本發(fā)明涉及一種微生物，特別是一種分離自中國黃海海州灣海域海泥的解角質(zhì)素微桿菌mcda02(microbacteriumkeratanolyticum)；該菌株已經(jīng)于2017年1月6號保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心cgmcc，保藏編號為cgmccno.13539；本發(fā)明還涉及該菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶的方法與產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
：幾丁質(zhì)又叫甲殼素、甲殼質(zhì)，為n-乙酰葡糖胺通過β-1,4-糖苷鍵連接聚合而成的結(jié)構(gòu)同多糖。幾丁質(zhì)廣泛存在于無脊椎動物的外骨骼及表皮和真菌及藻類的細胞壁中，是僅次于纖維素居世界第二的天然有機化合物。幾丁質(zhì)不溶于水、酒精、弱酸和弱堿等液體，不容易被廣泛的開發(fā)利用。殼聚糖是幾丁質(zhì)的n-脫乙?；问?，因其分子中有大量游離氨基，具有良好的生物相容性和生物可降解，并具有抗癌、降低膽固醇、降血壓等生物活性，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、輕工、印染、環(huán)保和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。幾丁質(zhì)脫乙酰轉(zhuǎn)化為殼聚糖的處理方法分為化學(xué)熱堿法和生物酶法。采用強堿熱化學(xué)法生產(chǎn)，該法不僅污染嚴(yán)重，且反應(yīng)過程不易控制，產(chǎn)品分子量不穩(wěn)定。尤為嚴(yán)重的是排放物造成了巨大的環(huán)境污染，對周邊生態(tài)破壞嚴(yán)重。幾丁質(zhì)脫乙酰酶(chitindeacetylase,e.c.3.5.1.41)可以水解脫掉甲殼素上的乙酰基，條件溫和、脫乙酰程度一致、且不造成環(huán)境污染，為解決殼聚糖生產(chǎn)中的環(huán)境污染問題提供了一條新的途徑。另外，將幾丁質(zhì)脫乙酰酶與幾丁質(zhì)酶聯(lián)用，還可以生產(chǎn)出化學(xué)法不能生產(chǎn)的具有特定乙酰化位置的或者分子質(zhì)量分布范圍窄的殼聚糖產(chǎn)品。酶法制備殼聚糖條件溫和、環(huán)境友好、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，引起了人們的高度關(guān)注。幾丁質(zhì)脫乙酰酶的研究和規(guī)模化制備是酶法制備殼聚糖的前提條件。1974年，mucorrouxiicda被日本研究者首次報道。隨后，研究者已經(jīng)從真菌、細菌和昆蟲分離獲得了cda。其中，微生物最利于低成本規(guī)模化制備幾丁質(zhì)脫乙酰酶。目前，產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶的真菌菌株報道最多。產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶的細菌只有alcaligenessp.(srinivasanetal,1998)和rhodococcussp.。相對于真菌，細菌產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶速率更快。目前報道的幾丁質(zhì)脫乙酰酶存在產(chǎn)酶活力低、脫乙酰效果差等問題。特別對于我國來講，在幾丁質(zhì)脫乙酰酶方面的研究起步較晚，相關(guān)報道少。因此，需要擴大對產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶微生物資源的篩選，緩解上述存在的問題，以滿足工業(yè)化生產(chǎn)需要。目前報道的微生物幾丁質(zhì)脫乙酰酶的最適溫度為50-60℃。海洋細菌解角質(zhì)素微桿菌mcda02所產(chǎn)cda最適合作用溫度較低，常溫下催化活性更高，在工業(yè)應(yīng)用中具有節(jié)省能源，降低成本的優(yōu)勢。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新的能產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶的來自海洋的解角質(zhì)素微桿菌mcda02。本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是提供上述來自海洋的解角質(zhì)素微桿菌mcda02產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶的方法與產(chǎn)品。本發(fā)明的特征包括解角質(zhì)素微桿菌(microbacteriumkeratanolyticum)mcda02菌株本身(以下簡稱菌株mcda02)，以及利用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶的方法。