本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)藥檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及采用特異性引物快速鑒別烏梢蛇、全蝎和蜈蚣的方法。

背景技術(shù)：

動(dòng)物藥的應(yīng)用由來已久，在早期的著作《黃帝內(nèi)經(jīng)》、《傷寒論》、《神農(nóng)本草經(jīng)》、《本草綱目》等書中就記載了動(dòng)物藥的應(yīng)用及分類，動(dòng)物藥在中藥材市場(chǎng)上占據(jù)著重要地位，在臨床應(yīng)用上有其無法替代的作用和功效。烏梢蛇為游蛇科動(dòng)物烏梢蛇zaocysdhumnades(cantor)的干燥體，蜈蚣為娛蚣科動(dòng)物少棘巨娛松scolopendrasubspinipesmutilansl.koch的干燥體，全蝎為鉗蝎科動(dòng)物東亞鉗蝎buthusmartensiikarsch的干燥體，三種動(dòng)物藥在中醫(yī)臨床上被廣泛應(yīng)用。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction，pcr)技術(shù)作為新興的鑒別技術(shù)，自從1983年由mullils發(fā)明以來，得到了廣泛的應(yīng)用。該技術(shù)是利用高溫變性、低溫復(fù)性及室溫延伸等幾步反應(yīng)，經(jīng)過幾十個(gè)周期循環(huán)，使特異dna序列擴(kuò)增百萬倍以達(dá)到鑒定的目的。特異性引物pcr擴(kuò)增與普通pcr擴(kuò)增相似，但在引物設(shè)計(jì)時(shí)要充分考慮到引物的特異性，用特異性強(qiáng)的引物擴(kuò)增未知模板，通過檢測(cè)目標(biāo)片段的有無，達(dá)到將目標(biāo)品種與其他品種有效鑒別的目的。

目前該技術(shù)已應(yīng)用于多種中藥材的鑒別，應(yīng)用于動(dòng)物藥的研究已見文獻(xiàn)報(bào)道，在《中國藥典》2015版中，已將該技術(shù)應(yīng)用于烏梢蛇的鑒別，但用藥典方法不能將烏梢蛇從全蝎和蜈蚣中區(qū)分出來。目前尚未發(fā)現(xiàn)利用引物對(duì)組合的方式對(duì)烏梢蛇、全蝎和蜈蚣進(jìn)行pcr鑒定的報(bào)道?；诖?，本發(fā)明首次利用引物對(duì)組合的方式將三者進(jìn)行區(qū)分。

本發(fā)明通過對(duì)線粒體基因coi片段進(jìn)行分析，應(yīng)用種特異引物pcr擴(kuò)增技術(shù)和瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)，篩選出三對(duì)引物，可對(duì)烏梢蛇、全蝎、蜈蚣進(jìn)行有效鑒別，填補(bǔ)了該技術(shù)領(lǐng)域的空白。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一套用于鑒別烏梢蛇、全蝎和蜈蚣的pcr引物組合。

本發(fā)明的另一目的是提供一種采用特異性引物快速鑒別烏梢蛇、全蝎和蜈蚣的方法。

本發(fā)明的又一目的是提供上述方法在鑒別中藥材烏梢蛇、全蝎和蜈蚣，及其中藥飲片、中成藥、保健品、中藥配方顆粒中的應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供用于鑒別烏梢蛇、全蝎和蜈蚣的pcr引物組合，所述引物組合包括：

用于鑒別烏梢蛇、全蝎和蜈蚣的通用引物wssf和wssr，引物序列分別如seqidno:3和4所示；

用于鑒別蜈蚣的特異性引物wgf和wgr，引物序列分別如seqidno:5和6所示；

用于鑒別全蝎的特異性引物qxf和qxr，引物序列分別如seqidno:7和8所示。

本發(fā)明還提供含有所述引物組合的用于鑒別烏梢蛇、全蝎和蜈蚣的檢測(cè)試劑盒。

本發(fā)明的試劑盒還包括用于dna提取質(zhì)量檢查的引物tyf和tyr，所述引物tyf和tyr為鑒別烏梢蛇、全蝎和蜈蚣的通用引物，引物序列分別如seqidno:1和2所示。

