本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種eb病毒感染淋巴細(xì)胞亞群的鑒定方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

eb病毒(epstein-barrvirus,ebv)屬于人類皰疹病毒第四型，于1964年由epstein和barr在研究非洲兒童惡性淋巴瘤時(shí)發(fā)現(xiàn)。eb病毒是一種嗜淋巴細(xì)胞病毒，是人類普遍感染的病毒之一，感染全球超過90％的人群。eb病毒因兼具較高感染率和致癌率，已于1997年被國(guó)際癌癥研究中心定為i類致癌物。

目前，已存在一些eb病毒的檢測(cè)試劑盒，但其檢測(cè)的多是全血的eb病毒感染情況，不具有針對(duì)性。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種eb病毒感染淋巴細(xì)胞亞群的鑒定方法，本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供eb病毒感染淋巴細(xì)胞亞群的鑒定方法的應(yīng)用，以緩解現(xiàn)有技術(shù)中存在的eb病毒檢測(cè)針對(duì)性差的技術(shù)問題。

本發(fā)明提供了一種eb病毒感染淋巴細(xì)胞亞群的鑒定方法，所述鑒定方法包括以下步驟：

步驟(a)，提取人外周血單個(gè)核細(xì)胞；

步驟(b)，對(duì)所述人外周血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行分選，分別得到不同亞群分型的淋巴細(xì)胞；

步驟(c)，用流式細(xì)胞儀驗(yàn)證分選得到的所述不同亞群分型的淋巴細(xì)胞的純度；

步驟(d)，分別提取所述不同亞群分型的淋巴細(xì)胞的dna，并應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)測(cè)定所述不同亞群分型的淋巴細(xì)胞中eb病毒dna的含量。

進(jìn)一步的，所述不同亞群分型的淋巴細(xì)胞包括：cd3⁺t淋巴細(xì)胞、cd4⁺t淋巴細(xì)胞、cd8⁺t淋巴細(xì)胞、cd19⁺b淋巴細(xì)胞以及cd56⁺nk細(xì)胞。

進(jìn)一步的，步驟(b)中，所述分選包括基于磁珠的分選。

進(jìn)一步的，步驟(b)中，所述分選包括基于流式細(xì)胞儀的分選。

進(jìn)一步的，所述基于磁珠的分選包括：將所述外周血單個(gè)核細(xì)胞按照1:1:1:2:2的比例分為五份，分別加入能夠與cd3⁺t淋巴細(xì)胞、能夠與cd4⁺t淋巴細(xì)胞、能夠與cd8⁺t淋巴細(xì)胞、能夠與cd19⁺b淋巴細(xì)胞以及能夠與cd56⁺nk細(xì)胞特異性結(jié)合的磁珠，然后分別利用磁力架進(jìn)行分選。

進(jìn)一步的，所述基于流式細(xì)胞儀的分選包括：在所述外周血單個(gè)核細(xì)胞中加入抗cd3抗體、抗cd4抗體、抗cd8抗體、抗cd19抗體以及抗cd56抗體，孵育后過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選。

進(jìn)一步的，步驟(c)中，所述純度合格的標(biāo)準(zhǔn)為90％以上。

另外，本發(fā)明還提供了鑒定方法在確定eb病毒感染疾病的治療靶點(diǎn)中的應(yīng)用。

另外，本發(fā)明還提供了鑒定方法在指導(dǎo)制備治療eb病毒感染疾病的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的eb病毒感染淋巴細(xì)胞亞群的鑒定方法，通過分選ebv感染患者外周血的單核細(xì)胞，聯(lián)合流式細(xì)胞技術(shù)及實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)，可以準(zhǔn)確定位ebv感染的細(xì)胞類型，有助于臨床醫(yī)生針對(duì)ebv感染的細(xì)胞類型制定治療方案，對(duì)ebv感染造成的疾病進(jìn)行高效、準(zhǔn)確的治療；另外，應(yīng)用本發(fā)明提供的鑒定方法，可以確定ebv感染的靶細(xì)胞，能夠指導(dǎo)相關(guān)治療藥物的制備，有針對(duì)性的制備靶向藥物。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實(shí)施方式，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中cd3⁺t淋巴細(xì)胞的純度驗(yàn)證結(jié)果圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中cd3⁺t淋巴細(xì)胞的純度驗(yàn)證結(jié)果圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中cd4⁺t淋巴細(xì)胞的純度驗(yàn)證結(jié)果圖；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例1中cd4⁺t淋巴細(xì)胞的純度驗(yàn)證結(jié)果圖；

