本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗生素fusaricidina的制備方法。

背景技術(shù)：

抗生素(antibiotic)是由微生物(包括細(xì)菌、真菌、放線菌屬)或高等動植物在生活過程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其它活性的一類次級代謝產(chǎn)物，能干擾其他生活細(xì)胞發(fā)育功能的化學(xué)物質(zhì)?？股氐奶攸c(diǎn)有：(1)直接作用于菌體細(xì)胞?？股啬苓x擇性地作用于菌體細(xì)胞dna、rna和蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的特定環(huán)節(jié)，干擾細(xì)胞的代謝作用，妨礙生命活動或使停止生長，甚至死亡。(2)具有選擇性抗生譜。不同抗生素對不同病原菌的作用不一樣，對某種抗生素敏感的病原菌種類稱為該抗生素的抗生譜(抗菌譜)，這一點(diǎn)不同于無選擇性的普通消毒劑或殺菌劑。(3)有效作用濃度低。各種抗生素一般都在很低濃度下對病原菌就發(fā)生作用，這是抗生素區(qū)別于其他化學(xué)殺菌劑的又一主要特點(diǎn)。各種抗生素對不同微生物的有效濃度各異，通常以抑制微生物生長的最低濃度作為抗生素的抗菌強(qiáng)度，簡稱有效濃度。有效濃度越低，表明抗菌作用越強(qiáng)。

fusaricidins類抗生素是由6個氨基酸殘基和1個15-胍基-3-羥基十五烷酸(ghpd)組成的環(huán)狀多肽類抗生素，分子量大都是900da左右。自20世紀(jì)90年代至今，從多粘類芽孢桿菌中分離出的fusaricidins類抗生素主要有l(wèi)i-f03、li-f04、li-f05、li-f06、li-f07、li-f08以及fusaricidinsa、b、c、d。各種fusaricidins類抗生素結(jié)構(gòu)基本相同，具有相同的側(cè)鏈，只是氨基酸殘基有所不同。結(jié)構(gòu)上的類似使得它們具有相同或相近的生物活性，即對革蘭氏陽性菌和植物病原真菌有很好的抗菌效果。

中國專利申請cn103740618a公開了類芽孢桿菌屬的一個新菌種(后被定名為牛類芽孢桿菌，paenibacillusbovis)，并將其中的模式菌株bd3526于2013年10月14日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(cgmcc)，該菌株的保藏編號為：cgmccno.8333，該菌株的菌落非常粘稠，表明該菌株具有高產(chǎn)胞外多糖的生理特性。此外，中國專利申請cn104757544a和cn104762350a公開了該菌株具有代謝天然培養(yǎng)基產(chǎn)抑菌性物質(zhì)的能力及其應(yīng)用，但并未揭示代謝產(chǎn)物中發(fā)揮抑菌作用的明確組分。

縱覽有關(guān)抗生素fusaricidina的報道，發(fā)現(xiàn)其來源相對狹窄，無一例外地均產(chǎn)自多粘類芽孢桿菌(paenibacilluspolymyxa)，導(dǎo)致這類抗生素來源不足。其次，從培養(yǎng)基角度來看，前期的報道皆采用化學(xué)合成培養(yǎng)基，這將直接影響目標(biāo)物fusaricidina制備的成本和使用的安全性。上述這些都是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種抗生素fusaricidina制備的新方法，以牛類芽孢桿菌cgmccno.8333為發(fā)酵菌株，以麩皮培養(yǎng)基作為培養(yǎng)介質(zhì)，發(fā)酵制得抗生素fusaricidina。

