本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一個阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征易感基因adipoq基因的變異位點，本發(fā)明還涉及該變異位點的檢測方法及檢測試劑盒。

背景技術(shù)：

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructivesleepapnea-hypopneasyndrome，osahs)是睡眠期間周期性上呼吸道阻塞致呼吸暫停和低通氣，引起反復(fù)的低氧血癥。目前認(rèn)識到osahs是一種全身性疾病。2008年美國心臟協(xié)會(aha)/美國心臟病學(xué)學(xué)院基金會(accf)發(fā)表科學(xué)聲明指出，osahs是高血壓、冠心病、心力衰竭、心律失常、卒中等心腦血管病新認(rèn)識到的、可干預(yù)的獨立危險因素，osahs已成為重大公共衛(wèi)生問題。2015esc室性心律失常管理和心臟性猝死預(yù)防指南指出：睡眠呼吸暫停綜合征減少血氧飽和度是心臟病猝死的危險因素。最新的《睡眠白皮書》顯示我國20.4％的成人患有osahs。

在美國未經(jīng)控制的中-重度osahs每年會增加個人健康消費2700-3000美元，同時，美國中-重度osahs每年總經(jīng)濟成本達(dá)650-1650億美元以上。雖然目前我國尚缺乏osahs對健康消費影響的研究，但2005-2015年心血管疾病、卒中和糖尿病給中國造成約5500億美元的經(jīng)濟損失，而osahs作為心血管疾病的獨立危險因素，在健康消費中也應(yīng)占有重要地位。

osahs是多病因引起的綜合征，其中遺傳因素在其發(fā)病過程中占有重要地位，睡眠呼吸暫停指數(shù)的變化大約40％歸因于遺傳。由于環(huán)境因素是可以人為控制和改變的，而osahs遺傳學(xué)因素卻是固定不變的。對可變因素的控制，如對osahs危險因素的預(yù)防，可以在一定程度上延緩和預(yù)防osahs的發(fā)病，但是對固定不變的遺傳因素的認(rèn)識不足卻嚴(yán)重影響著對osahs的預(yù)測、診斷和治療。因此，對osahs進(jìn)行充分的遺傳學(xué)研究顯得尤為必要。

早在1978年，rostand等提出osahs是常染色體顯性遺傳??；1993年，duglas等對20個非肥胖的睡眠呼吸暫?；颊叩囊患売H屬做了前瞻性研究，研究發(fā)現(xiàn)，其親屬在睡眠中呼吸紊亂的頻率增加；2003年，palmer等對66個確診osahs的白種人進(jìn)行全基因掃描，發(fā)現(xiàn)與ahi相關(guān)的基因位于染色體1q、2q、12q、19q，而與bmi相關(guān)的基因位于染色體2q、7q、19q；隨著二代測序的發(fā)展，越來越多的易感基因被發(fā)現(xiàn)。

最新的一項包括12558名參與者的gwas研究發(fā)現(xiàn)：5個基因(gpr83、atp2b4、arrb1、insig2和plcb1)與osahs的發(fā)生相關(guān)，其中兩個新的位點rs11691765、rs35424364與osahs顯著相關(guān)。但該研究是針對拉丁美洲國家開展的，鑒于osahs相關(guān)基因分布有明顯的種族差異，對亞洲人群而言借鑒意義不大。

脂聯(lián)素(adipoq)基因已被證實為一種osahs的易感基因。人類adipoq基因全長17kb，位于染色體3q27，包括分子量從18-4277bp的3個外顯子和大小為0.8bp和12bp的2個內(nèi)含子。該基因包含公認(rèn)的啟動子元件，但沒有典型的tata(胸腺嘧啶核苷-腺嘌呤核苷-胸腺嘧啶核苷-腺嘌呤核苷)盒，第3個外顯子含有一段長的包括3個alu的重復(fù)序列，這種外顯子-內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)與編碼瘦素(leptin)的肥胖基因非常相似，并且該基因僅在白色脂肪組中表達(dá)，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物脂聯(lián)素是脂肪組織基因表達(dá)最豐富的蛋白質(zhì)產(chǎn)物之一，其血漿濃度為5-30μg/ml，約占總血漿蛋白的0.01％。

