液逐滴流出約20ml時關閉空氣壓縮機，將流出的fb再次返回驅(qū)替液貯存管，相同步驟重復3次，以保證fb充滿沙芯多孔體孔隙中。向驅(qū)替液貯存管內(nèi)加滿驅(qū)替液，排凈空氣后關閉驅(qū)油管上下端開關，結(jié)束注入。將已完成fb充填的驅(qū)油管置于40℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)7d。

水驅(qū)(ck)：以100ml純水代替fb，共進行2批次驅(qū)替，操作過程同fb。

1.5.4驅(qū)出原油分析

原油收集及質(zhì)量測定：將三角瓶c2放于油沙管下端，連續(xù)通入壓縮空氣至油沙管下端出口不再有發(fā)酵液流出時關閉空氣壓縮機。另取已定量(m6)的250ml三角瓶c3置于油沙管下端，依照同一步驟向驅(qū)替液貯存管加入100ml45℃純水，由驅(qū)替液貯存管上端持續(xù)通入0.1mpa壓縮空氣，以驅(qū)出油沙管內(nèi)殘余發(fā)酵液。將c2、c3置于4℃冰箱中冷卻，待原油凝固后小心倒出三角瓶內(nèi)水相。自然風干c2、c3，使原油附著到三角瓶壁上，稱取c2質(zhì)量(m7)，c3質(zhì)量(m8)。質(zhì)量m8+m7-m6-m5即為發(fā)酵液驅(qū)出的吸附態(tài)原油質(zhì)量。驅(qū)油率odr％(oildisplacementrate,odr％)據(jù)式(7)計算，處理較水驅(qū)處理增率⊿ck％據(jù)式(8)計算：

式(8)中：mt和mck分別表示處理與水驅(qū)處理的各參數(shù)值。

1.5.5代謝產(chǎn)物分離及鑒定

取發(fā)酵液3.0l，按照文獻《isolationofproline-basedcyclicdipeptidesfrombacillussp.nstrainassociatedwithrhabitidentomopathogenicnematodeanditsantimicrobialproperties》中的方法萃取并鑒定代謝產(chǎn)物。

利用sas9.2(sasinstituteinc,cary,nc,usa)對所有數(shù)據(jù)進行相關性分析及差異顯著性檢驗。

2結(jié)果與分析

2.1細菌發(fā)酵液對純?yōu)r青的降解及微形態(tài)的影響

由表1看出，經(jīng)過細菌發(fā)酵液處理，c-2對瀝青載玻片上純?yōu)r青的降解率為8.67％，為對照的37.7倍，與對照差異達到顯著水平(p<0.05)。經(jīng)細菌c-2發(fā)酵液處理，純?yōu)r青中飽和烴較對照增加11.2％；芳香烴，膠質(zhì)及未知組分含量較對照分別降低29.7％、30.2％(p<0.05)及27.9％。

圖4為臺灣假單胞菌pseudomonastaiwanensisc-2作用瀝青玻片后瀝青在玻片上的分布形態(tài)圖，由圖4看出，細菌發(fā)酵液處理后載玻片附著瀝青的微形態(tài)發(fā)生了顯著變化。載玻片放大2倍時，對照載玻片表面附著的純?yōu)r青呈均勻不透明黑色，c-2處理載玻片上附著的瀝青表面出現(xiàn)較多透明斑。放大20倍時，對照僅有少量小透明斑，而c-2處理載玻片附著的瀝青上透明斑面積遠大于對照。放大40倍時，對照處理載玻片上附著的瀝青呈薄而均勻狀態(tài)，c-2處理載玻片上附著的瀝青均呈不同程度的聚集隆起態(tài)。

