本發(fā)明涉及環(huán)肽，具體地，涉及雙環(huán)肽e[c(rgdfk)]2及其制備方法。

背景技術(shù)：

人們身體內(nèi)所有器官都是由細(xì)胞組成。有序的細(xì)胞增長(zhǎng)和分化可滿足身體需要，維持身體健康。然而，如果細(xì)胞持續(xù)分裂，不再受身體控制，無(wú)限代謝生殖，那么這些額外的大量細(xì)胞就形成腫瘤。惡性腫瘤的細(xì)胞能侵犯、破壞鄰近的組織和器官。而且，癌細(xì)胞可從腫瘤中穿出，進(jìn)入血液或淋巴系統(tǒng)，危及生命。

目前已經(jīng)研發(fā)出許多抗腫瘤藥物，且都具有有效的藥理活性，但是它們的溶解性差，在體內(nèi)很快會(huì)被清除，以及具有一定的毒性和副作用，使得它們的臨床應(yīng)用受到了限制。

在藥物研發(fā)中，多學(xué)科交叉越來(lái)越重要。高分子材料科學(xué)和藥物制劑學(xué)的發(fā)展催生了藥用高分子材料學(xué)。藥用高分子材料直接促進(jìn)了藥物輸送系統(tǒng)(drugdeliverysystem)的發(fā)展。藥用高分子材料為開發(fā)緩釋制劑、靶向制劑、自調(diào)式給藥制劑、生物藥的非注射給藥制劑以及中藥制劑的現(xiàn)代化提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。兩親性聚合物膠束作為藥物載體具有很多優(yōu)勢(shì)：(1)提高難溶性藥物溶解度。難溶性藥物可被包裹于膠束疏水性內(nèi)核中，難溶藥物在其中的分配系數(shù)高，具有很高的載藥量；(2)提高藥物穩(wěn)定性。藥物被包裹后，可避免一些外周環(huán)境因素的影響(例如對(duì)于一些蛋白藥物或者多肽類藥物，可以起到保護(hù)藥物的作用，防止藥物被酶解)；(3)提高生物利用度。膠束外殼的親水段為膠束披上了一層“偽裝”，不易被吞噬細(xì)胞或蛋白質(zhì)識(shí)別，可避免被內(nèi)狀網(wǎng)皮系統(tǒng)(res)捕獲，延長(zhǎng)了膠束在血液和組織的滯留時(shí)間，提高藥物的生物利用度；(4)靶向作用。被動(dòng)靶向性或通過引入一些特殊功能基使膠束具有主動(dòng)靶向性，提高療效，降低副作用。

近年來(lái)，腫瘤成像和治療的目標(biāo)是αvβ3整合素，因?yàn)樗诙喾N癌細(xì)胞類型(黑素瘤，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，卵巢，乳腺，前列腺癌等)上過表達(dá)。這種整合素在人類腫瘤轉(zhuǎn)移和腫瘤誘導(dǎo)的血管生成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。arg-gly-asp(rgd)肽序列已被鑒定是選擇性識(shí)別αvβ3整聯(lián)蛋白有用的靶向配體。環(huán)狀rgd五肽不僅對(duì)αvβ3具有高親和力，尤其是環(huán)狀五肽(arg-gly-asp-phe-lys)(c(rgdfk))以高親和力選擇性結(jié)合整聯(lián)蛋白αvβ3。由于環(huán)肽比線形肽有更好的剛性強(qiáng)度和更好的特異性，同時(shí)，不易被體內(nèi)氨肽酶羧肽酶等酶切割降解等優(yōu)點(diǎn)，受到廣泛重視。雖然環(huán)狀rgd五肽具有上述優(yōu)異的特性，但是其穩(wěn)定性較差。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種雙環(huán)肽e[c(rgdfk)]2及其制備方法，該雙環(huán)肽e[c(rgdfk)]2具有優(yōu)異的穩(wěn)定性且該制備方法條件溫和。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種雙環(huán)肽e[c(rgdfk)]2的制備方法，該備方法包括：

1)將樹脂與fmoc-asp-oall(fmoc-l-天冬氨酸alpha-烯丙酯)浸泡于dcm(二氯甲烷)中，接著加入diea(n，n-二異丙基乙胺)進(jìn)行接觸反應(yīng)，然后進(jìn)行洗滌；