adipoq基因編碼脂聯(lián)蛋白的c1q和膠原結(jié)構(gòu)域(adiponectin，c1qandcollagendomaincontaining)——一種在結(jié)構(gòu)上與膠原x和viii以及補體c1q類似的蛋白質(zhì)。脂聯(lián)素作為特異的脂肪細(xì)胞因子，也與肥胖、胰島素抵抗、2型糖尿病和心血管疾病密切相關(guān)。這些疾病患者很多脂肪細(xì)胞因子的血漿濃度明顯上升，但血漿脂聯(lián)素水平卻顯著下降。此外，脂聯(lián)素與體重、脂肪分布、空腹胰島素濃度、葡萄糖耐量試驗呈負(fù)相關(guān)，與胰島素敏感性呈正相關(guān)，因此脂聯(lián)素可以作為這些疾病的診斷指標(biāo)。脂聯(lián)素可能通過其受體結(jié)合激活p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，mapk)，活化過氧化物酶體增殖物激活受體α(pparα)后發(fā)揮改善胰島素抵抗、降血糖、抗炎等生物學(xué)作用；還可通過與脂聯(lián)蛋白受體1(adipor1)結(jié)合，活化amp激活的蛋白激酶(amp-activatedproteinkinase，ampk)進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)作用。

研究證實：adipoq基因的突變或異常表達(dá)等都會引起胰島素抵抗相關(guān)的代謝綜合征。其在osahs患者中主要表現(xiàn)為表達(dá)水平下降，可能的原因是其表達(dá)調(diào)控出現(xiàn)了異常，但是目前對osahs患者adipoq基因變異及轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面的研究仍較少。尤其是針對中國人群的adipoq基因變異位點相關(guān)研究非常缺乏，鑒于不同人種間相同基因中發(fā)生單一核苷酸變異的位點往往具有一定差異，因此，很有必要對中國人群的adipoq基因變異位點進(jìn)行深入研究，力爭尋找到相關(guān)位點并建立相應(yīng)的檢測方法，并推廣應(yīng)用于國人阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征易感人群的篩查、預(yù)防和早期診斷和治療。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開了一個針對中國人群的阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征易感基因adipoq的變異位點，所述位點位于adipoq基因3’端非編碼區(qū)中chromosome3-nc_000003.11區(qū)域186575720-186575721位點處，所述位點的位置在seqidno:1所示的序列中。

adipoq基因詳細(xì)序列可參見登錄號：ng_021140.1。

adipoq基因3’端非編碼區(qū)186575720-186575721位點的核苷酸序列可參見網(wǎng)址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/。

本發(fā)明人對adipoq基因的3’端非編碼區(qū)域進(jìn)行了測序。

本發(fā)明旨在提供一種檢測上述阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征易感基因adipoq變異位點的方法。

本發(fā)明還提供了一種通過對osahs易感基因的檢測來預(yù)測阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征發(fā)病風(fēng)險的方法，即檢測adipoq基因3’端非編碼區(qū)186575720-186575721位點處的基因型是否發(fā)生變異。該基因3’端非編碼區(qū)186575720-186575721位點處發(fā)生ct缺失變異的基因型個體其阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征的發(fā)病風(fēng)險遠(yuǎn)高于普通人群。

上述方法的具體步驟包括：(a)利用dna純化試劑盒抽提樣品的基因組dna，擴增獲得adipoq基因3’端非編碼區(qū)；(b)通過特異性引物擴增獲得該基因包含3’端非編碼區(qū)186575720-186575721位點的區(qū)域，所述特異性引物序列如seqidno:2-3所示，擴增產(chǎn)物序列如seqidno:4所示；(c)檢測步驟；(d)產(chǎn)物中基因變異位點3’端非編碼區(qū)186575720-186575721位點的基因型分析。

上述方法中涉及的抽提基因組dna、測序、擴增等技術(shù)均可采用本領(lǐng)域的常規(guī)操作方法。

本發(fā)明還涉及了adipoq基因3’端非編碼區(qū)186575720-186575721位點基因變異檢測在預(yù)測阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征試劑盒和阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征診斷及治療藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種檢測阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征易感基因變異位點的試劑盒，其中包含擴增adipoq基因3’端非編碼區(qū)186575720-186575721位點區(qū)域的特異性引物。在本發(fā)明的一個實施例中，擴增adipoq基因3’端非編碼區(qū)186575720-186575721位點區(qū)域的特異性引物序列如seqidno:2-3所示。