具體地，提供了一種抗生素fusaricidina的制備方法，包括以下步驟：(a)將牛類芽孢桿菌(paenibacillusbovis)cgmccno.8333接種于麩皮培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，得到發(fā)酵液；(b)將步驟(a)得到的發(fā)酵液離心取上清，置于高溫水浴中滅活蛋白酶，待冷卻后，加入正丁醇萃取，離心取正丁醇相，除去正丁醇，加水溶解，冷凍干燥，得到粗品1；(c)將步驟(b)得到的粗品1通過凝膠柱分離，收集抑菌活性組分，冷凍干燥，得到粗品2；(d)將步驟(c)得到的粗品2通過hplc純化，收集抑菌活性組分，冷凍干燥，即得抗生素fusaricidina。

進(jìn)一步地，上述步驟(a)中，牛類芽孢桿菌cgmccno.8333的接種量為1.6x10⁶～8x10⁶cfu/ml。

進(jìn)一步地，上述步驟(a)中，麩皮培養(yǎng)基包括麩皮和水，麩皮占麩皮培養(yǎng)基的質(zhì)量百分比為2～6％。

進(jìn)一步地，上述步驟(a)中，發(fā)酵為振蕩培養(yǎng)，振蕩速度為100～300rpm。

進(jìn)一步地，上述步驟(a)中，發(fā)酵的溫度為25℃～35℃。

進(jìn)一步地，上述步驟(a)中，發(fā)酵的時間為48～96h。

進(jìn)一步地，上述步驟(b)中，離心的速度為6,000～10,000g，離心的時間為10～20分鐘。

進(jìn)一步地，上述步驟(b)中，高溫水浴的溫度為60～80℃，保溫時間為10～30分鐘。

進(jìn)一步地，上述步驟(b)中，正丁醇加入量為發(fā)酵液體積的0.5～2倍，萃取次數(shù)為3～5次，每次萃取靜置的時間為8～16h。

進(jìn)一步地，上述步驟(c)中，凝膠柱為lh20凝膠柱，規(guī)格為d2.6cm×30cm，分離條件包括：以體積比為3的甲醇-水溶液進(jìn)行等度洗脫，洗脫速度為2ml/min，洗脫液的收集速度為2.5min/管。

進(jìn)一步地，上述步驟(d)中，hplc采用的色譜柱為c18柱，規(guī)格為sunfirec18柱，20mm×250mm，粒徑5μm，分離條件包括：以含0.1％tfa的水作為a相，含0.1％tfa的乙腈作為b相進(jìn)行梯度洗脫，洗脫速度為4ml/min，洗脫液的收集速度為1.5min/管。收集保留時間在21.2min的組分，即可得到抗生素fusaricidina。

上述技術(shù)方案中的制備方法，首次采用牛類芽孢桿菌(paenibacillusbovis)cgmccno.8333，以麩皮培養(yǎng)基作為培養(yǎng)介質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵，并經(jīng)過離心、萃取，凝膠柱分離、hplc純化、冷凍干燥，制備得到抗生素fusaricidina，披露了牛類芽孢桿菌cgmccno.8333具有發(fā)酵麩皮培養(yǎng)基生成抗生素fusaricidina的新用途，拓寬了抗生素fusaricidina的來源。同時，純天然、廉價的麩皮培養(yǎng)基，避免使用化學(xué)合成培養(yǎng)基，令制得的抗生素fusaricidina具有更高的使用安全性、更低的制備成本。

生物材料保藏信息：

本發(fā)明提供的類芽孢桿菌(paenibacillussp.)bd3526菌株，已于2013年10月14日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，郵編：100101。該菌株的保藏編號為：cgmccno.8333。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中粗品1在lh20凝膠柱上的分離效果。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中粗品1在lh20凝膠柱上分離后點(diǎn)種法檢測抑菌活性的效果。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中粗品2在hplc上的純化效果。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例1中抑菌活性組分的esi-ms圖譜。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例1中抑菌活性組分的二級質(zhì)譜圖。

具體實(shí)施方式

為更清楚的對本發(fā)明技術(shù)方案予以闡述，下面將結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行進(jìn)一步闡述：

