本發(fā)明屬于食品安全檢測(cè)領(lǐng)域，涉及食品污染物遺傳毒性的評(píng)估，尤其是一種利用rpsl基因突變率檢測(cè)評(píng)估食品污染物遺傳毒性的方法。

背景技術(shù)：

食品污染物是在生產(chǎn)、加工、運(yùn)輸和儲(chǔ)藏等過(guò)程中帶入食品中的污染物質(zhì)，黃曲霉毒素、丙烯酰胺、溴氰菊酯、二惡英及二惡英類多氯聯(lián)苯等，食品污染物經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)均具有致突變性，在食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)中，遺傳毒性試驗(yàn)常采用細(xì)菌致突變?cè)囼?yàn)，即鼠傷寒抄門氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)，即ames試驗(yàn)

ames試驗(yàn)廣泛應(yīng)用于致突變化學(xué)物的初篩，但是在實(shí)際應(yīng)用中仍存在以下幾個(gè)問(wèn)題：

1、ames測(cè)試只能檢出引起少數(shù)幾個(gè)堿基變化導(dǎo)致突變，如堿基置換突變、移碼突變的致突變物，而對(duì)于導(dǎo)致dna鏈斷裂及染色體大段缺失而引發(fā)突變的致突變物，則無(wú)法檢測(cè)它們的致突變性，具有一定的局限性；

2、ames測(cè)試試驗(yàn)程序比較繁瑣，方法不夠簡(jiǎn)便，有待于創(chuàng)建新的更為快速靈敏、簡(jiǎn)單易行的誘變劑短期生物測(cè)試法。

通過(guò)對(duì)現(xiàn)有公開專利文獻(xiàn)的檢索并未發(fā)現(xiàn)rpsl基因突變率檢測(cè)在評(píng)估食品污染物遺傳毒性的應(yīng)用，即沒(méi)有公開的專利文獻(xiàn)作為現(xiàn)有技術(shù)影響本發(fā)明的新穎性和創(chuàng)造性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種利用rpsl基因突變率檢測(cè)評(píng)估食品污染物遺傳毒性的方法，該方法靈敏度高且簡(jiǎn)便易行，可以測(cè)定農(nóng)藥殘留、化學(xué)污染物、微生物毒素等諸多食品污染物的遺傳毒性，應(yīng)用這種技術(shù)所獲得的遺傳毒性資料將是食品有毒物質(zhì)資料庫(kù)的有力補(bǔ)充，對(duì)制定食品安全法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)具有重要理論指導(dǎo)價(jià)值。

本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題是采取以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種利用rpsl基因突變率檢測(cè)評(píng)估食品污染物遺傳毒性的方法，該方法包括如下步驟：

(1)提取質(zhì)粒pmol21：將分子量為3993bp，帶有375bp的rpsl基因序列，并帶有氨芐青霉素抗性基因的質(zhì)粒pmol21通過(guò)堿裂解法或質(zhì)粒提取試劑盒提取該質(zhì)粒dna；

(2)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞：采用cacl2法制備mf101感受態(tài)細(xì)胞，并將pmol21質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)化后宿主細(xì)胞對(duì)鏈霉素敏感；

(3)食品污染物處理：液態(tài)食品污染物直接進(jìn)行檢測(cè)，固態(tài)食品污染物配制成溶液，根據(jù)不同食品污染物的性質(zhì)加入水和有機(jī)溶劑進(jìn)行溶解，并進(jìn)行梯度稀釋；

(4)基因突變率的檢測(cè)：將帶有質(zhì)粒pmol21的大腸桿菌mf101培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，od600為0.5-0.7，以0.5-1.5：100稀釋至含有食品污染物的液體培養(yǎng)基中，于36-38℃進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，并且以550-650nm處的光吸收值測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線；

(5)食品污染物培養(yǎng)：食品污染物加入到培養(yǎng)基中，各組均培養(yǎng)10個(gè)小時(shí)后用于rpsl突變頻率的測(cè)定，將細(xì)菌培養(yǎng)液涂布于含氨芐青霉素的平板上來(lái)確定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的總數(shù)，涂板于含氨芐青霉素和鏈霉素平板上以確定rpsl基因突變的總數(shù)，突變率是突變菌數(shù)/總菌數(shù)，其中突變菌數(shù)含氨芐青霉素和鏈霉素平板的菌數(shù)，總菌數(shù)含氨芐青霉素平板的菌數(shù)，每組至少三次重復(fù)，總菌落數(shù)不低于10³個(gè)；