圖5為本發(fā)明實(shí)施例1中cd8⁺t淋巴細(xì)胞的純度驗(yàn)證結(jié)果圖；

圖6為本發(fā)明實(shí)施例1中cd8⁺t淋巴細(xì)胞的純度驗(yàn)證結(jié)果圖；

圖7為本發(fā)明實(shí)施例1中cd19⁺b淋巴細(xì)胞的純度驗(yàn)證結(jié)果圖；

圖8為本發(fā)明實(shí)施例1中cd19⁺b淋巴細(xì)胞的純度驗(yàn)證結(jié)果圖；

圖9為本發(fā)明實(shí)施例1中cd56⁺nk細(xì)胞的純度驗(yàn)證結(jié)果圖；

圖10為本發(fā)明實(shí)施例1中cd56⁺nk細(xì)胞的純度驗(yàn)證結(jié)果圖；

圖11為本發(fā)明實(shí)施例1中ebv-dna標(biāo)準(zhǔn)樣品的qrt-pcr結(jié)果圖；

圖12為本發(fā)明實(shí)施例1中ebv-dna標(biāo)準(zhǔn)樣品qrt-pcr的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖13為本發(fā)明實(shí)施例1中cd56⁺nk細(xì)胞樣品的qrt-pcr結(jié)果圖；

圖14為本發(fā)明實(shí)施例1中內(nèi)參gapdh的qrt-pcr結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

現(xiàn)今檢測(cè)ebv感染的方案，大多數(shù)只是提取全血的ebv-dna做qpcr，來檢測(cè)患者是否感染ebv及監(jiān)測(cè)ebv在全血中拷貝數(shù)的變化，臨床醫(yī)生依據(jù)這種方案所得的結(jié)果對(duì)患者進(jìn)行治療時(shí)，往往缺乏針對(duì)性，治療效果較差。

發(fā)明人創(chuàng)造性的發(fā)現(xiàn)了這一問題，并針對(duì)這一問題，研究出了解決的方案。

針對(duì)上述技術(shù)問題，發(fā)明人首先對(duì)外周血細(xì)胞進(jìn)行分選，再通過流式細(xì)胞儀驗(yàn)證分選的純度，然后分別提取dna后再聯(lián)合qpcr方法，不僅可以確定ebv感染的細(xì)胞類型，同時(shí)還可以定量檢測(cè)感染細(xì)胞內(nèi)的ebv-dna的拷貝數(shù)。有助于臨床醫(yī)生針對(duì)ebv感染的細(xì)胞類型制定有針對(duì)性的治療方案。

例如，當(dāng)應(yīng)用本發(fā)明提供的方法鑒定出ebv感染的細(xì)胞為cd19⁺b淋巴細(xì)胞時(shí)，可以使用利妥昔單抗快速、有針對(duì)性的清除受感染的細(xì)胞(cd19⁺b淋巴細(xì)胞的表面同時(shí)會(huì)表達(dá)cd20，利妥昔單抗為抗cd20的抗體，因此，利妥昔單抗同樣能夠清除cd19⁺b淋巴細(xì)胞)。

另外，需要說明的是，根據(jù)本發(fā)明提供的eb病毒感染淋巴細(xì)胞亞群的鑒定方法，并不能直接判定待測(cè)患者是否患有疾病，其結(jié)果僅能說明該名患者攜帶有eb病毒，而攜帶eb病毒并不一定患有疾病。例如，有些患者可能終生攜帶eb病毒，但不會(huì)患病。

另外，本發(fā)明提供的方案中，步驟(c)中，純度合格的標(biāo)準(zhǔn)為90％以上，表示：當(dāng)分選后的細(xì)胞純度為90％以上(包括90％)時(shí)，針對(duì)該細(xì)胞進(jìn)行的qrt-pcr驗(yàn)證有無ebv感染的結(jié)果可信；當(dāng)純度低于90％(不包括90％)時(shí)，qrt-pcr的結(jié)果不完全可信。例如，分選后cd3⁺t淋巴細(xì)胞的純度為93％，若進(jìn)行qrt-pcr檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)其ebv-dna陽性，則表明cd3⁺t淋巴細(xì)胞受到了ebv感染；若分選后cd3⁺t淋巴細(xì)胞的純度為65％，進(jìn)行qrt-pcr檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)其ebv-dna陽性，則不一定表明是cd3⁺t淋巴細(xì)胞受到了ebv感染，也有可能是雜細(xì)胞受到了ebv感染，該qrt-pcr檢測(cè)結(jié)果不可信。