在面臨“如何拓寬抗生素fusaricidina的來源，且避免使用化學(xué)合成培養(yǎng)基”這一技術(shù)問題時，發(fā)明人經(jīng)過創(chuàng)造性勞動，提供一種抗生素fusaricidina的制備方法，包括以下步驟：(a)將牛類芽孢桿菌(paenibacillusbovis)cgmccno.8333接種于麩皮培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，得到發(fā)酵液；(b)將步驟(a)得到的發(fā)酵液離心取上清，置于高溫水浴中滅活蛋白酶，待冷卻后，加入正丁醇萃取，離心取正丁醇相，除去正丁醇，加水溶解，冷凍干燥，得到粗品1；(c)將步驟(b)得到的粗品1通過凝膠柱分離，收集、檢測、合并抑菌活性組分，冷凍干燥，得到粗品2；(d)將步驟(c)得到的粗品2通過hplc純化，收集、檢測、合并抑菌活性組分，冷凍干燥，即得抗生素fusaricidina。

上述技術(shù)方案中的制備方法，首次采用牛類芽孢桿菌(paenibacillusbovis)cgmccno.8333，以麩皮培養(yǎng)基作為培養(yǎng)介質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵，并經(jīng)過離心、萃取，凝膠柱分離、hplc純化，冷凍干燥，制備得到抗生素fusaricidina，披露了牛類芽孢桿菌cgmccno.8333具有發(fā)酵麩皮培養(yǎng)基生成抗生素fusaricidina的新用途，拓寬了抗生素fusaricidina的來源。同時，純天然、廉價的麩皮培養(yǎng)基，令制得的抗生素fusaricidina具有更高的使用安全性、更低的制備成本。麩皮培養(yǎng)基來源廣泛、成本低廉、天然安全，避免使用化學(xué)合成培養(yǎng)基；加上發(fā)酵菌種采用牛類芽孢桿菌這一種單一菌種，上述的原料、菌種的組合，有利于產(chǎn)品品質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)化與工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)的成本控制。

進(jìn)一步地，步驟(a)中，牛類芽孢桿菌cgmccno.8333的接種量為1.6x10⁶～8x10⁶cfu/ml；較佳地為3.2x10⁶～6.4x10⁶cfu/ml，更佳地為4.8x10⁶cfu/ml。

進(jìn)一步地，上述步驟(a)中，麩皮培養(yǎng)基包括麩皮和水，麩皮占麩皮培養(yǎng)基的質(zhì)量百分比為2～6％。制備方法可以包括以下步驟：在蒸餾水中加入麩皮，混勻充分后，95～125℃滅菌5～20分鐘，冷卻即得。

進(jìn)一步地，上述步驟(a)中，優(yōu)選的發(fā)酵方式為振蕩培養(yǎng)，振蕩速度為100～300rpm；較佳地為150～250rpm；更佳地為200rpm。

進(jìn)一步地，上述步驟(a)中，優(yōu)選的發(fā)酵溫度為25℃～35℃；較佳地為28℃～32℃；更佳地為30℃。

進(jìn)一步地，上述步驟(a)中，優(yōu)選的發(fā)酵時間為48～96h；較佳地為60～84小時；更佳地為72小時。

結(jié)合對比例1亦可知，在優(yōu)選發(fā)酵參數(shù)的范圍之外時，牛類芽孢桿菌cgmccno.8333發(fā)酵麩皮培養(yǎng)基，再經(jīng)過滅活蛋白酶、離心后得到的麩皮發(fā)酵液上清對金黃色葡萄球菌的抑菌效果明顯下降了。而在優(yōu)選范圍之內(nèi)，接種量、麩皮含量、振蕩速度、發(fā)酵溫度和時間相互配合，形成一個完整的優(yōu)選方案，使得牛類芽孢桿菌cgmccno.8333發(fā)酵產(chǎn)生的抑菌活力更佳。

