本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，即：通過敲除克雷伯氏肺炎桿菌中編碼甲酸脫氫酶和丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的基因，同時(shí)生產(chǎn)1，3-丙二醇和乙偶姻。

背景技術(shù)：

隨著化石燃料的日益枯竭，可再生新能源引起了越來越多的關(guān)注，其中生物柴油因具有可循環(huán)性，可降解性及清潔無污染的優(yōu)勢(shì)進(jìn)而日益引起關(guān)注。生物柴油主要來自于動(dòng)植物油脂，通過酯交換或熱化學(xué)工藝制成制備。所以在生物柴油的生產(chǎn)過程中，會(huì)產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物甘油，產(chǎn)量約占生物柴油總產(chǎn)量的10％，因此需要有效的方法利用好這些富余甘油。目前，在甘油的利用的方法中，考慮最廣泛的就是以甘油為碳源，采用微生物代謝生產(chǎn)高附加值的化合物。其中以克雷伯氏肺炎桿菌(klebsielapneumoniae)利用甘油生產(chǎn)一些大宗化學(xué)品，如1，3-丙二醇(1，3-propanediol，1，3-pd)等備受關(guān)注。

1，3-pd是一種重要的平臺(tái)化合物，有多種用途：如1，3-pd可作為單體合成新型聚醋——聚對(duì)苯二甲酸丙二醇醋(ptt)。研究表明k.pneumoniae利用甘油生產(chǎn)1，3-pd時(shí)，主要副產(chǎn)物為2，3-丁二醇。由于2，3-丁二醇的沸點(diǎn)與1,3-pd相近，因而給后續(xù)1,3-pd的精制分離過程造成了很大的困難。

在k.pneumoniae中2，3-丁二醇合成來自于乙偶姻(acetoin，ac)。事實(shí)上，同1，3-pd一樣，ac也是一種重要的平臺(tái)化合物，此外ac的沸點(diǎn)要比1，3-pd低得多，因而利用k.pneumoniae共發(fā)酵生產(chǎn)1，3-pd與ac顯然是一種更經(jīng)濟(jì)的甘油利用方法。但是在k.pneumoniae中ac一般不積累，而是合成了副產(chǎn)物2，3-丁二醇。本發(fā)明公開了一種k.pneumoniae利用甘油同時(shí)生產(chǎn)1，3-pd和ac的方法。該方法通過敲除克雷伯氏桿菌中編碼甲酸脫氫酶和丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的基因，阻斷副產(chǎn)物2，3-丁二醇的合成，同現(xiàn)有技術(shù)相比不但能同時(shí)生產(chǎn)兩種高附加值產(chǎn)品，也顯著改善了產(chǎn)品分離精制的效率。

在k.pneumoniae中參與轉(zhuǎn)化ac合成2，3-丁二醇的酶有多種，如2，3-丁二醇脫氫酶、甘油脫氫酶等，有些酶還是微生物利用甘油生物合成1，3-pd的關(guān)鍵酶，所以1，3-pd的生物合成總是伴隨著副產(chǎn)物2，3-丁二醇的合成。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，在敲除克雷伯氏肺炎桿菌編碼丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(pyruvatedehydrogenasecomplex，pdhc)的基因后，顯著抑制了菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物1，3-pd的合成，副產(chǎn)物2，3-bd幾乎不積累；在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步敲除編碼一種甲酸脫氫酶(formatedehydrogenase-n，也稱fdnghi、fdh-n)的基因后，菌體生長(zhǎng)恢復(fù)，1，3-pd的生物合成也大部分恢復(fù)，但是ac大量積累，2，3-bd同樣沒有積累，達(dá)到了利用甘油同時(shí)生產(chǎn)1，3-pd與ac的目的。經(jīng)過檢索國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局(www.sipo.gov.cn)、世界產(chǎn)權(quán)組織(www.wipo.int)、歐洲專利局(www.espacenet.com)和美國(guó)專利商標(biāo)局(www.uspto.gov)也沒有發(fā)現(xiàn)與本專利保護(hù)請(qǐng)求相同的公開專利或授權(quán)專利。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本申請(qǐng)的發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，敲除k.pneumoniae編碼pdhc和fdnghi的基因后，重組菌能利用甘油同時(shí)生產(chǎn)1,3-pd和ac。所以，本發(fā)明目的在于提供一種更有效的利用甘油方法，即：將k.pneumoniae中編碼pdhc和fdnghi的基因敲除，利用甘油同時(shí)生產(chǎn)高附加值的1，3-pd和ac。與現(xiàn)有的技術(shù)相比，利用本發(fā)明生物轉(zhuǎn)化甘油時(shí)，不但能同時(shí)生產(chǎn)兩種高附加值產(chǎn)品，也顯著改善了產(chǎn)品分離精制的效率。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：將克雷伯氏肺炎桿菌的編碼pdhc和fdnghi的基因敲除，同時(shí)生產(chǎn)生產(chǎn)1，3-pd和ac。本發(fā)明包括種子培養(yǎng)以及發(fā)酵罐發(fā)酵轉(zhuǎn)化甘油生成1，3-pd和ac。