2)將dcm、甲醇和diea加入反應(yīng)體系中進(jìn)行封頭處理，接著加入哌啶進(jìn)行脫保護(hù)，然后洗滌直至反應(yīng)體系經(jīng)過茚三酮檢測(cè)為藍(lán)色；

3)將g(甘氨酸)、hobt(1-羥基苯并三氮唑)、tbtu(o-苯并三氮唑-n，n，n'，n'-四甲基脲四氟硼酸酯)加入反應(yīng)體系中進(jìn)行接觸反應(yīng)，然后洗滌直至反應(yīng)體系經(jīng)過茚三酮檢測(cè)為藍(lán)色；

4)將r(精氨酸)、k(賴氨酸)、f(苯丙氨酸)依次加入反應(yīng)體系中進(jìn)行接觸反應(yīng)，接著加入pd(pph3)4(四(三苯基磷)鈀)進(jìn)行丙烯基去除反應(yīng)，然后加入哌啶進(jìn)行脫保護(hù)、洗滌至洗脫廢液無(wú)色或淡紅色；

5)將diea、hobt、hbtu(苯并三氮唑-n，n，n'，n'-四甲基脲六氟磷酸酯)加入反應(yīng)體系中進(jìn)行接觸反應(yīng)，接著加入水合肼(n，n-二甲基甲酰胺)和dmf的混合溶液進(jìn)行二次反應(yīng)，然后洗滌脫除dde直至茚三酮檢測(cè)為藍(lán)色；

6)將fmoc-glu-oh(fmoc-l-谷氨酸/芴甲氧羰基-l-谷氨酸)、hobt、dmf、tbtu滴加至反應(yīng)體系中進(jìn)行接觸反應(yīng)，接著洗滌直至茚三酮檢測(cè)為無(wú)色或者微弱的藍(lán)色；

7)將哌啶加入反應(yīng)體系中進(jìn)行脫保護(hù)，接著依次通過dmf、dcm、甲醇洗滌，然后干燥、加入切割液切割、沉降、純化以制得雙環(huán)肽e[c(rgdfk)]2；

其中，樹脂選自2-cl樹脂和wang樹脂中的至少一者。

本發(fā)明還提供了一種雙環(huán)肽e[c(rgdfk)]2，該雙環(huán)肽e[c(rgdfk)]2通過上述的制備方法制備而得。

在上述技術(shù)方案，本發(fā)明先用固相合成法合成出穩(wěn)定性能好的雙環(huán)肽e[c(rgdfk)]2。與現(xiàn)有技術(shù)相比，該雙環(huán)肽e[c(rgdfk)]2能夠使得制得的抗癌藥物在生物體內(nèi)具有更優(yōu)異的穩(wěn)定性，使其具有較廣闊的應(yīng)用前景。同時(shí)，該制備方法條件溫和，進(jìn)而使得其適用于規(guī)?；a(chǎn)。

本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的具體實(shí)施方式部分予以詳細(xì)說明。

附圖說明

附圖是用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與下面的具體實(shí)施方式一起用于解釋本發(fā)明，但并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中：

圖1是雙環(huán)肽的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖：

圖2是檢測(cè)例1中雙環(huán)肽的質(zhì)譜圖；

圖3是檢測(cè)例2中雙環(huán)肽的hplc檢測(cè)圖；

圖4是檢測(cè)例3中雙環(huán)肽對(duì)溫度穩(wěn)定性的檢測(cè)結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

以下對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體實(shí)施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。

本發(fā)明提供了一種雙環(huán)肽e[c(rgdfk)]2的制備方法，該備方法包括：

1)將樹脂與fmoc-asp-oall(fmoc-l-天冬氨酸alpha-烯丙酯)浸泡于dcm(二氯甲烷)中，接著加入diea(n，n-二異丙基乙胺)進(jìn)行接觸反應(yīng)，然后進(jìn)行洗滌；

2)將dcm、甲醇和diea加入反應(yīng)體系中進(jìn)行封頭處理，接著加入哌啶進(jìn)行脫保護(hù)，然后洗滌直至反應(yīng)體系經(jīng)過茚三酮檢測(cè)為藍(lán)色；