進(jìn)一步地，上述步驟(b)中，優(yōu)選的離心的速度為6,000～10,000g，較佳地為7,000～9,000g，更佳地為8,000g；優(yōu)選的離心時間為10～20分鐘，較佳地為13～17分鐘，更佳地為15分鐘。

進(jìn)一步地，上述步驟(b)中，高溫水浴的溫度較佳地為60～80℃，更佳地為65～75℃，最優(yōu)地為70℃；保溫時間較佳地為10～30分鐘，更佳地為15～25分鐘，最優(yōu)地為20分鐘。

進(jìn)一步地，上述步驟(b)中，正丁醇加入量較佳地為發(fā)酵液體積的0.5～2倍，更佳地為0.75～1.5倍，最佳地為1倍；萃取次數(shù)較佳地為3～5次，更佳地為4次；每次萃取靜置的時間較佳地為8～16h，更佳地為10～14h，最佳地為12h。

進(jìn)一步地，上述步驟(b)中，正丁醇的去除方法采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)技術(shù)或平行蒸發(fā)技術(shù)。

進(jìn)一步地，上述步驟(b)中，上述的冷凍干燥為真空冷凍干燥，真空冷凍干燥條件較佳地為：板層極限溫度≤-60℃，冷阱極限溫度-70℃，板層裝料厚度0.5～2.0mm，真空度10～30pa。

進(jìn)一步地，上述步驟(c)中，凝膠柱為lh20凝膠柱，規(guī)格為d2.6cm×30cm，流動相較佳地為體積比為3：1的甲醇-水溶液；洗脫速度較佳地為2ml/min，洗脫液的收集速度為2.5min/管。

進(jìn)一步地，上述步驟(d)中，hplc采用的色譜柱為c18柱，規(guī)格為sunfirec18柱(20mm×250mm，粒徑5μm)，分離條件為：以含0.1％tfa的水(a相)和含0.1％tfa的乙腈(b相)進(jìn)行梯度洗脫，洗脫速度較佳地為4ml/min，洗脫液的收集速度為1.5min/管。

上述的步驟(a)(b)(c)(d)前后或步驟之間，在不影響本發(fā)明的核心思想的基礎(chǔ)上本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以增加其他合理的步驟，亦包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

下面通過實(shí)施例進(jìn)一步說明上述具體實(shí)施方式，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。實(shí)施例中所使用的試劑若未加說明，均為分析純試劑，購買自國藥集團(tuán)。其他試驗(yàn)儀器、菌種，如未做特別說明，均可通過商業(yè)途徑直接購得。

實(shí)施例1

1、材料與方法

(a)種子(發(fā)酵菌種)的制備：將牛類芽孢桿菌cgmccno.8333(該菌株的來源請參見公開號為cn103740618a的中國專利)的凍干粉用少量無菌蒸餾水溶解，用接種環(huán)取一環(huán)劃線于tyc固體培養(yǎng)基(購買自oxoidco.，英國)，30℃好氧培養(yǎng)48h取出，用接種環(huán)挑取單菌落放入10mltyc液體培養(yǎng)基(購買自oxoidco.，英國)，運(yùn)用渦旋振蕩器將菌落均勻分散于液體培養(yǎng)基內(nèi)，30℃、180rpm振蕩培養(yǎng)24h取出，以2％(v/v)接種量接種于tyc液體培養(yǎng)基(購買自oxoidco.，英國)，30℃、180rpm振蕩培養(yǎng)24h后，培養(yǎng)物15,000rpm離心10分鐘，棄去上清，菌體用無菌蒸餾水洗滌2次后，用原培養(yǎng)體積的無菌蒸餾水懸浮，得到發(fā)酵用的種子，種子液的菌濃度為1.6x10⁸cfu/ml。

(b)麩皮培養(yǎng)基的制備：將質(zhì)量百分比為4％的麩皮與蒸餾水充分混勻，在125℃下滅菌5min，冷卻至室溫，即得所需濃度的麩皮培養(yǎng)基。