本發(fā)明的試劑盒還包括dntps、taqdna聚合酶、mg²⁺、pcr反應(yīng)緩沖液、標(biāo)準(zhǔn)陽性模板等中的至少一種。

本發(fā)明還提供一種采用特異性引物快速鑒別烏梢蛇、全蝎和蜈蚣的方法，其是利用所述引物組合或者所述試劑盒對(duì)烏梢蛇、全蝎和蜈蚣進(jìn)行檢測(cè)。

本發(fā)明進(jìn)一步提供上述方法在鑒別中藥材烏梢蛇、全蝎和蜈蚣，及其中藥飲片、中成藥、保健品、中藥配方顆粒中的應(yīng)用。所述中藥配方顆粒是經(jīng)水提取后，經(jīng)分離、濃縮、干燥等步驟制成的全成分配方顆粒。

所述應(yīng)用包括以下步驟：

1)提取待測(cè)樣品中的dna，并檢查dna質(zhì)量；

2)以步驟1)中提取的dna為模板，分別利用引物wssf和wssr、wgf和wgr、qxf和qxr進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)；

3)分析pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。

前述的應(yīng)用，步驟2)中各pcr反應(yīng)體系為：2×taqpcrmixture12.5μl，dna模板1μl，ddh2o9.5μl，10μm上、下游引物各1μl。

引物wssf和wssr對(duì)應(yīng)的pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃5min；95℃30s，63℃45s，72℃30s，35個(gè)循環(huán)；72℃5min；4℃保存。

引物wgf和wgr對(duì)應(yīng)的pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃5min；94℃30s，56℃1min，72℃1min，30個(gè)循環(huán)；72℃7min；4℃保存。

引物qxf和qxr對(duì)應(yīng)的pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃4min；95℃40s，65℃1min，72℃30s，30個(gè)循環(huán)；72℃5min；4℃保存。

前述的應(yīng)用，步驟1)提取待測(cè)樣品中dna的具體操作如下：

本發(fā)明采用商品化試劑盒進(jìn)行dna提取。血液/細(xì)胞/組織基因組dna提取試劑盒(離心柱型)，購自天根生化科技(北京)有限公司，商品編號(hào)：czt.#dp304-03，lot#03706。

取每個(gè)樣品適量，置于高壓滅菌后的2.0ml離心管中，加入兩粒小號(hào)研磨珠和一粒大號(hào)研磨珠，將管子蓋嚴(yán)，放入液氮中冷凍60s，在60hz，90s條件下，研磨兩次；取出上述離心管，稱取30mg，置于2.0ml離心管中，加入600μlga緩沖液，100mg/mlrnasea12μl，20mg/ml蛋白酶k60μl，置于56℃水浴振蕩器中，裂解1.5h；水浴后每份加入600μl緩沖液gb，上下顛倒混勻，70℃放置10min；再加入600μl無水乙醇，渦旋振蕩器上震蕩15s，將液體加至吸附柱cb3中，(本步中的液體需要分次加入，每次600μl)室溫放置2min，12000rpm離心1min，棄掉廢液，將吸附柱cb3放入收集管中；向吸附柱cb3中加入500μlgd緩沖液，12000rpm離心1min，倒掉廢液，將吸附柱cb3放入收集管中；向吸附柱cb3中加入600μl漂洗液pw，12000rpm離心1min，倒掉廢液，將吸附柱cb3放入收集管中；再將吸附柱cb3放回收集管中，12000rpm離心5min，倒掉廢液；將吸附柱cb3置于65℃的金屬浴中10min，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；將吸附柱cb3轉(zhuǎn)入另一個(gè)1.5mlep管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50μl洗脫緩沖液te，室溫放置5min，12000rpm離心1min，將溶液收集到1.5mlep管中(實(shí)驗(yàn)時(shí)采用兩次洗脫法，以保證樣品的洗脫效率)；提取后的dna存放于-20℃冰箱中。