表1細菌發(fā)酵液處理后純?yōu)r青降解率及族組成的變化

2.2細菌發(fā)酵液對原油中瀝青的降解及原油族組成的影響

族組成：由表2看出，經(jīng)細菌發(fā)酵液處理，原油中瀝青、膠質(zhì)及未知組分含量較對照分別降低41.1％、19.4％及83.4％，芳香烴降低19.7％，飽和烴含量較對照增加3.8％(p＞0.05)，瀝青及未知組分含量與對照的差異均達到顯著水平(p＜0.05)。

表2細菌發(fā)酵液處理后的原油族組成(g/kg)

2.3細菌發(fā)酵液的驅(qū)油特性

2.3.1表面活性及乳化性：從表3看出，在以原油為唯一碳源的液體培養(yǎng)體系中，細菌c-2能提高原油在油水共存體系中的乳化性。其中，c-2處理的乳化層穩(wěn)定時間約為對照的5.4倍，且能有效降低原油在瓶壁上的附著性。c-2的排油圈直徑達8.4cm，約為對照的10倍，即細菌c-2合成的表面活性物質(zhì)較多或活性較強。c-2在原油為唯一碳源時，其培養(yǎng)液液相的ph為6.85。

2.3.2附著性：從表3看出，接種細菌c-2處理的液體培養(yǎng)瓶壁干凈，原油附著少，原油與水相組成的體系乳化度高。細菌c-2在牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中生長時產(chǎn)泡沫較為細膩，表明其形成的表面活性物質(zhì)多或活性強。

表3細菌發(fā)酵液排油圈直徑及培養(yǎng)瓶壁上的原油附著量

注：原油附著量中“+++”、“++”及“+”分別表示瓶壁附著量為大量、少量及輕微。

2.3.3細菌發(fā)酵液對濾紙吸附原油的脫附作用：由表4看出，經(jīng)過細菌發(fā)酵液處理，c-2濾紙吸附態(tài)原油的脫附率為90.1％，為對照的3.1倍，與對照差異達到顯著水平(p<0.05)。在細菌發(fā)酵液對濾紙吸附原油的作用過程中，細菌發(fā)酵液的ph顯著下降(p<0.05)。圖5為pseudomonastaiwanensisc-2處理原油濾紙后濾紙上殘留原油的情況圖，從圖5看出，細菌發(fā)酵液處理吸附原油的濾紙后，濾紙上的殘存原油量大幅度減少，與對照ck差異顯著(p<0.05)。

表4細菌發(fā)酵液處理濾紙原油脫附率oer％

2.3.4黏度與排油活性：由表5看出，經(jīng)過細菌c-2發(fā)酵液作用，35℃時的原油粘度較對照顯著降低(p<0.05)，降低幅度為34.6％；排油圈直徑為對照的36.6倍；培養(yǎng)后發(fā)酵液ph下降2.4個單位，與對照差異顯著(p<0.05)。

表5細菌發(fā)酵液處理原油粘度、濾紙原油脫附率及發(fā)酵液反應前后ph變化

注：表中同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(p＜0.05)。

2.3.5產(chǎn)表面活性物質(zhì)

經(jīng)鑒定，細菌c-2可產(chǎn)生1種具有表面活性的代謝產(chǎn)物td03，其結(jié)構及分子式如下：

td03：30.9,48.6,114.5,127.3,141.0,154.9

4-methyl-phenol：分子式c7h8o；¹hnmr(600mhz,dmso-d6)δ:6.96(2h,d,j＝8.6hz,h-2,h-3),6.61(2h,d,j＝8.6hz,h-5,h-6),1.51(3h,s)；¹³cnmr(125mhz,dmso-d6)δ:154.9(),141.0(c-8),127.3(c-7),114.5(c-3,c-5),30.9(ch3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(maetal.,2006)報道基本一致，故鑒定為4-methyl-phenol。