根據(jù)本發(fā)明，所述編碼丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(pyruvatedehydrogenasecomplex，ec1.2.4.1)的基因?yàn)椋篴cee,acef和lpda三個(gè)基因。這三個(gè)基因在基因組上成簇排列，分別負(fù)責(zé)編碼丙酮酸脫氫酶復(fù)合體組分e1、e2和e3。

根據(jù)本發(fā)明，所述編碼甲酸脫氫酶(formatedehydrogenase-n，ec1.1.5.6)的基因?yàn)椋篺dng、fdnh和fdni三個(gè)基因。這三個(gè)基因在基因組上成簇排列，分別負(fù)責(zé)編碼甲酸脫氫酶的三個(gè)亞基。

根據(jù)本發(fā)明，用于轉(zhuǎn)化甘油生成1，3-pd和ac的菌株為克雷伯氏肺炎桿菌(k.pneumoniae)。相比現(xiàn)有的轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)1，3-pd的方法，本發(fā)明的方法的優(yōu)點(diǎn)是：同時(shí)生產(chǎn)兩種高附加值產(chǎn)品，且產(chǎn)品易于分離純化。

附圖說明

圖1：1，3-丙二醇、乙偶姻，1，3-丙二醇、2，3-丁二醇?xì)庀嗌V圖

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而非用于限定本發(fā)明的范圍。

實(shí)例中，斜面培養(yǎng)基的配方為：k2hpo43h2o7g/l，(nh4)2so41g/l，kh2po42g/l，mgcl27h2o0.1g/l，酵母膏7g/l，微量元素各0.3ml，調(diào)整ph7.0，瓊脂2g/l。

種子培養(yǎng)基的配方為：k2hpo43h2o7g/l，(nh4)2so41g/l，kh2po42g/l，mgcl27h2o0.1g/l，酵母膏7g/l，微量元素各0.3ml，調(diào)整ph7.0后加入nacl調(diào)節(jié)滲透壓。

發(fā)酵罐培養(yǎng)基的配方為：kcl0.75g/l，nah2po41.38g/l，(nh4)2so45.35g/l，na2so40.28g/l，mgso46h2o0.26g/l，檸檬酸0.42g/l，酵母粉2g/l，微量元素各0.3ml，調(diào)整ph7.0。

微量元素的配方為：zncl234.2g/l，fecl36h2o2.7g/l，mncl24h2o10g/l，cucl22h2o0.85g/l，cocl22h2o23.8g/l，h3bo30.31g/l，na2moo40.25g/l。

發(fā)酵實(shí)驗(yàn)具體為：將菌株接入250ml的搖瓶(裝液量50ml)進(jìn)行種子培養(yǎng)20小時(shí)，后接入5l發(fā)酵罐中(發(fā)酵液裝液量2l)，按照后續(xù)所示的工藝條件控制發(fā)酵過程。初始甘油濃度60g/l，發(fā)酵溫度35℃；通氣量1.0vvm；攪拌轉(zhuǎn)速20rpm；在發(fā)酵過程中通過加入naoh溶液控制ph值為5.5～7.5。在發(fā)酵的各個(gè)時(shí)期通過補(bǔ)入不同濃度甘油溶液控制甘油濃度在10～60g/l，發(fā)酵24小時(shí)結(jié)束。

實(shí)施例中，測(cè)定發(fā)酵液中菌體干重的方法為：取1.0ml發(fā)酵液稀釋7￣10倍，以去離子水為對(duì)照，在721分光光度計(jì)上于620nm讀取od。取不同菌濃(即不同620nm吸光值)的菌液10ml，經(jīng)離心收集菌體，并用去離子水洗滌二遍洗滌，將再次離心收集后的菌體于80℃烘箱中干燥至恒重。稱量菌體作出菌體干重與od620的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并回歸出關(guān)系式。以后菌體的干重根據(jù)測(cè)定的菌液的od620值由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸關(guān)系式計(jì)算得出。發(fā)酵液中1，3-pd、2，3-丁二醇和ac的測(cè)定采用氣相色譜法。