(c)凝膠柱分離：將待分離樣品(下述的粗品1)溶解于流動相(體積比為3：1的甲醇-水溶液)中配制成濃度為50mg/ml的溶液，取2ml上樣于lh20凝膠柱(規(guī)格為d2.6cm×30cm)，以2ml/min的流速進(jìn)行等度洗脫，以2.5min/管的速度收集洗脫液，平行蒸發(fā)儀蒸干，向各管中加入200μl無菌水，以點(diǎn)種法測定各管的抑菌活性，合并抑菌活性組分，冷凍干燥。

(d)hplc純化：將待純化樣品(下述的粗品2)溶解于31％(v/v)的乙腈溶液中配制成濃度為20mg/ml的溶液，取200μl上樣于配備有c18柱(sunfirec18柱：20mm×250mm，5μm)的半制備型hplc，采用含0.1％tfa的水(a相)和含0.1％tfa的乙腈(b相)，以4ml/min的流速進(jìn)行梯度洗脫(梯度洗脫步驟如下表1所示)，以1.5min/管的速度收集洗脫液，平行蒸發(fā)儀蒸干，向各管中加入200μl無菌水，以點(diǎn)種法測定各管的抑菌活性，合并抑菌活性組分，冷凍干燥。

表1梯度洗脫步驟

(e)樣品抑菌活性的檢測方法：點(diǎn)種法。待測樣品溶解于無菌水中，吸取10μl滴于鋪有金黃色葡萄球菌(cgmcc1.879，購自cgmcc)作為指示菌的營養(yǎng)瓊脂平板上，置于37℃培養(yǎng)24小時，觀察抑菌圈的有無和大小。抑菌圈直徑越大，抑菌效果越佳。

2、抗生素fusaricidina的制備

將牛類芽孢桿菌cgmccno.8333種子以接種量3％(v/v)無菌接種于4％(w/w)麩皮培養(yǎng)基中，30℃、200rpm培養(yǎng)72小時得發(fā)酵液。

將發(fā)酵液8,000g離心15min取上清，置于70℃水浴保溫20分鐘滅活蛋白酶，待冷卻后，加入1倍發(fā)酵液體積的正丁醇充分混勻，靜置12小時后，8,000g離心15min取正丁醇相，重復(fù)上述萃取步驟3次，合并萃取后的正丁醇相用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去正丁醇，加入少量蒸餾水溶解完全后，冷凍干燥得到粗品1。

將粗品1先進(jìn)行l(wèi)h20凝膠柱分離，分離效果如圖1所示，點(diǎn)種檢測抑菌活性的效果如圖2所示，圖2中培養(yǎng)皿的19～24標(biāo)注的6塊區(qū)域依次分別對應(yīng)了lh20凝膠柱分離洗脫下來的管號19～24，不同管中的洗脫液被取出少量用于點(diǎn)種法滴在平板上進(jìn)行抑菌活性檢測。合并19～24管內(nèi)的活性組分得到粗品2，再經(jīng)hplc純化(純化效果如圖3所示)，發(fā)現(xiàn)保留時間在21.2min的組分具有抑菌活性，收集該組分，即得抗生素fusaricidina。

3、抗生素fusaricidina結(jié)構(gòu)的確定

將上述hplc純化后的抑菌活性組分進(jìn)行esi-ms分析，結(jié)果如圖4所示，該活性組分的質(zhì)荷比為883.5578，換算后，該組分的分子量為882da，與抗生素fusaricidina(li-f04a)相同。

為進(jìn)一步確認(rèn)本專利中抑菌物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，繼續(xù)對該組分進(jìn)行了二級質(zhì)譜分析，結(jié)果如圖5所示，活性組分有一個穩(wěn)定的離子峰m/z256.2715，與抗生素fusaricidina(li-f04a)特征結(jié)構(gòu)ghpd的離子峰相同；此外，離子峰m/z698-597-498-399-297分別代表thr-val-val-thr，m/z72則是ala氨基酸殘基的離子峰，這些離子峰均與抗生素fusaricidina(li-f04a)高度一致。