前述的應(yīng)用，步驟1)中檢查dna質(zhì)量的具體方法為：以提取的dna為模板，利用引物tyf和tyr進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)，并分析pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。

pcr反應(yīng)體系為：2×taqpcrmixture12.5μl，dna模板1μl，ddh2o9.5μl，10μm上、下游引物各1μl。

pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃5min；95℃30s，57℃30s，72℃30s，40個(gè)循環(huán)；72℃10min；4℃保存。

本發(fā)明中，分析pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的方法如下：取pcr擴(kuò)增產(chǎn)物5μl在含genegreen核酸染料的2.0％瓊脂糖凝膠電泳儀上電泳1h，并在凝膠成像儀中觀察電泳結(jié)果。

在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，應(yīng)用種特異引物pcr技術(shù)和瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)，篩選出第一對(duì)引物tyf和tyr，可在烏梢蛇、全蝎和蜈蚣中擴(kuò)增出目的條帶，證明dna提取成功，結(jié)果如圖1所示；第二對(duì)引物wssf和wssr，可將烏梢蛇、全蝎和蜈蚣鑒別出來，結(jié)果如圖2所示；第三對(duì)引物wgf和wgr可將蜈蚣從烏梢蛇和全蝎中鑒別出來，結(jié)果如圖3所示；第四對(duì)引物qxf和qxr可將全蝎與烏梢蛇區(qū)分開，結(jié)果如圖4所示，反應(yīng)均在pcr擴(kuò)增儀(appliedbiosystem)上進(jìn)行，反應(yīng)體系：總體系25μl，包括12.5μl2×taqpcrmixture，1μldna模板，9.5μlddh2o，10μm上、下游引物各1μl，引物序列及反應(yīng)條件如表1所示，分別取pcr反應(yīng)液在已添加genegreen核酸染料的2.0％瓊脂糖凝膠上點(diǎn)樣，在mbe-150電泳儀上電泳1h(120v)，凝膠成像儀上檢測(cè)結(jié)果，觀察擴(kuò)增帶的大小和寬度；該方法能夠快速、準(zhǔn)確、特異性的將烏梢蛇、全蝎和蜈蚣進(jìn)行有效鑒別。

表1引物及pcr反應(yīng)程序

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(一)本發(fā)明通過對(duì)線粒體coi基因的分析，開發(fā)出三對(duì)種特異性pcr引物并結(jié)合瓊脂糖凝膠技術(shù)，實(shí)現(xiàn)烏梢蛇、全蝎和蜈蚣的有效鑒別。本發(fā)明篩選的鑒定引物對(duì)烏梢蛇、全蝎和蜈蚣具有特異性，從而建立了常規(guī)pcr鑒定方法，大大縮短了鑒定周期，提高了檢測(cè)特異性。

(二)現(xiàn)有技術(shù)中，未見采用pcr技術(shù)通過開發(fā)引物組合對(duì)烏梢蛇、全蝎和蜈蚣進(jìn)行pcr鑒定的相關(guān)報(bào)道。本發(fā)明首次設(shè)計(jì)出能對(duì)烏梢蛇、全蝎和蜈蚣進(jìn)行特異性擴(kuò)增的引物組合，且擴(kuò)增結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

(三)本發(fā)明中首次采用特異性引物組合鑒別烏梢蛇、全蝎和蜈蚣，為三者的鑒定提供了快速、準(zhǔn)確、有效的檢測(cè)方法。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例2中利用引物tyf和tyr進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)的凝膠電泳結(jié)果；其中，m:marker1；1:烏梢蛇；2:蜈蚣；3:全蝎。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例3中利用引物wssf和wssr進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)的凝膠電泳結(jié)果；其中，m:marker1；1:烏梢蛇對(duì)照藥材；2:烏梢蛇；3:蜈蚣；4:全蝎。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例3中利用引物wgf和wgr進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)的凝膠電泳結(jié)果；其中，m:marker1；1:烏梢蛇；2:全蝎；3:蜈蚣。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例3中利用引物qxf和qxr進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)的凝膠電泳結(jié)果；其中，m:marker1；1:烏梢蛇；2:蜈蚣；3:全蝎。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。