(6)食品污染物遺傳毒性的評(píng)估：選取rpsl基因突變克隆，提取質(zhì)粒dna，測(cè)定rpsl突變序列，采用dnaman軟件進(jìn)行序列比對(duì)，對(duì)于突變序列進(jìn)行堿基置換、移碼突變和大片段缺失統(tǒng)計(jì)分析，確定食品污染物導(dǎo)致的突變頻率、基因突變熱點(diǎn)和基因突變的主要類型。

而且，步驟(4)中帶有質(zhì)粒pmol21的大腸桿菌mf101培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，od600為0.6，以1：100稀釋至含有食品污染物的液體培養(yǎng)基中，于37℃進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，并且600nm處的光吸收值測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。

而且，步驟(5)中含氨芐青霉素的平板與含氨芐青霉素和鏈霉素平板的濃度為50μg/ml。

而且，所述步驟(4)基因突變率的檢測(cè)還有另一種體外檢測(cè)方法，該方法步驟如下：

a采用帶有rpsl基因的質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒pmol21，利用scai酶切線性化質(zhì)粒，并利用生物素標(biāo)記的引物進(jìn)行pcr反應(yīng)，體外擴(kuò)增質(zhì)粒pmol21，pcr反應(yīng)體系中加入食品污染物；

b將dna擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)純化、酶切、自連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞mf101，利用氨芐青霉素和鏈霉素篩選rpsl基因突變菌落；

c進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，并計(jì)算rpsl基因突變率，突變率是突變菌數(shù)/總菌數(shù)，其中突變菌數(shù)含氨芐青霉素和鏈霉素平板的菌數(shù)，總菌數(shù)含氨芐青霉素平板的菌數(shù)，每組至少三次重復(fù)，總菌落數(shù)不低于10⁶個(gè)；

而且，所述的食品污染物是指在生產(chǎn)、加工、運(yùn)輸和儲(chǔ)藏過(guò)程中帶入食品中的污染物質(zhì)，主要包括農(nóng)藥殘留、化學(xué)污染物、微生物毒素中的一種或多種。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)效果：

1、本發(fā)明利用rpsl基因突變與鏈霉素抗性篩選，同時(shí)用rpsl基因突變率的正向篩選系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，正向篩選系統(tǒng)是指僅有質(zhì)粒rpsl基因突變的菌株才能夠檢出，而質(zhì)粒未突變的菌株不得檢出，由于鏈霉素抗性為隱性的遺傳表型，宿主菌mf101的rpsl基因是突變的，只有質(zhì)粒pmol21的rpsl基因同時(shí)被誘發(fā)突變才會(huì)最終導(dǎo)致宿主細(xì)胞具備鏈霉素抗性，從而達(dá)到正向篩選質(zhì)粒中rpsl突變基因的目的，該正向篩選可以大大提高檢測(cè)時(shí)間，整個(gè)分析過(guò)程可以在24小時(shí)內(nèi)實(shí)現(xiàn)，

2、本發(fā)明所采用的rpsl基因分析背景較低，涉及微生物高溫培養(yǎng)的方法簡(jiǎn)單易行，采用rpsl正向選擇系統(tǒng)進(jìn)行致突變性的評(píng)價(jià)不需要復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)條件，tk基因的自發(fā)突變率在10^-5，而rpsl的自發(fā)突變率低至10^-6，遠(yuǎn)低于同類正向篩選體系，節(jié)省人力物力，檢測(cè)快速高效。

3、本發(fā)明所采用體內(nèi)水平基因突變率檢測(cè)，利用rpsl基因突變檢測(cè)的mf101菌株代替鼠傷寒沙門氏菌的組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株進(jìn)行ames實(shí)驗(yàn)，加入哺乳動(dòng)物微粒體酶系，彌補(bǔ)體外實(shí)驗(yàn)缺乏代謝活化系統(tǒng)的不足，并采用平板滲入法檢測(cè)食品污染物的致突變性。

4、本發(fā)明所涉及的rpsl基因突變選擇系統(tǒng)是一種靈敏度高且簡(jiǎn)便易行的體外短期致突變實(shí)驗(yàn)方法，可以為檢測(cè)食品加工過(guò)程中產(chǎn)生的潛在致癌物提供一種快速有效的分析方法，rpsl基因突變檢測(cè)技術(shù)是基于rpsl基因的復(fù)制保真性來(lái)定量檢測(cè)遺傳毒性的方法，應(yīng)用這種技術(shù)所獲得的遺傳毒性資料將是食品有毒物質(zhì)資料庫(kù)的有力補(bǔ)充，對(duì)制定食品安全法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)具有重要理論指導(dǎo)價(jià)值。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述，以下實(shí)施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明提供一種利用rpsl基因突變率檢測(cè)評(píng)估食品污染物遺傳毒性的方法，該方法包括如下步驟：