3)將g(甘氨酸)、hobt(1-羥基苯并三氮唑)、tbtu(o-苯并三氮唑-n，n，n'，n'-四甲基脲四氟硼酸酯)加入反應(yīng)體系中進(jìn)行接觸反應(yīng)，然后洗滌直至反應(yīng)體系經(jīng)過茚三酮檢測(cè)為藍(lán)色；

4)將r(精氨酸)、k(賴氨酸)、f(苯丙氨酸)依次加入反應(yīng)體系中進(jìn)行接觸反應(yīng)，接著加入pd(pph3)4(四(三苯基磷)鈀)進(jìn)行丙烯基去除反應(yīng)，然后加入哌啶進(jìn)行脫保護(hù)、洗滌至洗脫廢液無(wú)色或淡紅色；

5)將diea、hobt、hbtu(苯并三氮唑-n，n，n'，n'-四甲基脲六氟磷酸酯)加入反應(yīng)體系中進(jìn)行接觸反應(yīng)，接著加入水合肼(n，n-二甲基甲酰胺)和dmf的混合溶液進(jìn)行二次反應(yīng)，然后洗滌脫除dde直至茚三酮檢測(cè)為藍(lán)色；

6)將fmoc-glu-oh(fmoc-l-谷氨酸/芴甲氧羰基-l-谷氨酸)、hobt、dmf、tbtu滴加至反應(yīng)體系中進(jìn)行接觸反應(yīng)，接著洗滌直至茚三酮檢測(cè)為無(wú)色或者微弱的藍(lán)色；

7)將哌啶加入反應(yīng)體系中進(jìn)行脫保護(hù)，接著依次通過dmf、dcm、甲醇洗滌，然后干燥、加入切割液切割、沉降、純化以制得雙環(huán)肽e[c(rgdfk)]2；

其中，樹脂選自2-cl樹脂和wang樹脂中的至少一者。

在在上述制備方法的步驟1)中，各物料的用量可以在寬的范圍內(nèi)選擇，但是為了使得制得的雙環(huán)肽e[c(rgdfk)]2能夠更好合成，優(yōu)選地，在步驟1)中，相對(duì)于1g的樹脂，fmoc-asp-oall的用量為0.5-0.6g，dcm的用量為20-30ml，diea的用量為1-1.5ml。

在在上述制備方法的步驟1)中，浸泡條件可以在寬的范圍內(nèi)選擇，但是為了使得制得的雙環(huán)肽e[c(rgdfk)]2能夠更好合成，優(yōu)選地，在步驟1)中，浸泡至少滿足以下條件：浸泡溫度為20-25℃，浸泡時(shí)間為2-5min。

在上述制備方法的步驟1)中，接觸反應(yīng)條件可以在寬的范圍內(nèi)選擇，但是為了使得制得的雙環(huán)肽e[c(rgdfk)]2能夠更好合成，優(yōu)選地，在步驟1)中，接觸反應(yīng)至少滿足以下條件：反應(yīng)溫度為20-25℃，反應(yīng)時(shí)間為2-3h。

在上述制備方法的步驟2)中，物料的用量可以在寬的范圍內(nèi)選擇，但是為了使得制得的雙環(huán)肽e[c(rgdfk)]2能夠更好合成，優(yōu)選地，在步驟2)中，相對(duì)于1g的樹脂，dcm的用量為20-30ml，甲醇的用量為1-1.5ml，diea的用量為1-1.5ml，哌啶的用量為5-20ml。

在上述制備方法的步驟2)中，封頭處理?xiàng)l件可以在寬的范圍內(nèi)選擇，但是為了使得制得的雙環(huán)肽e[c(rgdfk)]2能夠更好合成，優(yōu)選地，在步驟2)中，封頭處理至少滿足以下條件：處理溫度為20-25℃，處理時(shí)間為30-50min。

在上述制備方法的步驟2)中，脫保護(hù)條件可以在寬的范圍內(nèi)選擇，但是為了使得制得的雙環(huán)肽e[c(rgdfk)]2能夠更好合成，優(yōu)選地，在步驟2)中，脫保護(hù)至少滿足以下條件：溫度為20-25℃，時(shí)間為15-30min。