以下實(shí)施例的設(shè)計(jì)構(gòu)思：對(duì)于配方顆粒而言，原藥材的外觀性狀完全破壞，烏梢蛇、全蝎、蜈蚣三種動(dòng)物藥配方顆粒的外觀性狀又十分相似，一旦發(fā)生混淆，采用傳統(tǒng)的薄層技術(shù)無法對(duì)三種動(dòng)物藥配方顆粒進(jìn)行有效區(qū)分，發(fā)明人通過對(duì)線粒體基因coi片段進(jìn)行分析，應(yīng)用種特異引物pcr擴(kuò)增技術(shù)和瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)，篩選出三對(duì)引物可對(duì)三種動(dòng)物藥配方顆粒進(jìn)行鑒別，從而建立一套快速、準(zhǔn)確、有效的pcr鑒定三種動(dòng)物藥配方顆粒的方法。

以下實(shí)施例中使用的烏梢蛇配方顆粒、蜈蚣配方顆粒和全蝎配方顆粒均購自北京康仁堂藥業(yè)有限公司。

酶及其他試劑：瓊脂糖(biowest)購自秀百銳生物器材有限公司，gene核酸染料、2*taqpcrmixture、marker、rnasea、血液/細(xì)胞/組織基因組dna提取試劑盒，均購自天根生化科技有限公司，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其余試劑均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司。

主要儀器設(shè)備：2720型pcr擴(kuò)增儀(appliedbiosystem公司)，thz-82型雙數(shù)顯旋轉(zhuǎn)水浴振蕩器(金壇市城東新瑞儀器廠)，p70d20l-de(w0)型微波爐(格蘭仕微波生活電器有限公司)，js-6800型凝膠成像儀(上海培清科技有限公司)，ldzf-30kb-ⅲ型立式蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)，mbe-150型電泳儀(美國ms公司)，micro21r臺(tái)式高速低溫離心機(jī)(美國thermo公司)等。

本發(fā)明中使用的所有原輔料材料、試劑和儀器、設(shè)備均為本領(lǐng)域熟知選用的，但不限制本發(fā)明的實(shí)施，其他本領(lǐng)域熟知的一些試劑和設(shè)備均可適用于本發(fā)明。

實(shí)施例1三種動(dòng)物藥配方顆粒基因組dna的提取

采用血液/細(xì)胞/組織基因組dna提取試劑盒來提取三種動(dòng)物藥配方顆?；蚪Mdna。

取北京康仁堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的動(dòng)物藥配方顆粒3種，分別為烏梢蛇配方顆粒、蜈蚣配方顆粒和全蝎配方顆粒。每個(gè)樣品取約1.0g，置于高壓滅菌后的2.0ml離心管中，加入兩粒小號(hào)研磨珠和一粒大號(hào)研磨珠，將管子蓋嚴(yán)，放入液氮中冷凍60s，在60hz，90s條件下，研磨兩次。取出上述離心管，稱取30mg，置于2.0ml離心管中，加入600μlga緩沖液，100mg/mlrnasea12μl，20mg/ml蛋白酶k60μl，置于56℃水浴振蕩器中，裂解1.5h。水浴后每份加入600μl緩沖液gb，上下顛倒混勻，70℃放置10min。再加入600μl無水乙醇，渦旋振蕩器上震蕩15s，將液體加入到吸附柱cb3中，(本步中的液體需要分次加入，每次600μl)室溫放置2min，12000rpm離心1min，棄掉廢液，將吸附柱cb3放入收集管中。向吸附柱cb3中加入500μlgd緩沖液，12000rpm離心1min，倒掉廢液，將吸附柱cb3放入收集管中。向吸附柱cb3中加入600μl漂洗液pw，12000rpm離心1min，倒掉廢液，將吸附柱cb3放入收集管中。再將吸附柱cb3放回收集管中，12000rpm離心5min，倒掉廢液。將吸附柱cb3置于65℃的金屬浴中10min，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。將吸附柱cb3轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的1.5mlep管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50μl洗脫緩沖液te，室溫放置5min，12000rpm離心1min，將溶液收集到1.5mlep管中(實(shí)驗(yàn)時(shí)采用兩次洗脫法，以保證樣品的洗脫效率)。提取后的dna存放于-20℃冰箱中。