綜上所述，通過上述的制備方法所制得的抑菌活性物質(zhì)是抗生素fusaricidina。

實(shí)施例2

1、材料與方法

(a)種子(發(fā)酵菌種)的制備：同實(shí)施例1。

(b)麩皮培養(yǎng)基的制備：將質(zhì)量百分比為6％的麩皮與蒸餾水充分混勻，在95℃下滅菌20min，冷卻至室溫，即得所需濃度的麩皮培養(yǎng)基。

(c)凝膠柱分離、hplc純化及樣品抑菌活性的檢測方法：同實(shí)施例1。

2、抗生素fusaricidina的制備

將牛類芽孢桿菌cgmccno.8333種子以接種量1％(v/v)無菌接種于6％(w/w)麩皮培養(yǎng)基中，35℃、100rpm培養(yǎng)96小時得發(fā)酵液。

將發(fā)酵液10,000g離心10min取上清，置于80℃水浴保溫10分鐘滅活蛋白酶，待冷卻后，加入0.5倍發(fā)酵液體積的正丁醇充分混勻，靜置16小時后，10,000g離心10min取正丁醇相，重復(fù)上述萃取步驟5次，合并萃取后的正丁醇相用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去正丁醇，加入少量蒸餾水溶解完全后，冷凍干燥得到粗品1。

進(jìn)一步的lh20凝膠柱分離、hplc純化步驟與實(shí)施例1相同，制得抗生素fusaricidina。

3、抗生素fusaricidina結(jié)構(gòu)的確定方法：同實(shí)施例1。

實(shí)施例3

1、材料與方法

(a)種子(發(fā)酵菌種)的制備：同實(shí)施例1。

(b)麩皮培養(yǎng)基的制備：將質(zhì)量百分比為2％的麩皮與蒸餾水充分混勻，在100℃下滅菌15min，冷卻至室溫，即得所需濃度的麩皮培養(yǎng)基。

(c)凝膠柱分離、hplc純化及樣品抑菌活性的檢測方法：同實(shí)施例1。

2、抗生素fusaricidina的制備

將牛類芽孢桿菌cgmccno.8333種子以接種量5％(v/v)無菌接種于2％(w/w)麩皮培養(yǎng)基中，25℃、300rpm培養(yǎng)48小時得發(fā)酵液。

將發(fā)酵液6,000g離心20min取上清，置于60℃水浴保溫30分鐘滅活蛋白酶，待冷卻后，加入2倍發(fā)酵液體積的正丁醇充分混勻，靜置8小時后，6,000g離心20min取正丁醇相，重復(fù)上述萃取步驟3次，合并萃取后的正丁醇相用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去正丁醇，加入少量蒸餾水溶解完全后，冷凍干燥得到粗品1。

進(jìn)一步的lh20凝膠柱分離、hplc純化步驟與實(shí)施例1相同，制得抗生素fusaricidina。

3、抗生素fusaricidina結(jié)構(gòu)的確定方法：同實(shí)施例1。

實(shí)施例4

1、材料與方法

(a)種子(發(fā)酵菌種)的制備：同實(shí)施例1。

(b)麩皮培養(yǎng)基的制備：將質(zhì)量百分比為5％的麩皮與蒸餾水充分混勻，在120℃下滅菌10min，冷卻至室溫，即得所需濃度的麩皮培養(yǎng)基。

(c)凝膠柱分離、hplc純化及樣品抑菌活性的檢測方法：同實(shí)施例1。

2、抗生素fusaricidina的制備

將牛類芽孢桿菌cgmccno.8333種子以接種量2％(v/v)無菌接種于5％(w/w)麩皮培養(yǎng)基中，32℃、150rpm培養(yǎng)84小時得發(fā)酵液。