在上述制備方法的步驟3)中，物料用量可以在寬的范圍內(nèi)選擇，但是為了使得制得的雙環(huán)肽e[c(rgdfk)]2能能夠更好合成，優(yōu)選地，在步驟3)中，相對(duì)于1g的樹脂，g的用量為0.9-1g，hobt的用量為0.5-0.6g，tbtu的用量為1-1.5g。

在上述制備方法的步驟3)中，接觸反應(yīng)條件可以在寬的范圍內(nèi)選擇，但是為了使得制得的雙環(huán)肽e[c(rgdfk)]2能夠更好合成，優(yōu)選地，在步驟3)中，接觸反應(yīng)至少滿足以下條件：反應(yīng)溫度為20-25℃，反應(yīng)時(shí)間為1-1.5h。

在上述制備方法的步驟4)中，物料用量可以在寬的范圍內(nèi)選擇，但是為了使得制得的雙環(huán)肽e[c(rgdfk)]2能夠更好合成，優(yōu)選地，在步驟4)中，相對(duì)于10mg的樹脂，r的用量為2-2.5g，k的用量為1.6-2g，f的用量為1.2-1.5g，pd(pph3)4的用量為1.2-1.5g。

在上述制備方法的步驟4)中，接觸反應(yīng)條件可以在寬的范圍內(nèi)選擇，但是為了使得制得的雙環(huán)肽e[c(rgdfk)]2能夠更好合成，優(yōu)選地，在步驟4)，接觸反應(yīng)至少滿足以下條件：反應(yīng)溫度為20-25℃，反應(yīng)時(shí)間為45-60min。

在上述制備方法的步驟4)中，丙烯基去除反應(yīng)的條件可以在寬的范圍內(nèi)選擇，但是為了使得制得的雙環(huán)肽e[c(rgdfk)]2能夠更好合成，優(yōu)選地，在步驟4)中，丙烯基去除反應(yīng)至少滿足以下條件：反應(yīng)溫度為20-25℃，反應(yīng)時(shí)間為2-3h。

在上述制備方法的步驟5)中，物料用量可以在寬的范圍內(nèi)選擇，但是為了使得制得的雙環(huán)肽e[c(rgdfk)]2能夠更好合成，優(yōu)選地，在步驟5)中，相對(duì)于1g的樹脂，diea的用量為1-1.5ml，hobt的用量為0.5-0.6g，hbtu的用量為1.1-1.5g，水合肼dmf溶液的用量為15-20ml，并且水合肼dmf混合溶液中水合肼的濃度不低于20％；

在上述制備方法的步驟5)中，接觸反應(yīng)條件可以在寬的范圍內(nèi)選擇，但是為了使得制得的雙環(huán)肽e[c(rgdfk)]2能夠更好合成，優(yōu)選地，在步驟5)中，接觸反應(yīng)至少滿足以下條件：反應(yīng)溫度為20-25℃，反應(yīng)時(shí)間為4-8h。

在上述制備方法的步驟5)中，二次反應(yīng)條件可以在寬的范圍內(nèi)選擇，但是為了使得制得的雙環(huán)肽e[c(rgdfk)]2能夠更好合成，優(yōu)選地，在步驟5)中，二次反應(yīng)至少滿足以下條件：反應(yīng)溫度為20-25℃，反應(yīng)時(shí)間為2-4h。

在上述制備方法的步驟6)中，物料用量可以在寬的范圍內(nèi)選擇，但是為了使得制得的雙環(huán)肽e[c(rgdfk)]2能夠更好合成，優(yōu)選地，在步驟6)中，相對(duì)于1g的樹脂，fmoc-glu-oh的用量為1-1.1g，hobt的用量為0.5-0.6g，dmf的用量為15-20ml，tbtu的用量為1-1.5g。

在上述制備方法的步驟6)中，接觸反應(yīng)的條件可以在寬的范圍內(nèi)選擇，但是為了使得制得的雙環(huán)肽e[c(rgdfk)]2能夠更好合成，優(yōu)選地，在步驟6)中，接觸反應(yīng)至少滿足以下條件：反應(yīng)溫度為20-25℃，滴加完成后反應(yīng)時(shí)間為1-2h。