(1)提取質(zhì)粒pmol21：將分子量為3993bp，帶有375bp的rpsl基因序列，并帶有氨芐青霉素抗性基因的質(zhì)粒pmol21通過(guò)堿裂解法或質(zhì)粒提取試劑盒提取該質(zhì)粒dna；

(2)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞：采用cacl2法制備mf101感受態(tài)細(xì)胞，并將pmol21質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)化后宿主細(xì)胞對(duì)鏈霉素敏感；

(3)食品污染物處理：液態(tài)食品污染物直接進(jìn)行檢測(cè)，固態(tài)食品污染物配制成溶液，根據(jù)不同食品污染物的性質(zhì)加入水和有機(jī)溶劑進(jìn)行溶解，并進(jìn)行梯度稀釋；

(4)基因突變率的檢測(cè)：將帶有質(zhì)粒pmol21的大腸桿菌mf101培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，od600為0.6，以1：100稀釋至含有食品污染物的液體培養(yǎng)基中，于37℃進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，并且600nm處的光吸收值測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線；

(5)食品污染物培養(yǎng)：食品污染物加入到培養(yǎng)基中，各組均培養(yǎng)10個(gè)小時(shí)后用于rpsl突變頻率的測(cè)定，將細(xì)菌培養(yǎng)液涂布于含氨芐青霉素的平板上來(lái)確定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的總數(shù)，涂板于含氨芐青霉素和鏈霉素平板上以確定rpsl基因突變的總數(shù)，突變率是突變菌數(shù)/總菌數(shù)，其中突變菌數(shù)含氨芐青霉素和鏈霉素平板的菌數(shù)，總菌數(shù)含氨芐青霉素平板的菌數(shù)，每組至少三次重復(fù)，總菌落數(shù)不低于10³個(gè)，氨芐青霉素的平板與含氨芐青霉素和鏈霉素平板的濃度為50μg/ml。

(6)食品污染物遺傳毒性的評(píng)估：選取rpsl基因突變克隆，提取質(zhì)粒dna，測(cè)定rpsl突變序列，采用dnaman軟件進(jìn)行序列比對(duì)，對(duì)于突變序列進(jìn)行堿基置換、移碼突變和大片段缺失統(tǒng)計(jì)分析，確定食品污染物導(dǎo)致的突變頻率、基因突變熱點(diǎn)和基因突變的主要類型。

基因突變率的檢測(cè)還有另一種體外檢測(cè)方法，該方法步驟如下：

a采用帶有rpsl基因的質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒pmol21，利用scai酶切線性化質(zhì)粒，并利用生物素標(biāo)記的引物進(jìn)行pcr反應(yīng)，體外擴(kuò)增質(zhì)粒pmol21，pcr反應(yīng)體系中加入食品污染物；

b將dna擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)純化、酶切、自連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞mf101，利用氨芐青霉素和鏈霉素篩選rpsl基因突變菌落；

c進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，并計(jì)算rpsl基因突變率，突變率是突變菌數(shù)/總菌數(shù)，其中突變菌數(shù)含氨芐青霉素和鏈霉素平板的菌數(shù)，總菌數(shù)含氨芐青霉素平板的菌數(shù)，每組至少三次重復(fù)，總菌落數(shù)不低于10⁶個(gè)；

上述所述的食品污染物是指在生產(chǎn)、加工、運(yùn)輸和儲(chǔ)藏過(guò)程中帶入食品中的污染物質(zhì)，主要包括農(nóng)藥殘留、化學(xué)污染物、微生物毒素中的一種或多種。

本發(fā)明涉及方法的原理：

本發(fā)明是通過(guò)rpsl基因在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外復(fù)制中發(fā)生突變，引起微生物細(xì)胞鏈霉素抗性的表型變化，測(cè)定食品污染物影響rpsl基因的突變頻率，并通過(guò)測(cè)序的方法確定突變形式，從而達(dá)到的評(píng)估食品污染物遺傳毒性的目的。本發(fā)明主要利用rpsl基因突變率正向篩選系統(tǒng)，測(cè)定食品污染物在體內(nèi)外引發(fā)的rpsl基因突變率，是一種靈敏度高而且簡(jiǎn)便易行的體外短期致突變?cè)u(píng)估方法，可以測(cè)定農(nóng)藥殘留、化學(xué)污染物、微生物毒素等諸多食品污染物的遺傳毒性。