如無特別說明，本發(fā)明中涉及的ebv為(epsteinbarrvirus,ebv)，涉及的eb為(epsteinbarr,eb)。

為了有助于更清楚的理解本發(fā)明的技術(shù)方案，現(xiàn)通過具體的實(shí)施例，詳細(xì)介紹如下。如未特別說明，以下實(shí)施例中涉及的試劑為常規(guī)市售試劑，涉及的儀器為常規(guī)儀器。另外，以下實(shí)施例中使用的試劑不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1

本實(shí)施例提供了基于磁珠的eb病毒感染淋巴細(xì)胞亞群的鑒定方法，包括以下步驟：

1、提取人外周血單個(gè)核細(xì)胞(hpbmc)：空腹靜脈血6ml，置于edta抗凝的無菌試管中，用pbs稀釋1倍后用淋巴細(xì)胞分離液分離pbmc(2000轉(zhuǎn)20分鐘)，利用離心時(shí)間配好緩沖液(macsbsastocksolution(#130-091-376)和automacsrinsingsolution(#130-091-222)1：20的比例配比)，放在4度冰箱降溫；

2、吸取中間白膜層，加入10mlpbs，1400rpm，10min洗滌并沉淀pbmc；

3、棄上清，加入2ml紅細(xì)胞裂解液(索萊寶紅細(xì)胞裂解液貨號(hào)：cat#r1010)裂解，混勻，室溫下孵育5分鐘；

4、充分混勻后，吸取20μl細(xì)胞用2％的冰醋酸按1：3稀釋后，用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行第一次讀數(shù)，并記錄讀數(shù)；

5、加滿pbs，1400rpm離心10min；

6、棄上清，加入磁珠分選緩沖液2ml，1400rpm離心10min；

7、根據(jù)第一次計(jì)數(shù)情況及患者淋巴細(xì)胞亞群比例，合理分配細(xì)胞比例，一般為cd3:cd4:cd8:cd19:cd56細(xì)胞比例為1:1:1:2:2；

其中，每種細(xì)胞對(duì)應(yīng)的緩沖液最終體積為80μl，一般最大比例的細(xì)胞的最終體積為80μl，其余相應(yīng)減少，吸出細(xì)胞后再用緩沖液補(bǔ)足80μl；例如上述cd3:cd4:cd8:cd19:cd56細(xì)胞比例為1:1:1:2:2，則相應(yīng)的體積比為40μl:40μl:40μl:80μl:80μl；首先向步驟6中離心后的菌體中加入280μl緩沖液，充分混勻，然后分別吸取40μl細(xì)胞到用記號(hào)筆標(biāo)記好cd3或者cd4或者cd8的ep管中，每管分別加入40μl緩沖液，補(bǔ)足80μl的體積；吸取80μl細(xì)胞到用記號(hào)筆標(biāo)記好cd19或者cd56的ep管中；

8、若分為5份后每份細(xì)胞數(shù)均少于10⁷個(gè)細(xì)胞，則分別加入20μl相應(yīng)的磁珠(即能夠特異性篩選cd3⁺t淋巴細(xì)胞、cd4⁺t淋巴細(xì)胞、cd8⁺t淋巴細(xì)胞、cd19⁺b淋巴細(xì)胞或者cd56⁺nk細(xì)胞的磁珠)，混勻(若大于則每增加1×10⁷個(gè)細(xì)胞，則磁珠加倍，不足1×10⁷按1×10⁷計(jì)算)；

9、4度冰箱孵育15分鐘，加入1ml緩沖液1400rpm離心10min洗滌一遍，棄上清；

10、加入500μl緩沖液，用0.45μm濾網(wǎng)過濾各待分選細(xì)胞；

11、潤(rùn)柱，將分離柱取出，加入500μl的緩沖液，讓其自然流凈后再加入過濾后的細(xì)胞，自然滴下液體，并用500μl緩沖液洗滌三次；

12、將分離柱拿離分離架，吸取1ml緩沖液，將1ml緩沖液注入分離柱中，用活塞快速?zèng)_洗分離柱中的細(xì)胞到1.5ml的ep管中；

13、依次按步驟11、12分離已加入cd3，cd4，cd8，cd19，cd56磁珠的細(xì)胞，每個(gè)分離柱只能用一次，即得到cd3⁺t淋巴細(xì)胞、cd4⁺t淋巴細(xì)胞、cd8⁺t淋巴細(xì)胞、cd19⁺b淋巴細(xì)胞以及cd56⁺nk細(xì)胞；