在上述制備方法的步驟7)中，接觸反應(yīng)的條件可以在寬的范圍內(nèi)選擇，但是為了使得制得的雙環(huán)肽e[c(rgdfk)]2能夠更好合成，優(yōu)選地，在步驟7)中，相對(duì)于1g的樹脂，哌啶的用量為15-20ml。

在上述制備方法的步驟7)中，切割液的具體組分可以在寬的范圍內(nèi)選擇，但是為了使得制得的雙環(huán)肽e[c(rgdfk)]2能夠更好合成，優(yōu)選地，切割液由tfa(三氟乙酸)、tis(三異丙基硅烷)、edt(1，2-乙二硫醇)和水組成；其中，各組分的含量可以在寬的范圍內(nèi)選擇，更優(yōu)選地，tfa、tis、edt和水的體積比為95：1.5-2.5：1.5-2.5：0.8-1.2。

在上述制備方法的步驟7)中，切割條件可以在寬的范圍內(nèi)選擇，但是為了使得制得的雙環(huán)肽e[c(rgdfk)]2能夠更好合成，優(yōu)選地，切割至少滿足以下條件：切割溫度為20-25℃，切割時(shí)間為2-2.5h。

本發(fā)明還提供了一種雙環(huán)肽e[c(rgdfk)]2，該雙環(huán)肽e[c(rgdfk)]2通過上述的的制備方法制備而得。

以下將通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。雙環(huán)肽純度的純度的檢測(cè)是通過液相色譜(hplc)測(cè)得，穩(wěn)定性測(cè)試是通過精密ph計(jì)，電熱恒溫水浴鍋和熒光分光光度計(jì)。

實(shí)施例1

制備雙環(huán)肽e[c(rgdfk)]2

a、稱量2-cl樹脂1g于20ml的20℃的dcm中浸泡2min，然后用dmf、dcm各洗一次；以20mldcm作溶劑，稱量0.5g的fmoc-asp-oall，與1ml的diea、2-cl樹脂1g在20℃下反應(yīng)2h，然后用dmf洗滌2次；用20mldcm+1ml甲醇+1mldiea在20℃下封頭30min，用dmf洗滌3次；用15ml哌啶在20℃下脫保護(hù)，反應(yīng)15min，然后用dmf洗滌4次，直至茚三酮檢測(cè)為藍(lán)色；

b、向體系中投0.9gg和0.5mghobt，加1gtbtu作為催化劑，20mldmf作溶劑在20℃下反應(yīng)1h，然后洗滌3次，直至茚三酮檢測(cè)為藍(lán)色；依次加入2gr、1.6gk、1.2gf于20℃下反應(yīng)45min；

c、用1.2g的pd(pph3)4，在20℃下反應(yīng)2h去除丙烯基；用15ml哌啶于20℃下脫保護(hù)處理15min，然后用dmf、dcm、甲醇依次洗滌，至洗脫廢液無(wú)色或淡紅色；加1mldiea、0.5ghobt、1.1mghbtu、用15mldmf做反應(yīng)溶劑，于20℃下反應(yīng)4h，使其形成環(huán)肽；

d、向體系中加15ml水合肼dmf溶液(水合肼的濃度為20％)于20℃下反應(yīng)2h，洗滌干凈，脫除dde，茚三酮檢測(cè)為藍(lán)色即可。再稱取1g的fmoc-glu-oh、15ml的hobt溶液(濃度為33％，溶劑為dmf)，并且加入1g的tbtu，按照緩慢滴定的方式加入反應(yīng)系統(tǒng)中(反應(yīng)系統(tǒng)可加入一定量dmf以供鼓泡)，待完全滴加完全后于20℃下再反應(yīng)1h內(nèi)。反應(yīng)結(jié)束后洗滌，茚三酮檢測(cè)為無(wú)色或者微弱的藍(lán)色即可；用15ml哌啶于20℃下脫保護(hù)處理15min，然后dmf、dcm、甲醇依次洗滌，甲醇洗滌吹干；按質(zhì)量體積比1g：10ml加切割液(含有tfa、tis、edt和水，并且體積比依次為為95：2：2：1)切割，沉降，純化檢測(cè)得到雙環(huán)肽e[c(rgdfk)]2(純度88.22％，質(zhì)量0.48g)。