將發(fā)酵液9,000g離心13min取上清，置于65℃水浴保溫25分鐘滅活蛋白酶，待冷卻后，加入1.5倍發(fā)酵液體積的正丁醇充分混勻，靜置14小時后，9,000g離心13min取正丁醇相，重復(fù)上述萃取步驟5次，合并萃取后的正丁醇相用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去正丁醇，加入少量蒸餾水溶解完全后，冷凍干燥得到粗品1。

進(jìn)一步的lh20凝膠柱分離、hplc純化步驟與實(shí)施例1相同，制得抗生素fusaricidina。

3、抗生素fusaricidina結(jié)構(gòu)的確定方法：同實(shí)施例1。

實(shí)施例.

1、材料與方法

(a)種子(發(fā)酵菌種)的制備：同實(shí)施例1。

(b)麩皮培養(yǎng)基的制備：將質(zhì)量百分比為3％的麩皮與蒸餾水充分混勻，在110℃下滅菌12min，冷卻至室溫，即得所需濃度的麩皮培養(yǎng)基。

(c)凝膠柱分離、hplc純化及樣品抑菌活性的檢測方法：同實(shí)施例1。

2、抗生素fusaricidina的制備

將牛類芽孢桿菌cgmccno.8333種子以接種量4％(v/v)無菌接種于3％(w/w)麩皮培養(yǎng)基中，28℃、250rpm培養(yǎng)60小時得發(fā)酵液。

將發(fā)酵液7,000g離心17min取上清，置于75℃水浴保溫15分鐘滅活蛋白酶，待冷卻后，加入0.75倍發(fā)酵液體積的正丁醇充分混勻，靜置10小時后，7,000g離心17min取正丁醇相，重復(fù)上述萃取步驟4次，合并萃取后的正丁醇相用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去正丁醇，加入少量蒸餾水溶解完全后，冷凍干燥得到粗品1。

進(jìn)一步的lh20凝膠柱分離、hplc純化步驟與實(shí)施例1相同，制得抗生素fusaricidina。

3、抗生素fusaricidina結(jié)構(gòu)的確定方法：同實(shí)施例1。

對比例1

將實(shí)施例1中的接種量，麩皮含量，發(fā)酵溫度，發(fā)酵時間以及發(fā)酵振蕩的速度逐一進(jìn)行調(diào)整，獲得了以下一組不同方法制備的麩皮發(fā)酵液，將各組所得發(fā)酵液上清ph調(diào)節(jié)至7.0后，取100μl加入鋪有金黃色葡萄球菌作為指示菌的營養(yǎng)瓊脂平板上的牛津杯中，置于37℃培養(yǎng)24小時，觀察抑菌圈大小，結(jié)果如表2所示。

表2不同方法制備所得麩皮發(fā)酵液上清對金黃色葡萄球菌的抑制效果

上述方法同樣被用于測定實(shí)施例1～5所述方法制備的麩皮發(fā)酵液上清，其抑菌效果如表3所示。

表3實(shí)施例1～5制備的麩皮發(fā)酵液上清對金黃色葡萄球菌的抑制效果

參照表3所示的結(jié)果，在表2所示的結(jié)果中可以得出，將所述抗生素fusaricidina的制備方法中接種量，麩皮含量，培養(yǎng)溫度，發(fā)酵時間以及發(fā)酵振蕩的速度調(diào)整到優(yōu)選范圍之外的時候，牛類芽孢桿菌cgmccno.8333依然可以發(fā)酵麩皮產(chǎn)生抗生素fusaricidina，但是其產(chǎn)率明顯下降。

對比例2

參考實(shí)施例1的方法，比較由牛類芽孢桿菌cgmccno.8333、干酪乳桿菌(l.casei)atcc393(購買自atcc)、保加利亞乳桿菌(l.bulgaricus)lb340(由丹尼斯科公司提供)、嗜熱鏈球菌(s.thermophilus)st-body-3(由科.漢森公司提供)制備的麩皮發(fā)酵液上清對金黃色葡萄球菌的抑制效果，具體操作如下：