14、充分混勻，吸取20μl計(jì)數(shù)并記錄；

15、吸取分離的細(xì)胞100μl，并分別標(biāo)記cd3⁺，cd4⁺，cd8⁺，cd19⁺，cd56⁺的細(xì)胞，然后分別加入anti-humancd3-fitc10μl，anti-humancd56-apc5μl，anti-humancd8-percp5μl到上述cd3⁺，cd4⁺，cd8⁺，cd19⁺，cd56⁺的細(xì)胞中，室溫避光孵育20分鐘；

16、加入1mlpbs1400rpm離心5min洗滌細(xì)胞一遍；

17、棄上清，加入100μlpbs混勻，上流式細(xì)胞儀驗(yàn)證分選的純度，結(jié)果如圖1至圖10所示；

其中，圖1和圖2為cd3⁺t淋巴細(xì)胞的純度驗(yàn)證結(jié)果圖，結(jié)果顯示，cd3⁺t淋巴細(xì)胞的分選純度為94.01％，其中混有0.36％的nk細(xì)胞以及1.39％的nkt細(xì)胞；

圖3和圖4為cd4⁺t淋巴細(xì)胞的純度驗(yàn)證結(jié)果圖，結(jié)果顯示，cd4⁺t淋巴細(xì)胞的分選純度為98.45％，其中混有0.34％的cd8⁺t淋巴細(xì)胞，0.02％的nk細(xì)胞，以及0.22％的nkt細(xì)胞；

圖5和圖6為cd8⁺t淋巴細(xì)胞的純度驗(yàn)證結(jié)果圖，結(jié)果顯示，cd8⁺t淋巴細(xì)胞的分選純度為96.48％，其中混有0.15％的nk細(xì)胞；

圖7和圖8為cd19⁺b淋巴細(xì)胞的純度驗(yàn)證結(jié)果圖，結(jié)果顯示，cd19⁺b淋巴細(xì)胞中混有1.01％的cd8⁺t淋巴細(xì)胞，2.47％的cd4⁺t淋巴細(xì)胞，0.51％的nk細(xì)胞，以及0.45％的nkt細(xì)胞；

圖9和圖10為cd56⁺nk細(xì)胞的純度驗(yàn)證結(jié)果圖，結(jié)果顯示，cd56⁺nk細(xì)胞的分選純度為83.26％，其中混有13.73％的nkt細(xì)胞；

18、將剩余的900μl細(xì)胞1400rpm離心10min，棄上清，然后用dna提取試劑分別提取各細(xì)胞的dna，最后溶于100μl的te中；

19、測(cè)dna濃度，三次，取其平均值；

20、根據(jù)測(cè)量的dna濃度用滅菌注射水稀釋1μldna含量為10ng；

21、用達(dá)安ebv檢測(cè)試劑盒及7500fast實(shí)時(shí)定量熒光pcr儀測(cè)量各分選后的細(xì)胞在10ngdna量處的ebv-dna拷貝數(shù)，找出ebv感染的細(xì)胞，并根據(jù)其拷貝數(shù)計(jì)算每10⁶細(xì)胞的ebv的拷貝數(shù)；

首先，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，分選后的cd3⁺t淋巴細(xì)胞、cd4⁺t淋巴細(xì)胞、cd8⁺t淋巴細(xì)胞以及cd19⁺b淋巴細(xì)胞的的ebv-dna檢測(cè)結(jié)果為陰性，cd56⁺nk細(xì)胞的ebv-dna檢測(cè)結(jié)果為陽性；

然后，對(duì)cd56⁺nk細(xì)胞中ebv病毒的拷貝數(shù)進(jìn)行測(cè)定；ebv-dna標(biāo)準(zhǔn)樣品的qrt-pcr結(jié)果如圖11所示，對(duì)其進(jìn)行處理得到圖12所示的標(biāo)準(zhǔn)曲線；其中圖12的橫坐標(biāo)表示ebv-dna的標(biāo)準(zhǔn)濃度，縱坐標(biāo)表示ct值；

cd56⁺nk細(xì)胞樣品的qrt-pcr結(jié)果圖如圖13所示(圖14所示為內(nèi)參gapdh的qrt-pcr結(jié)果圖)，結(jié)合圖12的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到，cd56⁺nk細(xì)胞中ebv的拷貝數(shù)為2.26×10⁷拷貝/10⁶個(gè)細(xì)胞；

因此，按照本實(shí)施例提供的方法，不僅可以確定是否感染了ebv，還可以準(zhǔn)確的判斷ebv感染的細(xì)胞，以及感染的ebv的拷貝數(shù)。

另外，需要注意的是，當(dāng)分選后出現(xiàn)多個(gè)細(xì)胞陽性時(shí)，應(yīng)聯(lián)合考慮磁珠分選結(jié)果，排除是由分選純度不夠高，由ebv陽性的細(xì)胞摻雜進(jìn)入ebv陰性的細(xì)胞里所造成，因此流式驗(yàn)證分選后細(xì)胞純度不可缺少，對(duì)結(jié)果的分析極為重要。