實(shí)施例2

制備雙環(huán)肽e[c(rgdfk)]2

a、稱量2-cl樹脂1g于30ml的25℃的dcm中浸泡5min，然后用dmf、dcm各洗一次；以30mldcm作溶劑，稱量0.6g的moc-asp-oall，與1.5ml的diea、2-cl樹脂1g在25℃下反應(yīng)3h，然后用dmf洗滌2次；用30mldcm+1.5ml甲醇+1.5mldiea在25℃下封頭50min，用dmf洗滌3次；用20ml哌啶在25℃下脫保護(hù)，反應(yīng)30min，然后用dmf洗滌4次，直至茚三酮檢測(cè)為藍(lán)色；

b、向體系中投1gg和0.6ghobt，加1.5gtbtu作為催化劑，30mldmf作溶劑在25℃下反應(yīng)1.5h，然后洗滌3次，直至茚三酮檢測(cè)為藍(lán)色；依次加入2.5gr、2gk、1.5gf于25℃下反應(yīng)1h；

c、用1.5g的pd(pph3)4，在25℃下反應(yīng)3h去除丙烯基；用20ml哌啶于25℃下脫保護(hù)處理30min，然后用dmf、dcm、甲醇依次洗滌，至洗脫廢液無(wú)色或淡紅色；加1.5mldiea、0.6ghobt、1.5ghbtu、用30mldmf做反應(yīng)溶劑，于25℃下反應(yīng)8h，使其形成環(huán)肽；

d、向體系中加20ml水合肼dmf溶液(水合肼的濃度為20％)于25℃下反應(yīng)4h，洗滌干凈，脫除dde，茚三酮檢測(cè)為藍(lán)色即可。再稱取1.1g的fmoc-glu-oh、0.6g的hobt溶液(濃度為20％，溶劑為dmf)，并且加入1.5g的tbtu，按照緩慢滴定的方式加入反應(yīng)系統(tǒng)中(反應(yīng)系統(tǒng)可加入一定量dmf以供鼓泡)，待完全滴加完全后于25℃下再反應(yīng)3h內(nèi)。反應(yīng)結(jié)束后洗滌，茚三酮檢測(cè)為無(wú)色或者微弱的藍(lán)色即可；用20ml哌啶于25℃下脫保護(hù)處理30min，然后dmf、dcm、甲醇依次洗滌，甲醇洗滌吹干；按質(zhì)量體積比1g：10ml加切割液(含有tfa、tis、edt和水，并且體積比依次為為95：2：2：1)切割，沉降，純化檢測(cè)得到雙環(huán)肽e[c(rgdfk)]2(純度89.21％，質(zhì)量0.38g)。

實(shí)施例3

制備雙環(huán)肽e[c(rgdfk)]2

a、稱量2-cl樹脂1g于25ml的23℃的dcm中浸泡3min，然后用dmf、dcm各洗一次；以25mldcm作溶劑，稱量0.6g的fmoc-asp-oall，與1.2ml的diea、2-cl樹脂1g在23℃下反應(yīng)2.5h，然后用dmf洗滌2次；用25mldcm+1.2ml甲醇+1.2mldiea在23℃下封頭45min，用dmf洗滌3次；用17ml哌啶在23℃下脫保護(hù)，反應(yīng)20min，然后用dmf洗滌4次，直至茚三酮檢測(cè)為藍(lán)色；

b、向體系中投1gg和0.55ghobt，加1.7gtbtu作為催化劑，25mldmf作溶劑在23℃下反應(yīng)50min，然后洗滌2次，直至茚三酮檢測(cè)為藍(lán)色；依次加入2.2gr、1.8gk、1.4gf于23℃下反應(yīng)50min；

c、用1.4g的pd(pph3)4，在23℃下反應(yīng)2.5h去除丙烯基；用17ml哌啶于23℃下脫保護(hù)處理20min，然后用dmf、dcm、甲醇依次洗滌，至洗脫廢液無(wú)色或淡紅色；加1.2mldiea、0.55ghobt、1.3ghbtu、用25mldmf做反應(yīng)溶劑，于23℃下反應(yīng)6h，使其形成環(huán)肽；