其中，利用rpsl基因的抗性主要是由rpsl基因編碼的核糖體蛋白s12可以與鏈霉素(sm,streptomycin)形成復(fù)合物，并增強(qiáng)鏈霉素與細(xì)菌16srrna結(jié)合的能力，從而阻止了轉(zhuǎn)錄的起始，這就是鏈霉素藥理作用的基礎(chǔ)。若rpsl基因發(fā)生突變，將破壞16srrna與鏈霉素的相互作用，從而導(dǎo)致微生物細(xì)胞對(duì)鏈霉素產(chǎn)生耐藥性。

正向篩選系統(tǒng)是指僅有質(zhì)粒rpsl基因突變的菌株才能夠檢出，而質(zhì)粒未突變的菌株不得檢出。由于鏈霉素抗性為隱性的遺傳表型，宿主菌mf101的rpsl基因是突變的，只有質(zhì)粒pmol21的rpsl基因同時(shí)被誘發(fā)突變才會(huì)最終導(dǎo)致宿主細(xì)胞具備鏈霉素抗性，從而達(dá)到正向篩選質(zhì)粒中rpsl突變基因的目的。

利用rpsl基因突變檢測(cè)的mf101菌株代替鼠傷寒沙門氏菌的組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株進(jìn)行ames實(shí)驗(yàn)，加入哺乳動(dòng)物微粒體酶系，彌補(bǔ)體外實(shí)驗(yàn)缺乏代謝活化系統(tǒng)的不足，并采用平板滲入法檢測(cè)食品污染物的致突變性。

實(shí)施例1

采用rpsl測(cè)定體內(nèi)條件下納米材料對(duì)rpsl基因突變率的影響，評(píng)估食品污染物納米級(jí)食品保鮮材料的遺傳毒性。

本實(shí)驗(yàn)選取兩種納米級(jí)食品保鮮材料進(jìn)行突變率檢測(cè)，納米材料加入培養(yǎng)基，并加入哺乳動(dòng)物微粒體酶系，檢測(cè)大腸桿菌mf101/pmol21的rpsl位點(diǎn)的誘導(dǎo)突變頻率。以溶劑組作為對(duì)照組，每組至少三次重復(fù)，并采用平板滲入法檢測(cè)食品污染物的致突變性，rpsl基因突變率結(jié)果見表1，其中材料1的突變率3.56×10^-6高于對(duì)照組1.29×10^-6。

表1.體內(nèi)條件下，兩種納米級(jí)食品保鮮材料對(duì)rpsl基因突變率的影響

實(shí)施例2

采用rpsl測(cè)定體外條件下納米材料對(duì)rpsl基因突變率的影響，評(píng)估食品污染物納米級(jí)食品保鮮材料的遺傳毒性。

本實(shí)驗(yàn)選取兩種納米級(jí)食品保鮮材料進(jìn)行突變率檢測(cè)，進(jìn)行體外基因擴(kuò)增質(zhì)粒pmol21，以溶劑組作為對(duì)照組，每組至少三次重復(fù)。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞mf101，統(tǒng)計(jì)rpsl基因突變率，突變率結(jié)果見表2，納米材料2的突變率為2.64％高于對(duì)照組。

表2.體外條件下，兩種納米級(jí)食品保鮮材料對(duì)rpsl基因突變率的影響

實(shí)施例3

采用rpsl測(cè)定體內(nèi)條件下，丙烯酰胺對(duì)rpsl基因突變率的影響，評(píng)估食品污染物丙烯酰胺的遺傳毒性。

本實(shí)驗(yàn)將不同濃度的丙烯酰胺加入到培養(yǎng)基中，各組均培養(yǎng)10個(gè)小時(shí)后用于進(jìn)行培養(yǎng)基平板涂布，測(cè)定不同濃度的丙烯酰胺對(duì)大腸桿菌mf101/pmol21的rpsl位點(diǎn)的誘導(dǎo)突變頻率。以溶劑蒸餾水作為對(duì)照組，總菌數(shù)不低于10^-6，所得結(jié)果如表3所示，梯度濃度的丙烯酰胺下的突變頻率具有一定的劑量反應(yīng)關(guān)系，1mg/ml的丙烯酰胺突變率達(dá)到28.11×10^-6，遠(yuǎn)高于對(duì)照組1.85×10^-6。

表3.體內(nèi)條件下，丙烯酰胺對(duì)rpsl基因突變率的影響