例如假設(shè)cd56⁺nk細(xì)胞的分選結(jié)果純度不夠，有70.74％的cd3⁺t淋巴細(xì)胞，若qrt-pcr結(jié)果顯示cd3⁺t淋巴細(xì)胞呈ebv陽性，則就造成分選后cd56⁺nk細(xì)胞ebv也為陽性的結(jié)果，在判讀結(jié)果時(shí)，就不可以說是該患者cd3⁺t淋巴細(xì)胞和cd56⁺nk細(xì)胞都存在ebv感染，應(yīng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行結(jié)合考慮。即，實(shí)時(shí)定量pcr的結(jié)果中多種淋巴為ebv陽性時(shí)，需要結(jié)合分選后分選的純度綜合考慮分析結(jié)果。

實(shí)施例2

本實(shí)施例提供了基于流式細(xì)胞儀的eb病毒感染淋巴細(xì)胞亞群的鑒定方法，包括以下步驟：

1、取外周血6ml，肝素抗凝，用pbs稀釋成12ml，混勻；

2、將稀釋后血液沿試管壁徐徐加入15ml淋巴細(xì)胞分離液的液面之上，勿用力過大，以免造成血液與分離液混合，保持清晰的分層狀態(tài)；

3、18-20℃溫度下2000rpm離心20min，離心后可見試管內(nèi)的血液清楚的分為4層，上層為血漿層，中層為分離液層(單個(gè)核細(xì)胞所處于血漿層和分離液層中間)，底層為紅細(xì)胞層，紅細(xì)胞層上為粒細(xì)胞層；

4、用吸管將上層與中層之間的淋巴細(xì)胞層吸出收集到另一試管中，用pbs洗滌1遍，1400prm離心10min；

5、棄上清，加入2ml紅細(xì)胞裂解液裂解，混勻，室溫下孵育5分鐘；

6、加滿pbs，1400rpm離心10min洗滌一遍；

7、棄上清，加入流式分選緩沖液(含2％fbs的pbs溶液)2ml，1400rpm離心10min；

8、加入抗cd3抗體，抗cd4抗體，抗cd8抗體，抗cd19抗體，抗cd56抗體，孵育20分鐘；

9、加入2mlpbs，1400rpm離心5min洗滌細(xì)胞一遍，用分選buffer稀釋細(xì)胞濃度為5×10⁶個(gè)/ml，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選，即得到cd3⁺t淋巴細(xì)胞、cd4⁺t淋巴細(xì)胞、cd8⁺t淋巴細(xì)胞、cd19⁺b淋巴細(xì)胞以及cd56⁺nk細(xì)胞，收集分選出的目的細(xì)胞，bdfacsaria分選出的目的細(xì)胞密度為5×10⁵個(gè)/ml；

10、吸取分離的細(xì)胞100μl，并分別標(biāo)記cd3⁺，cd4⁺，cd8⁺，cd19⁺，cd56⁺的細(xì)胞，然后分別加入anti-humancd3-fitc10μl，anti-humancd56-apc5μl，anti-humancd8-percp5μl到上述cd3⁺，cd4⁺，cd8⁺，cd19⁺，cd56⁺的細(xì)胞中，室溫避光孵育20分鐘；

11、加入1mlpbs1400rpm離心5min洗滌細(xì)胞一遍；

12、棄上清，加入100μlpbs混勻，上流式細(xì)胞儀驗(yàn)證分選的純度；

13、將剩余的細(xì)胞1400rpm離心10min，棄上清，然后用dna提取試劑分別提取各細(xì)胞的dna，最后溶于100μl的te中；

14、測(cè)dna濃度，三次，取其平均值；

15、根據(jù)測(cè)量的dna濃度用滅菌注射水稀釋1μldna含量為10ng；

16、用達(dá)安ebv檢測(cè)試劑盒及7500fast實(shí)時(shí)定量熒光pcr儀測(cè)量各分選后的細(xì)胞在10ngdna量處的ebv-dna拷貝數(shù)，找出ebv感染的細(xì)胞，并根據(jù)其拷貝數(shù)計(jì)算每10⁶細(xì)胞的ebv的拷貝數(shù)；

最后應(yīng)說明的是：以上各實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其限制；盡管參照前述各實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的范圍。