本發(fā)明通過深入研究，首次證明了adipoq基因變異位點3’端非編碼區(qū)186575720-186575721位點(位于adipoq基因3’端非編碼區(qū)中chromosome3-nc_000003.11區(qū)域的186575720-186575721位點的ct缺失變異)與osahs的發(fā)生密切相關(guān)，并且發(fā)現(xiàn)了該變異位點新的預(yù)測功能：adipoq基因3’端非編碼區(qū)186575720-186575721位點基因型的改變將導(dǎo)致osahs的發(fā)病風(fēng)險升高。其中關(guān)聯(lián)研究結(jié)果顯示，該基因3’端非編碼區(qū)186575720-186575721位點的ct缺失變異在病例組和對照組中的分布存在顯著性差異(p<0.05)，即在osahs患者中該基因型主要變現(xiàn)為ct缺失變異，而在正常對照組中該基因型無缺失變異，該位點變異通過改變轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點發(fā)揮生理作用。

本發(fā)明提供了一種對個體的osahs易感性進(jìn)行判斷的方法，包括以下步驟：檢測受試個體的adipoq基因3’端非編碼區(qū)186575720-186575721位點的基因型，根據(jù)該基因型變異與否判斷該個體患o(jì)sahs的風(fēng)險是否高于普通人群。

本發(fā)明提供了一種檢測樣品是否存在adipoq基因單核苷酸多態(tài)性的方法，包括以下步驟：(a)用adipoq基因3’端非編碼區(qū)特異性引物擴增樣品的基因組dna，得到擴增產(chǎn)物；(b)檢測擴增產(chǎn)物中186575720-186575721位點區(qū)域的基因型。

上述adipoq基因3’端非編碼區(qū)186575720-186575721位點的基因型可用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)如southern印跡法、dna序列分析、pcr和原位雜交法等檢測突變。

綜上所述，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)并公開了一個與中國人群阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征易感性相關(guān)的adipoq基因新的變異位點，并提供了一種檢測阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征易感基因adipoq基因3’端非編碼區(qū)186575720-186575721位點變異的方法，包括檢測該位點的基因型。此外，本發(fā)明還公開了adipoq基因3’端非編碼區(qū)186575720-186575721位點基因變異檢測在預(yù)測阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征試劑盒和阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征診斷及治療藥物中的用途，并提供了相應(yīng)的檢測試劑盒，該試劑盒中包含擴增adipoq基因3’端非編碼區(qū)186575720-186575721位點區(qū)域的特異性引物。本發(fā)明在一定程度上補充了國人阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征易感基因信息的缺乏，有利于阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征的早期篩查和診斷。同時，本發(fā)明變異位點基因型檢測方法及試劑盒操作簡便、快速高效、成本低廉、易于推廣，從而為阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征患病風(fēng)險的預(yù)測提供了簡捷的新途徑，有助于osahs及相關(guān)心腦血管疾病的預(yù)防和治療。

附圖說明

圖1是利用本發(fā)明引物通過pcr擴增后所得產(chǎn)物測序結(jié)果截圖。顯示了adipoq基因3’端非編碼區(qū)186575720-186575721位點的一種變異基因型的測序結(jié)果。其中a圖為正常對照組正向測序圖，b圖為重度阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征患者組正向測序圖。從圖中可以看出，正常對照組的ct堿基在重度osahs組中出現(xiàn)堿基缺失變異。

具體實施方式

以下通過特定的具體實例說明本發(fā)明的實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實施方式加以實施或應(yīng)用，本說明書中的各項細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點與應(yīng)用，在沒有背離本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。

在進(jìn)一步描述本發(fā)明具體實施方式之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護范圍不局限于下述特定的具體實施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體實施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護范圍。

除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實現(xiàn)本發(fā)明。

下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如j.sambrook等著，分子克?。簩嶒炇沂謨?newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照實驗器材制造廠商所建議的條件。

實施例1阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征相關(guān)基因篩查

研究對象：嚴(yán)格按照重度阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征的入組和排除標(biāo)準(zhǔn)入選病例和對照組各100例；收集相應(yīng)的臨床資料信息(基本信息，生化指標(biāo)，病史)及靜脈血4ml；dta抗凝管收取，暫時4℃保存。分離白細(xì)胞：將盛有血液的抗凝管放入離心管中，3000r/min離心10min，可見血液分為三層：下層為紅細(xì)胞，中間層為白細(xì)胞，上層為血漿，分離外周血白細(xì)胞，1.5mlep管中存放，然后置于-80℃保存。