本發(fā)明涉及的菌株mcda02是在中國黃海海州灣海域的海泥中分離到的解角質(zhì)素微桿菌mcda02(microbacteriumkeratanolyticum)，該菌株已經(jīng)與2017年1月6號保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心cgmcc，保藏編號為cgmccno.13539。保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。聯(lián)系電話為010-64806086。本發(fā)明還公開了利用來自海洋的解角質(zhì)素微桿菌mcda02產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶的方法，其步驟如下：將以上所述的解角質(zhì)素微桿菌mcda02接種到種子培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速180r/min，30℃培養(yǎng)24h，得種子液；將種子液以1％的接種量接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，180r/min，20℃培養(yǎng)48h，10000r/min離心10min，取上清液即為幾丁質(zhì)脫乙酰酶粗酶粗酶液；所述種子培養(yǎng)基為：酵母粉0.1％，蛋白胨0.5％，nacl1％，陳海水配制，ph7.0；發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米漿0.5％，可溶性淀粉0.3％，nh4so40.3％，kh2po40.15％，mgso40.05％，粉末幾丁質(zhì)1％，陳海水配制，ph8.0。本發(fā)明還公開了一種幾丁質(zhì)脫乙酰酶，該幾丁質(zhì)脫乙酰酶是以所述的解角質(zhì)素微桿菌mcda02為產(chǎn)酶菌，再按照以上所述的產(chǎn)酶方法發(fā)酵培養(yǎng)得到幾丁質(zhì)脫乙酰酶粗酶液。以下對本發(fā)明進行詳細闡述。一、本發(fā)明菌株mcda02的形態(tài)特征與生理生化特征。1.1形態(tài)特征：該菌株為革蘭氏陰性短桿菌，無芽孢(參照圖1)。該菌株在2216e固體培養(yǎng)上培養(yǎng)48h后：黃色，半透明，表面光滑濕潤，圓形，邊緣齊整，中心稍突起，易挑取。在含有膠體幾丁質(zhì)和對硝基-n-乙酰苯胺的篩選培養(yǎng)基上能夠產(chǎn)生黃色變色圈(參照圖2)。1.2生理生化特征：該菌株淀粉水解、吲哚試驗、硫化氫產(chǎn)生、精氨酸脫羧酶試驗均呈陽性，檸檬酸鹽利用、接觸酶、明膠液化、vp試驗、甲基紅、葡萄糖發(fā)酵、硝酸鹽還原試驗均為陰性。部分生理生化結(jié)果見表1。表1mcda02菌株的生理生化試驗結(jié)果檢測項目特征檢測項目特征吲哚試驗+甲基紅-硫化氫產(chǎn)生+明膠液化-淀粉水解+接觸酶-精氨酸脫羧酶+硝酸還原-vp-檸檬酸利用-注：+：陽性；-：陰性；1.3菌株mcda0216srdna序列的擴增和分析用axygen試劑盒提取得到mcda02的基因組，選用擴增原核微生物16srdna序列的通用引物于pcrmix體系中反應(yīng)。所述用于pcr反應(yīng)的通用引物為：27f：5’-agagtttgatcctggctcag-3’1492r：5’-ggttaccttgttacgactt-3’所述反應(yīng)體系為：pcrmix(21μl)，上下游引物(各1μl)，dna模板(2μl)。反應(yīng)程序：94℃變性5min；94℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸90s，32個循環(huán)；72℃終延伸10min。將pcr產(chǎn)物送至南京思普金公司測序，得1395bp序列。將該序列與genbank數(shù)據(jù)庫中的序列進行同源性比對，發(fā)現(xiàn)與菌株microbacteriumkeratanolyticumou01(登錄號：dq118082.1)16srdna相似性達100％。用mega7.0軟件進行16srdna序列的比對分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株mcda02與microbacteriumkeratanolyticumou01親緣關(guān)系最近(參見圖3)二、本發(fā)明菌株mcda02生長特性本發(fā)明提供的菌株mcda02，對其生長特性進行了細致的研究，基本摸清了不同條件下該菌的生長情況。2.1本發(fā)明涉及的培養(yǎng)基2216e培養(yǎng)基：蛋白胨0.5％，酵母粉0.1％，fepo40.01％，瓊脂2％，陳海水配置，ph7.0。篩選培養(yǎng)基：膠體幾丁質(zhì)0.2％，k2hpo40.07％，kh2po40.03％，mgso40.05％，對硝基-n-乙酰苯胺0.02％，陳海水配置，ph7.0。種子培養(yǎng)基：酵母粉0.1％，蛋白胨0.5％，nacl1％，陳海水配置，ph7。發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米漿0.5％，可溶性淀粉0.3％，nh4so40.3％，kh2po40.15％，mgso40.05％，粉末幾丁質(zhì)1％，陳海水配制，ph8.0。