2.4驅(qū)油效果

2.4.1驅(qū)油量和驅(qū)油率

由表6看出，c-2發(fā)酵液在驅(qū)替原油過程中總驅(qū)油率、總驅(qū)油量均顯著高于對照水驅(qū)(p＜0.05)。在2批次驅(qū)替過程中，第1和第2批次發(fā)酵液處理的驅(qū)油率、驅(qū)油量均高于對照水驅(qū)，其中第2批次的差異達到顯著水平(p＜0.05)。表明細菌發(fā)酵液有較強的原油驅(qū)出能力。

表62次驅(qū)替過程中驅(qū)油量及驅(qū)油率

上述實施例表明，臺灣假單胞菌pseudomonastaiwanensisc-2對原油中的瀝青有強烈的降解作用，降解率為41.4％(p<0.05)；對純?yōu)r青的降解率為8.8％。細菌c-2處理對殘留純?yōu)r青的族組成產(chǎn)生顯著影響：飽和烴增加11.2％，芳香烴、膠質(zhì)及大分子未知組分含量下降，其中膠質(zhì)含量的降幅較對照達到顯著水平(p<0.05)；改變了附著態(tài)純?yōu)r青的微形態(tài)：玻片表面純?yōu)r青的附著狀態(tài)由均勻薄層轉(zhuǎn)化為不均勻的聚集隆起態(tài)，同時出現(xiàn)大量無瀝青透明斑。另外，供試細菌對原油中瀝青的降解率遠高于對純?yōu)r青的降解，表明原油中其他輕質(zhì)組分有助于提高瀝青降解率，可能與這些組分對瀝青的增溶作用有關。此外，原油中存在的疏水與親水結(jié)構單元，有助于表面活性物質(zhì)發(fā)揮作用，促進細菌對原油中重質(zhì)組分的降解。供試細菌對瀝青降解作用表明，該菌在高瀝青含量的稠油油藏微生物強化采油中有較大的應用潛力。

從以上供試pseudomonastaiwanensisc-2對純?yōu)r青及原油中大分子組分有較強的降解作用可知，供試細菌可分泌能打開稠環(huán)化合物中芳香環(huán)系、環(huán)烷環(huán)系等單體之間化學鍵的酶類，將瀝青質(zhì)降解為膠質(zhì)，再逐級降解為芳香烴、烷烴。

供試細菌pseudomonastaiwanensisc-2處理可使35℃時的原油粘度下降34.6％(p<0.05)，且有較強的表面活性物質(zhì)合成能力及產(chǎn)酸能力。生物表面活性物質(zhì)能夠降低油水界面張力，使原油的粘附能力大幅度降低。細菌在利用濾紙上的原油時會代謝產(chǎn)酸，產(chǎn)生的酸性物質(zhì)也能夠改善油水間的界面張力，進而改變原油的流動性，提升脫附率。

供試細菌pseudomonastaiwanensisc-2的代謝產(chǎn)物4-methyl-phenol為醇類物質(zhì)，可溶解油脂，pseudomonastaiwanensisc-2能夠乳化原油與4-methyl-phenol產(chǎn)生有關。驅(qū)油微生物的活動主要在油一水界面進行，石油的疏水性阻礙了油的分散程度，直接降低了微生物與油珠接觸的表面積，降低了微生物對石油的作用效果。原油乳化可大幅度提高原油的分散程度，增加細菌細胞與油珠的接觸機會，促進微生物對石油烴的吸收、降解及轉(zhuǎn)化。

綜上所述，本發(fā)明提供的臺灣假單胞菌pseudomonastaiwanensisc-2能以原油為唯一碳源生長，且能顯著改善原油乳化性，降低原油附著性及粘度，對瀝青及原油中的重質(zhì)組分有較強的降解轉(zhuǎn)化能力，能提高原油中輕質(zhì)組分含量，具有良好的原油驅(qū)替及提高原油品質(zhì)能力，在meor中具有重要應用潛力。

雖然，本說明書中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。

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<110>陜西博秦生物工程有限公司西北農(nóng)林科技大學

<120>一株臺灣假單胞菌及其應用

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