一、提取外周血dna、測定濃度和純度

使用qiaampdnaminikit(購自qiagen,hilden,germany)，提取外周血基因組dna。

實驗試劑：

無水乙醇(分析純)西隴化工股份有限公司

qiaampdnaminikitqiagen,hilden,germany

實驗儀器：

提取方法：

取全血200μl，按照qiaampdnaminikit基因組抽提試劑盒說明書，提取基因組dna，實驗步驟如下：

1、用移液槍吸20μl蛋白酶放在1.5mlep管中，加入200μl血樣；

2、加入200μlbufferal至樣品，震蕩15s；

3、56℃金屬浴加熱10min；

4、加入200μl乙醇(96-100％)，震蕩混勻15s；

5、混合物加入吸附柱管中，8000rpm離心1min，把柱子放到新管子中，棄濾液；

6、加入500μlbufferaw1于吸附柱中，8000rpm離心1min，把柱子放到新管子中，棄濾液；

7、加入500μlbufferaw2，8000rpm離心1min，把柱子放到新管子中，棄濾液；

8、在離心管中加入500μl無水乙醇，8000rpm離心1min，棄濾液；

9、12000rpm空轉(zhuǎn)3min；

10、把吸附柱放在干凈的離心管中，開蓋室溫靜置5min，加入50μlbufferae，扣蓋室溫中靜置5min，12000rpm離心1min。

dna濃度及純度測定：

按照nanodrop2000儀器使用說明書檢測基因組dna濃度及純度。

實驗步驟如下：

1、打開測定軟件；

2、加1.5μl蒸餾水至測量孔，放下檢測臂，然后抬起來用濾紙將測量孔和檢測臂的水擦干；

3、用移液槍取1.5μlbufferae至測量孔，放下檢測臂，點擊blank做空白對照；

4、抬起檢測臂，用濾紙將測量孔和檢測臂的水擦干，吸取1.5μl樣本至測量孔，放下檢測臂，點擊measure測量，記錄od260、od280值。dna樣本的濃度(μg/ml)＝od260*50；純度值od260/od280＞2.0，表明有rna污染；純度值od260/od280＜1.6，表明有蛋白質(zhì)、有機溶劑等污染。

二、運用sanger測序法對adipoq基因上的變異位點186575720-186575721進(jìn)行檢測

主要試劑和儀器：

實驗步驟如下：

1、運用pcr擴增含目的位點的基因片段

引物序列：

正向引物：5’－aaaataacatacgcactcaacttcc－3’；

反向引物：5’－agaggtagcagtgagccaagat－3’。

2、pcr反應(yīng)體系

3、pcr反應(yīng)條件如下：

95℃10min預(yù)變性；

95℃30s變性—60℃30s退火—72℃30s延伸，共35個循環(huán)；

72℃10min延伸；4℃保存。

4、瓊脂糖凝膠電泳

取瓊脂糖1.8g，倒入三角燒杯，加入1xtbe緩沖液，定容至60ml，微波爐加熱溶解；2min后取出燒杯，加入eb溶液2μl，混勻，倒入固定有塑料齒梳的凝膠槽；30min后取出梳子和隔板，將成型的膠放入水平電泳槽中；吸取5μl酶切產(chǎn)物至薄膜手套表面，加入1μl6x上樣緩沖液，移液槍吹打混勻，將上述混合物加入到凝膠點樣孔中，最后加入5μldl500作為marker。打開開關(guān)，設(shè)置電壓120v，電泳30min后，將凝膠置入凝膠成像儀。