產(chǎn)1，3-pd的菌株采用克雷伯氏肺炎桿菌cctccm2014574，以下簡(jiǎn)稱m2014574。

實(shí)施例1、敲除編碼pdhc和fdnghi的基因后形成，重組菌體利用甘油同時(shí)合成了1，3-pd和ac

將m2014574菌株于lb培養(yǎng)基(0.5％酵母提取物，1％胰蛋白胨，1％nacl，ph7.0)中37℃培養(yǎng)過夜，抽提基因組。以抽提好的m2014574基因組為模板，依據(jù)ncbi登錄的克雷伯氏肺炎桿菌mgh78578的基因組序列(locus：nc＿009648)上：acee基因(locus＿tag：kpn＿00118)的上游與lpda基因(locus＿tag：kpn＿00120)的下游設(shè)計(jì)引物。pcr反應(yīng)結(jié)束后膠回收目的條帶并測(cè)序，測(cè)序后對(duì)目的條帶進(jìn)行基因分析，與mgh78578上對(duì)應(yīng)的片段基因的相似度為99％。用同源重組辦法，敲除m2014574基因組的acee-acef-lpda三個(gè)連續(xù)的基因(7208bp)，獲得的重組菌為m2014574△pdhc。

同樣以抽提好的m2014574基因組為模板，依據(jù)ncbi登錄的克雷伯氏肺炎桿菌mgh78578的基因組序列(locus：nc＿009648)上：fdng基因(locus＿tag：kpn＿01867)的上游與fdni基因(locus＿tag：kpn＿01865)的下游設(shè)計(jì)引物。pcr反應(yīng)結(jié)束后膠回收目的條帶并測(cè)序，測(cè)序后對(duì)目的條帶進(jìn)行基因分析，與mgh78578上對(duì)應(yīng)的片段基因的相似度為99％。用同源重組辦法，敲除m2014574基因組的fdng-fdnh-fdni三個(gè)連續(xù)的基因(3957bp)，獲得的重組菌為m2014574△fdnghi。用同源重組辦法，敲除m2014574△pdhc基因組的fdng-fdnh-fdni三個(gè)連續(xù)的基因(3957bp)，獲得的重組菌為m2014574△pdhc△fdnghi。

將m2014574與m2014574△pdhc△fdnghi分別接種于250ml的三角瓶中進(jìn)行種子培養(yǎng)，于5l的發(fā)酵罐上發(fā)酵24小時(shí)，結(jié)果如表1所。從表1中可以看出m2014574原來主要產(chǎn)物是1，3-pd和副產(chǎn)物2，3-丁二醇，而敲除編碼pdhc和fdnghi的基因的菌株m2014574△pdhc△fdnghi生產(chǎn)不受影響，但是產(chǎn)物發(fā)生了變化：不產(chǎn)2，3-丁二醇，發(fā)酵甘油生產(chǎn)兩種高附加值的平臺(tái)化合物1，3-pd和ac。m2014574△pdhc△fdnghi同出發(fā)菌株m2014574相比，雖然1，3-pd有所下降，但是下降不多，反之生產(chǎn)了40.21g/l的ac，提高了甘油發(fā)酵的綜合效益。

表1：同時(shí)敲除編碼pdhc和fdnghi的基因后的結(jié)果

實(shí)施例2、單獨(dú)敲除編碼pdhc或fdnghi的基因的菌株不能產(chǎn)生本發(fā)明的效果

以出發(fā)菌株m2014574構(gòu)建單獨(dú)敲除編碼pdhc或fdnghi的菌株，具體方法見實(shí)例1，單獨(dú)敲除編碼pdhc的基因的菌株為m2014574△pdhc，單獨(dú)敲除編碼fdnghi的基因的菌株為m2014574△fdnghi。

將m2014574、m2014574△pdhc和m2014574△fdnghi分別接種于250ml的三角瓶中進(jìn)行種子培養(yǎng)，于5l的發(fā)酵罐上發(fā)酵24小時(shí)，結(jié)果如表2所。從表2中可以看出，單獨(dú)敲除編碼pdhc的基因后，雖然不產(chǎn)生2，3-丁二醇，但是菌體生長(zhǎng)嚴(yán)重抑制，1，3-丙二醇顯著下降，ac也沒有生產(chǎn)。而單獨(dú)敲除編碼fdnghi的基因后，m2014574△fdnghi菌株的發(fā)酵特性幾乎和出發(fā)菌株一樣。所以只有同時(shí)敲除編碼pdhc和fdnghi的基因，才能實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的效果。