以上操作中，應(yīng)確認(rèn)是否將指定體積的無水乙醇加入到gd和pw中，加入時(shí)應(yīng)沿著試劑管的管壁四周，這樣可以完全將粘附在管壁上的鹽分沖洗干凈。

上述緩沖液te可用滅菌后的蒸餾水代替，在洗脫時(shí)加熱至65℃，這樣可以提高洗脫效率。

實(shí)施例2dna質(zhì)量檢查

烏梢蛇配方顆粒、蜈蚣配方顆粒和全蝎配方顆粒dna提取質(zhì)量用引物對(duì)tyf/tyr(seqidno:1和2)來檢查。該對(duì)引物是專門用于動(dòng)物藥模板dna質(zhì)量的通用引物。

pcr反應(yīng)體系為：2×taqpcrmixture12.5μl，dna模板1μl，ddh2o9.5μl，10μm上、下游引物各1μl。

pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃5min；95℃30s，57℃30s，72℃30s，40個(gè)循環(huán)；72℃10min；4℃保存。

進(jìn)行pcr反應(yīng)后，分別取pcr產(chǎn)物5μl在含genegreen核酸染料的2.0％瓊脂糖凝膠電泳儀上電泳1h(90v)，凝膠成像儀上檢測(cè)結(jié)果，觀察擴(kuò)增帶的大小和寬度。結(jié)果顯示在100bp～200bp之間出現(xiàn)目的條帶，亮度的差異表示模板dna濃度的差異(圖1)。

實(shí)施例3采用特異性引物快速鑒定三種動(dòng)物藥配方顆粒的方法

應(yīng)用種特異性引物pcr和瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)，篩選出三對(duì)引物組合鑒定動(dòng)物藥配方顆粒的特異性引物。引物擴(kuò)增反應(yīng)在pcr儀上進(jìn)行，pcr反應(yīng)體系：12.5μl2×taqpcrmixture，1μldna模板，9.5μlddh2o，10μm上、下游引物各1μl，總體積25μl，反應(yīng)條件如下：

引物wssf和wssr對(duì)應(yīng)的pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃5min；95℃30s，63℃45s，72℃30s，35個(gè)循環(huán)；72℃5min；4℃保存。

引物wgf和wgr對(duì)應(yīng)的pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃5min；94℃30s，56℃1min，72℃1min，30個(gè)循環(huán)；72℃7min；4℃保存。

引物qxf和qxr對(duì)應(yīng)的pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃4min；95℃40s，65℃1min，72℃30s，30個(gè)循環(huán)；72℃5min；4℃保存。

進(jìn)行pcr反應(yīng)后，分別取pcr擴(kuò)增產(chǎn)物5μl在含genegreen核酸染料的2.0％瓊脂糖凝膠電泳儀上電泳1h，凝膠成像儀上檢測(cè)結(jié)果，觀察擴(kuò)增帶的大小和寬度；引物wssf和wssr，可將烏梢蛇配方顆粒、全蝎配方顆粒和蜈蚣配方顆粒鑒別出來，結(jié)果如圖2所示；引物wgf和wgr可將蜈蚣配方顆粒從烏梢蛇配方顆粒和全蝎配方顆粒中鑒別出來，結(jié)果如圖3所示；引物qxf和qxr可將全蝎配方顆粒與烏梢蛇配方顆粒區(qū)分開，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，獲得的三對(duì)組合引物wssf和wssr(seqidno:3和4)、wgf和wgr(seqidno:5和6)、qxf和qxr(seqidno:7和8)，方法能夠快速、準(zhǔn)確、特異性的對(duì)烏梢蛇、蜈蚣和全蝎三種動(dòng)物藥配方顆粒進(jìn)行有效鑒別。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

序列表

<110>北京康仁堂藥業(yè)有限公司

<120>采用特異性引物鑒別烏梢蛇、全蝎和蜈蚣的方法

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