d、向體系中加17ml水合肼dmf溶液(水合肼的濃度為20％)于23℃下反應(yīng)3h，洗滌干凈，脫除dde，茚三酮檢測(cè)為藍(lán)色即可。再稱取1.1g的fmoc-glu-oh、25ml的hobt溶液(濃度為22％，溶劑為dmf)，并且加入1.7g的tbtu，按照緩慢滴定的方式加入反應(yīng)系統(tǒng)中(反應(yīng)系統(tǒng)可加入一定量dmf以供鼓泡)，待完全滴加完全后于23℃下再反應(yīng)3h內(nèi)。反應(yīng)結(jié)束后洗滌，茚三酮檢測(cè)為無(wú)色或者微弱的藍(lán)色即可；用17ml哌啶于23℃下脫保護(hù)處理20min，然后dmf、dcm、甲醇依次洗滌，甲醇洗滌吹干；按質(zhì)量體積比1g：10ml加切割液(含有tfa、tis、edt和水，并且體積比依次為為95：2：2：1)切割，沉降，純化檢測(cè)得到雙環(huán)肽e[c(rgdfk)]2(純度89.41％，質(zhì)量0.42g)。

檢測(cè)例1

對(duì)上述實(shí)施例1中制得的雙環(huán)肽e[c(rgdfk)]2進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，檢測(cè)見過見圖2，通過該圖可知，該雙環(huán)肽e[c(rgdfk)]2的結(jié)構(gòu)與圖1相吻合。

按照相同的方法對(duì)實(shí)施例2-3中制得的雙環(huán)肽e[c(rgdfk)]2進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與實(shí)施例1中制得的雙環(huán)肽e[c(rgdfk)]2的檢測(cè)結(jié)果基本保持一致。

檢測(cè)例2

對(duì)上述實(shí)施例中制得的雙環(huán)肽e[c(rgdfk)]2進(jìn)行hplc檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見圖3，通過該圖可知，該雙環(huán)肽e[c(rgdfk)]2的結(jié)構(gòu)與圖1相吻合。

按照相同的方法對(duì)實(shí)施例2-3中制得的雙環(huán)肽e[c(rgdfk)]2進(jìn)行hplc質(zhì)譜檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與實(shí)施例1中制得的雙環(huán)肽e[c(rgdfk)]2的檢測(cè)結(jié)果基本保持一致。

檢測(cè)例3

在不同ph值和不同溫度下對(duì)雙環(huán)肽穩(wěn)定性進(jìn)行研究：

1)取一定量的雙環(huán)肽溶液，用1mol/lhcl溶液和1mol/lnaoh溶液調(diào)整溶液的ph值分別為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0，配置濃度為23.00μg/ml，體積為5ml的多肽溶液，于37℃水浴中放置4h，每隔一小時(shí)取樣，之后立即用2mol/ltris緩沖液(ph＝7.0)將ph調(diào)至7右，測(cè)溶液中多肽的含量，研究不同ph值對(duì)雙環(huán)肽穩(wěn)定性的影響，結(jié)果見表1。

表1

2)取雙環(huán)肽凍干粉用ph為6.4的pbs緩沖溶液配成20.00μg/ml溶液，分別取4ml于試管中，在60℃、70℃、75℃和80℃的條件下加熱，每隔一小時(shí)取樣，在冰水浴中迅速冷卻后測(cè)定溶液中雙環(huán)肽的含量，共11次取樣，研究不同加熱處理對(duì)雙環(huán)肽穩(wěn)定性的影響，結(jié)果見圖4。

按照相同的方法對(duì)實(shí)施例2-3中制得的雙環(huán)肽e[c(rgdfk)]2進(jìn)行溫度和酸堿性穩(wěn)定性檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與實(shí)施例1中制得的雙環(huán)肽e[c(rgdfk)]2的檢測(cè)結(jié)果基本保持一致。

通過表1和圖3可知，本發(fā)明提供的雙環(huán)肽對(duì)于酸堿性以及溫度均有優(yōu)異的穩(wěn)定性。

以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡(jiǎn)單變型，這些簡(jiǎn)單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

另外需要說明的是，在上述具體實(shí)施方式中所描述的各個(gè)具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進(jìn)行組合，為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對(duì)各種可能的組合方式不再另行說明。

此外，本發(fā)明的各種不同的實(shí)施方式之間也可以進(jìn)行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。