5、運用e.z.n.a.gelextractionkit試劑盒從瓊脂糖凝膠中回收目標(biāo)dna片段實驗步驟如下：

1)切取目標(biāo)片段的凝膠，稱重，加入等倍量bindingbuffer(如凝膠0.2g，則體積為0.2ml)，于65℃溫浴10min，使凝膠完全融化；

2)轉(zhuǎn)移上述混合液至hibinddna柱子上，10000rpm離心1min，棄去濾液；

3)加入bindingbuffer300μl，10000rpm離心1min，棄去濾液；

4)加入spwwashbuffer700μl，10000rpm離心1min，棄去濾液；

5)重復(fù)步驟4)一次；

6)13000rpm離心2min甩干殘留的液體；

7)加入50μl滅菌水在柱膜上洗脫dna，室溫放置5min，10000rpm離心1min，收集濾液即為目標(biāo)dna片段。

然后以回收的目標(biāo)dna片段為模板，建立測序pcr反應(yīng)，反應(yīng)體系如下：

測序pcr反應(yīng)條件如下：

96℃10min預(yù)變性；

96℃10s變性—50℃5s退火—60℃4min延伸，共25個循環(huán)；

60℃7min延伸；4℃保存。

對pcr產(chǎn)物進(jìn)行上機前純化，步驟如下：

1)ep管中加入2μl125mmedta，2μl3mnaac和50μl無水乙醇，混勻，室溫放置15min，3000rpm離心30min，倒置ep管，甩去上清液；

2)加入70μl70％乙醇，3000rpm離心30min，倒置ep管，甩去上清液；

3)重復(fù)步驟2)一次；

4)室溫?fù)]發(fā)掉乙醇，加入10μlhidi溶解dna，95℃變性4min，迅速置冰上冷卻4min后，轉(zhuǎn)移至96孔板中；

5)在3130基因分析儀中進(jìn)行毛細(xì)電泳分析(結(jié)果如附圖1所示)。

三、統(tǒng)計結(jié)果分析：計算基因位點的突變率，進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果顯示adipoq基因3’端非編碼區(qū)186575720-186575721位點的ct缺失變異在病例組和對照組中的分布存在顯著性差異(p<0.05)，即在osahs患者中該基因型主要表現(xiàn)為ct缺失變異，而在正常對照組中該基因型無缺失變異。

在本發(fā)明中提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用做參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，以上對本發(fā)明優(yōu)選的具體實施方式和實施例作了詳細(xì)說明，但是本發(fā)明并不限于上述實施方式和實施例，在本領(lǐng)域技術(shù)人員所具備的知識范圍內(nèi)，還可以在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下作出各種變化。

sequencelisting

<110>首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院，北京市心肺血管疾病研究所

<120>阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征易感基因adipoq的變異位點及其檢測方法

和用途

<130>2017

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1000

<212>dna

<213>人體

<400>1

agctggaaaattcctattgattttctctaaaatttcaacaagtagctaaagtctggctat60

gctcacagtctcacatctggttggggtgggctccttacagaacacgctttcacagttacc120

ctaaactctctggggcagggttattcctttgtggaaccagaggcacagagagagtcaact180

gaggccaaaagaggcctgagagaaactgaggtcaagatttcaggattaatggtcctgtga240

tgctttgaagtacaattgtggatttgtccaattctctttagttctgtcagcttttgcttc300

atatattttagcgctctattattagatatatacatgtttagtattatgtcttattggtgc360

atttactctcttatcattatgtaatgtccttctttatctgtgataattttctgtgttctg420

aagtctactttgtctaaaaataacatacgcactcaacttccttttctttcttccttcctt480

tctttcttccttcctttctttctctctctctctttccttccttccttcctccttttcttt540

ctctctctctctctctctctttttttgacagactctcgttctgtggccctggctggagtt600

cagtggtgtgatcttggctcactgctacctctaccatgagcaattctcctgcctcagcct660

cccaagtagctggaactacaggctcatgccactgcgcccagctaatttttgtatttttcg720

tagagacggggtttcaccacattcgtcaggttggtttcaaactcctgactttgtgatcca780

cccgcctcggcctcccaaagtgctgggattacaggcatgagccatcacacctggtcaact840

ttcttttgattagtgtttttgtggtatatctttttccatcatgttactttaaatatatct900

atattattgtatttaaaatgtgtttcttacagactgcatgtagttgggtataatttttat960

ccagtctaaaaatatctgtcttttaattggtgtttagaca1000

<210>2

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

aaaataacatacgcactcaacttcc25

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

agaggtagcagtgagccaagat22

<210>4

<211>174

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

aggggtcattgtcttctttctttcttccttcctttctttctctctctctctttttctctc60

tctctctcctctttttttttctctctctctctctctctttttttgagacacactctctct120

gtgggcctggggggggatttcaggggtgagctcgtgtctctgtgacatctctaa174