2.2種子液的制備：將菌株mcda02的2216e斜面種子接種到種子培養(yǎng)基中30℃，180r/min，裝液量20％，培養(yǎng)24h。2.3溫度對菌株mcda02生長的影響將種子液以1％的接種量接于2216e液體培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速180r/min，裝液量為20％，分別在不同溫度下培養(yǎng)48h，培養(yǎng)基起始ph7.0，每隔6h取樣測定其od600的值。mcda02最佳生長溫度為30℃下生長最快，5℃和45℃菌株生長速度顯著降低(參見圖4)。2.4ph對菌株生長的影響在ph3.0-ph11.0范圍、溫度為30℃，其它條件同2.3，對mcda02進行搖瓶培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)該菌在ph6.0-9.0范圍內(nèi)生長良好，最適生長ph為8.0，參見圖5。2.5nacl濃度對菌株生長的影響用蒸餾水配置2216e培養(yǎng)基，nacl范圍為0％-10％，然后接種該菌在最適溫度和ph條件下培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)該菌在0％-10％的nacl濃度范圍內(nèi)可以生長，最適生長的nacl濃度為3.0％，參見圖6。三、菌株mcda02發(fā)酵生產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶的方法發(fā)明人對菌株mcda02發(fā)酵生產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶的方法進行了研究。3.1發(fā)酵時間對菌株mcda02產(chǎn)酶的影響將種子液以1％接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、裝液量20％、180r/min發(fā)酵60h，每隔6h取樣測酶活力，結(jié)果表明48h產(chǎn)酶最高(參圖7)。3.2發(fā)酵溫度對菌株mcda02產(chǎn)酶的影響將種子液以1％接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量20％、180r/min，在不同溫度下進行48h培養(yǎng)，結(jié)果顯示30℃時酶產(chǎn)量達到最高，20℃時有較高的產(chǎn)酶量，達到最高產(chǎn)酶的80％(參圖8)。3.3培養(yǎng)基起始ph對菌株mcda02產(chǎn)酶的影響將種子液以1％接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、裝液量20％、180r/min，調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基不同初始ph，培養(yǎng)48h后測定酶活力，結(jié)果表明，隨著初始ph的升高酶產(chǎn)量逐漸增加，當(dāng)ph達到8.0時產(chǎn)酶量達到最大，低于ph6.0或高于ph10.0時酶產(chǎn)量顯著降低(參見圖9)。3.4裝液量對菌株mcda02產(chǎn)酶的影響將種子液以1％接種量接種至不同裝液量發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、180r/min，培養(yǎng)48h后測定酶活力，結(jié)果顯示250ml三角瓶中裝液量在20％時產(chǎn)酶最高，(參見圖10)。3.5誘導(dǎo)劑對菌株mcda02產(chǎn)酶的影響將種子液以1％接種量接種至不同幾丁質(zhì)含量的發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、裝液量20％、180r/min，培養(yǎng)48h后測定酶活力，幾丁質(zhì)添加量為3％時產(chǎn)酶量達到最大值(參見圖11)。3.6幾丁質(zhì)脫乙酰酶活性測定方法試管中加入30℃預(yù)保溫的0.05mol/lph7.0磷酸緩沖液3ml，200mg/l的對硝基乙酰苯胺水溶液1ml，酶液1ml，于30℃水浴反應(yīng)15min，沸水浴終止酶促反應(yīng)，3000r/min離心10min，測定上清液的吸光度。以添加1ml同樣濃度沸水浴滅活15min的酶液作為對照。酶活單位(u)定義：在上述反應(yīng)條件下每小時產(chǎn)生1μg對硝基苯胺所需要的酶量定義為一個酶活力單位。四、溫度和ph對菌株mcda02幾丁質(zhì)脫乙酰酶活性和穩(wěn)定性的影響4.1粗酶液的制備將菌株mcda01的2216e斜面種子接種到種子培養(yǎng)基中，30℃，180r/min，裝液量20％，培養(yǎng)24h，得到種子液。以1％接種量將種子液接種至裝液量為20％的發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、180rpm搖床培養(yǎng)60h，10000r/min離心10min，取上清即為幾丁質(zhì)脫乙酰酶粗酶液。