1、材料與方法

(a)種子(發(fā)酵菌種)的制備：

干酪乳桿菌和保加利亞乳桿菌種子的制備：將干酪乳桿菌atcc393和保加利亞乳桿菌lb340的凍干粉分別用少量無菌蒸餾水溶解，各自用接種環(huán)取一環(huán)劃線于mrs固體培養(yǎng)基(購買自merckco.德國)上，37℃厭氧培養(yǎng)24h取出，用接種環(huán)挑取單菌落放入1mlmrs液體(購買自merckco.德國)，運(yùn)用渦旋震蕩器將菌落均勻分散于液體培養(yǎng)基內(nèi)，37℃厭氧培養(yǎng)24h取出，以2％(v/v)接種量接種于50mlmrs液體，37℃培養(yǎng)24h后，培養(yǎng)物9,000rpm離心10分鐘，棄去上清，菌體用無菌蒸餾水洗滌2次后，用原培養(yǎng)體積的無菌蒸餾水懸浮，得到相應(yīng)的發(fā)酵用的種子。

嗜熱鏈球菌種子的制備：將嗜熱鏈球菌st-body-3的凍干粉用少量無菌蒸餾水溶解，用接種環(huán)取一環(huán)劃線于m17固體培養(yǎng)基(購買自merckco.德國)上，40℃厭氧培養(yǎng)24h取出，用接種環(huán)挑取單菌落放入1mlm17液體(購買自merckco.德國)，運(yùn)用渦旋震蕩器將菌落均勻分散于液體培養(yǎng)基內(nèi)，40℃厭氧培養(yǎng)24h取出，以2％(v/v)接種量接種于50mlm17液體，40℃培養(yǎng)24h后，培養(yǎng)物9,000rpm離心10分鐘，棄去上清，菌體用無菌蒸餾水洗滌2次后，用原培養(yǎng)體積的無菌蒸餾水懸浮，得到發(fā)酵用的種子。

(b)麩皮培養(yǎng)基的制備：同實(shí)施例1。

2、麩皮發(fā)酵液上清的制備

將各菌株以3％(v/v)接種量無菌接種于4％(w/w)麩皮培養(yǎng)基中，分別培養(yǎng)(保加利亞乳桿菌和干酪乳桿菌37℃厭氧培養(yǎng)，嗜熱鏈球菌40℃厭氧培養(yǎng)，牛類芽孢桿菌30℃、200rpm振蕩培養(yǎng))72h，獲得相應(yīng)的麩皮發(fā)酵液。

將上述發(fā)酵液按照實(shí)施例1中所述方法進(jìn)行滅活蛋白酶，離心，制備得到麩皮發(fā)酵液上清。

3、抑菌活性的測定

將不同菌株所得發(fā)酵液上清ph調(diào)節(jié)至7.0后，取100μl加入鋪有金黃色葡萄球菌作為指示菌的營養(yǎng)瓊脂平板上的牛津杯中，置于37℃培養(yǎng)24小時，觀察抑菌圈大小，結(jié)果如表4示：

表4不同菌株制備的麩皮發(fā)酵液上清的抑菌效果

由表4可知，其他常規(guī)發(fā)酵菌株不具有發(fā)酵麩皮培養(yǎng)基產(chǎn)生抗生素的能力，而牛類芽孢桿菌cgmccno.8333可以發(fā)酵麩皮培養(yǎng)基，最后得到抗生素fusaricidina，對金黃色葡萄球菌的抑制活性非常顯著。

以上對本發(fā)明所提供的抗生素fusaricidina的制備方法進(jìn)行了詳細(xì)介紹。本文中應(yīng)用了具體個例對本發(fā)明的原理及實(shí)施方式進(jìn)行了闡述，以上實(shí)施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。