表2：?jiǎn)为?dú)敲除編碼pdhc和fdnghi的基因后的結(jié)果

實(shí)施例3、在克雷伯氏肺炎桿菌基因組中有三種甲酸脫氫酶，只有敲除其中特定的一種，也即編碼fdnghi的基因，才能起到本發(fā)明的效果。

在k.pneumoniae中存在三種甲酸脫脫氫酶(formatedehydrogenases，fdhs)，分別為：1)fdhf，也即fdh-h，由基因fdhf編碼；2)fdoghi，也即fdh-o，含三個(gè)亞基，分別由基因fdog、fdoh與fdoi編碼；3)fdnghi也即fdh-n，含三個(gè)亞基，分別由fdng、fdnh與fdni編碼。

以抽提好的m2014574基因組為模板，依據(jù)ncbi登錄的克雷伯氏肺炎桿菌mgh78578的基因組序列(locus：nc＿009648)上：fdhf基因(locus＿tag：kpn＿04482)的上游與下游設(shè)計(jì)引物。pcr反應(yīng)結(jié)束后膠回收目的條帶并測(cè)序，測(cè)序后對(duì)目的條帶進(jìn)行基因分析，與mgh78578上對(duì)應(yīng)的片段基因的相似度為99％。用同源重組辦法，敲除敲除m2014574△pdhc基因組的fdnf基因(1680bp)，獲得的重組菌為m2014574△pdhc△fdhf。

以抽提好的m2014574基因組為模板，依據(jù)ncbi登錄的克雷伯氏肺炎桿菌mgh78578的基因組序列(locus：nc＿009648)上：fdog基因(locus＿tag：kpn＿04190)的上游與fdoi基因(locus＿tag：kpn＿04188)的下游設(shè)計(jì)引物。pcr反應(yīng)結(jié)束后膠回收目的條帶并測(cè)序，測(cè)序后對(duì)目的條帶進(jìn)行基因分析，與mgh78578上對(duì)應(yīng)的片段基因的相似度為99％。用同源重組辦法，敲除m2014574△pdhc基因組的fdog-fdoh-fdoi三個(gè)連續(xù)的基因(3962bp)，獲得的重組菌為m2014574△pdhc△fdoghi。

重組菌m2014574△pdhc△fdnghi的獲取方法見實(shí)例1。

將m2014574、m2014574△pdhc△fdnghi、m2014574△pdhc△fdhf和m2014574△pdhc△fdoghi分別接種于250ml的三角瓶中進(jìn)行種子培養(yǎng)，于5l的發(fā)酵罐上發(fā)酵24小時(shí)，結(jié)果如表3所。從表3可以看出，在敲除編碼pdhc的基因后，敲除另外兩種編碼甲酸脫氫酶(fdhf和fdoghi)的基因，對(duì)發(fā)酵幾乎不產(chǎn)生影響，重組菌的發(fā)酵效果和單獨(dú)敲除pdhc基因的重組菌發(fā)酵特性相同。只有在敲除編碼pdhc的基因后進(jìn)一步敲除編碼特定的甲酸脫氫酶(fdnghi)的基因后，才會(huì)出現(xiàn)菌體生長(zhǎng)恢復(fù)，同時(shí)大量積累1，3-pd和ac的效果。

表3：在敲除pdhc后分別敲除三種甲酸脫氫酶基因的效果

實(shí)施例4、同時(shí)生產(chǎn)1，3-pd和ac，相比生產(chǎn)1，3-pd和2，3-丁二醇更利于產(chǎn)品的分離精制

目前后續(xù)產(chǎn)品的精制都是采用精餾工藝，物質(zhì)之間沸點(diǎn)的差異決定了精餾的成本的高低與高純度產(chǎn)品獲得的難易。1，3-pd、2，3-丁二醇與乙偶姻三個(gè)物質(zhì)的沸點(diǎn)分別為：214、180與148℃，因此同時(shí)生產(chǎn)1，3-pd與ac顯然要容易分離得多。

圖1為1，3-pd與ac，1，3-pd與2，3-丁二醇的氣相圖譜，可以形象的說明1，3-pd與ac的分離更容易。圖中的氣相色譜條件為：氣相色譜儀型號(hào)為上分gc112a，色譜柱是atse-54(30cm×0.53mm×1.0μm)的毛細(xì)管柱，使用的檢測(cè)器為fid氫火焰離子化檢測(cè)器，載氣為氮?dú)猓瑲庀嗌V設(shè)定溫度為：柱箱110℃，進(jìn)樣器250℃，檢測(cè)器250℃。