4.2溫度對菌株mcda02幾丁質(zhì)脫乙酰酶活性和穩(wěn)定性的影響在ph7.0，0.05mmol/l磷酸緩沖液中于不同溫度下測定純化幾丁質(zhì)脫乙酰酶活力，確定酶的最適合作用溫度，結(jié)果見圖12，酶的最適合作用溫度是30℃，在15℃和45℃仍保持40％以上相對酶活。4.3溫度對菌株mcda02幾丁質(zhì)脫乙酰酶穩(wěn)定性的影響將幾丁質(zhì)脫乙酰酶在ph7.0，0.05mol/l磷酸緩沖液中分別于不同溫度下分別保溫0h-2.5h，然后測定殘余酶活力，確定酶溫度穩(wěn)定性，結(jié)果見圖13，酶在4℃時最穩(wěn)定，30℃的半衰期為2.0h。4.4ph對菌株mcda02幾丁質(zhì)脫乙酰酶活性的影響配制不同ph的0.05mol/l緩沖液，磷酸緩沖液(ph5.0-ph8.0)，tris-hcl緩沖液(ph8.0-ph9.0),gly-naoh緩沖液(ph9.0-ph12.0)。在30℃于不同ph的緩沖液下以對硝基乙酰苯胺為底物測定酶的活力，結(jié)果見圖14，酶的最適ph為8.0，在ph7.0-ph10.0具有70％以上酶活性。4.5ph對菌株mcda02幾丁質(zhì)脫乙酰酶穩(wěn)定性的影響將酶在不同ph的緩沖液中分別于30℃保溫1h，然后在30℃于ph7.0的0.05mol/l磷酸緩沖液中測定殘余酶活力。結(jié)果見圖15，在ph為8.0時，酶的穩(wěn)定性最好，酶在ph7.0-ph10.0具有80％以上相對酶活，在酸性條件下，酶活性顯著降低。附圖說明圖1為菌株mcda02的革蘭氏染色圖(×1000)；圖2為菌株mcda02在初篩平板形成的變色圈圖；圖3為菌株mcda02系統(tǒng)進化樹；圖4為溫度對菌株mcda02生長的影響圖；●5℃，○15℃，▼25℃，■30℃，▼35℃，▲45℃圖5為ph對菌株mcda02生長的影響圖；圖6為nacl濃度對菌株mcda02生長的影響圖；圖7為發(fā)酵時間對菌株mcda02發(fā)酵產(chǎn)酶的影響圖；圖8為溫度對菌株mcda02發(fā)酵產(chǎn)酶的影響圖；圖9為培養(yǎng)基初始ph對菌株mcda02發(fā)酵產(chǎn)酶的影響圖；圖10為裝樣量對菌株mcda02發(fā)酵產(chǎn)酶的影響圖；圖11為粉末幾丁質(zhì)添加量對菌株mcda02發(fā)酵產(chǎn)酶的影響；圖12為溫度對菌株mcda02幾丁質(zhì)脫乙酰酶活性的影響；圖13為溫度對菌株mcda02幾丁質(zhì)脫乙酰酶穩(wěn)定性的影響；●4℃，○15℃，▲25℃，▼30℃圖14為ph對菌株mcda02幾丁質(zhì)脫乙酰酶活性的影響；▲ph5.0-ph8.0，●ph8.0-ph9.0，○ph9.0-ph12.0圖15為ph對菌株mcda02幾丁質(zhì)脫乙酰酶穩(wěn)定性的影響。▲ph5.0-ph8.0，●ph8.0-ph9.0，○ph9.0-ph12.0。具體實施方式以下進一步描述本發(fā)明的具體技術(shù)方案，以便于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進一步地理解本發(fā)明，而不構(gòu)成對其權(quán)利的限制。實施例1，一種來自海洋的解角質(zhì)素微桿菌mcda02(microbacteriumkeratanolyticum)cgmccno.13539。該菌株具有以下特征：該菌株為革蘭氏陰性短桿菌，無芽孢。該菌株在2216e固體培養(yǎng)上培養(yǎng)48h后：黃色，半透明，表面光滑濕潤，圓形，邊緣齊整，中心稍突起，易挑取。在含有膠體幾丁質(zhì)和對硝基-n-乙酰苯胺的篩選培養(yǎng)基上能夠產(chǎn)生黃色變色圈。該菌株淀粉水解、吲哚試驗、硫化氫產(chǎn)生、精氨酸脫羧酶試驗均呈陽性，檸檬酸鹽利用、接觸酶、明膠液化、vp試驗、甲基紅、葡萄糖發(fā)酵、硝酸鹽還原試驗均為陰性。該菌株在低于5℃和高于45℃生長緩慢，最適生長溫度為30℃。生長的ph適宜范圍為6.0-10.0，最適生長ph為8.0；在nacl濃度為0％-10％時可以生長，最適生長的nacl濃度為3％。實施例2，一種如實施例1所述的解角質(zhì)素微桿菌mcda02發(fā)酵產(chǎn)生幾丁質(zhì)脫乙酰酶的方法，其步驟如下：將2216e斜面保存的菌株mcda02接種到種子培養(yǎng)基中，裝液量20％、轉(zhuǎn)速180r/min、30℃培養(yǎng)24h，得種子液；將種子液以1％的接種量接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，裝液量20％、轉(zhuǎn)速180r/min、30℃培養(yǎng)48h，10000r/min離心10min，取上清液即為幾丁質(zhì)脫乙酰酶粗酶。所述種子培養(yǎng)基為：酵母粉0.1％，蛋白胨0.5％，nacl1％，陳海水配制，ph7.0；發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米漿0.5％，可溶性淀粉0.3％，nh4so40.3％，kh2po40.15％，mgso40.05％，粉末幾丁質(zhì)1％，陳海水配制，ph8.0。當(dāng)前第1頁12