本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種檢測(cè)豬圓環(huán)病毒3型病毒的引物對(duì)、方法及試劑盒。

背景技術(shù)：

豬圓環(huán)病毒(procinecircovirus，pcv)是單股環(huán)狀dna病毒，基因組全長(zhǎng)1.7kb左右，屬于圓環(huán)病毒科，是最小的動(dòng)物dna病毒之一。目前已確定有兩種類型的豬圓環(huán)病毒，即豬圓環(huán)病毒1型(pcv1)和豬圓環(huán)病毒2型(pcv2)。pcv1對(duì)豬只沒(méi)有致病性，但pcv2能在臨床條件下能感染豬只并引起疾病。研究發(fā)現(xiàn)，豬圓環(huán)病毒主要引起仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、豬皮炎腎病綜合征、豬呼吸系統(tǒng)混合疾病、豬繁殖障礙癥、肉芽腫性腸炎、急性肺水腫、增生性壞死肺炎、仔豬先天性震顫等。最近，一種新型的豬圓環(huán)病毒3型病毒在美國(guó)首次報(bào)道，該病毒基因組全長(zhǎng)2.0kb，其基因編碼兩個(gè)主要蛋白：cap和rep，兩者在核酸鏈上處于相反方向，其能引起豬皮炎腎病綜合征、繁殖障礙、心臟和多系統(tǒng)炎癥等癥狀。

熒光定量pcr檢測(cè)技術(shù)融合了pcr技術(shù)的核酸高效擴(kuò)增、引物特異性高、光譜技術(shù)敏感性高和高精確定量的優(yōu)點(diǎn)，直接探測(cè)pcr過(guò)程中熒光信號(hào)的變化以獲得定量結(jié)果。sybrgreeni是一種能與雙鏈dna特異結(jié)合的一種染料，當(dāng)體系中模板被擴(kuò)增時(shí)，sybr可以有效結(jié)合到新合成的雙鏈上，隨著pcr的進(jìn)行，結(jié)合的sybr染料越來(lái)越多，被儀器檢測(cè)到的熒光信號(hào)越來(lái)越強(qiáng)，從而達(dá)到定量的目的。熒光定量pcr技術(shù)的出現(xiàn)，極大簡(jiǎn)化了定量檢測(cè)的過(guò)程，結(jié)果判斷更真實(shí)可靠，大大提高了工作效率。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種檢測(cè)豬圓環(huán)病毒3型病毒的引物對(duì)。

本發(fā)明的又一目的在于提供包含所述的檢測(cè)豬圓環(huán)病毒3型病毒的引物對(duì)的試劑盒。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種檢測(cè)豬圓環(huán)病毒3型病毒的方法。

本發(fā)明根據(jù)參考比對(duì)genbank中所有pcv3rep基因序列，選擇特定核苷酸序列作為擴(kuò)增區(qū)域，設(shè)計(jì)了一對(duì)用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒3型的sybrgreeni熒光定量rt-pcr引物。建立了特異、靈敏、穩(wěn)定、可靠的pcv3sybrgreenrt-qpcr檢測(cè)系統(tǒng)，操作簡(jiǎn)單可靠，有利于疾病的及時(shí)診斷治療。

本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種檢測(cè)豬圓環(huán)病毒3型病毒的引物對(duì)，由上游引物和下游引物組成，所述的上游引物的核苷酸序列如seqidno:1所示，所述的下游引物的核苷酸序列如seqidno:2所示。

一種檢測(cè)豬圓環(huán)病毒3型病毒的試劑盒，包括所述的檢測(cè)豬圓環(huán)病毒3型病毒的引物對(duì)。

所述的試劑盒還包括熒光染料、陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對(duì)照和pcr反應(yīng)液中的一種或至少兩種。

所述的熒光染料優(yōu)選為sybrgreeni；進(jìn)一步優(yōu)選為北京康潤(rùn)公司的realstargreenfastmixture(2×)。

所述的pcr反應(yīng)液，包括dna聚合酶、dntps、mg²⁺和穩(wěn)定劑等。

所述的陰性對(duì)照優(yōu)選為ddh2o。

所述的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法優(yōu)選為：從pcv3陽(yáng)性病料中提取dna，通過(guò)所述的檢測(cè)豬圓環(huán)病毒3型病毒的引物對(duì)進(jìn)行pcr得到擴(kuò)增產(chǎn)物，將得到的擴(kuò)增產(chǎn)物與載體連接構(gòu)建得到重組載體，所述的重組載體即為所述的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品。

所述的載體優(yōu)選為pmd19-t。

一種檢測(cè)豬圓環(huán)病毒3型病毒的方法，包括如下步驟：

(1)從待測(cè)樣品中提取dna；

(2)以步驟(1)得到的dna做為dna模板，用所述的檢測(cè)豬圓環(huán)病毒3型病毒的引物對(duì)或試劑盒進(jìn)行熒光定量pcr反應(yīng)；

(3)反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)熔解曲線和擴(kuò)增曲線cq值進(jìn)行結(jié)果判讀：熔解曲線為單一峰，熔解溫度在80.5～82.5℃之間，且擴(kuò)增曲線cq值在10.17～34.81之間判定為陽(yáng)性；熔解曲線非單一峰，或熔解曲線為單一峰但熔解溫度不在80.5～82.5℃范圍內(nèi)，判定為陰性。

所述的熒光定量pcr反應(yīng)的反應(yīng)體系優(yōu)選為20μl的反應(yīng)體系：包括realstargreenfastmixture(2×)10μl、0.8μl上游引物、0.8μl下游引物、dna模板1.0μl(即待測(cè)樣品)、ddh2o7.4μl。

所述的上游引物和下游引物的濃度優(yōu)選為10μm。

所述的上游引物和下游引物的配比優(yōu)選為1:1。

所述的熒光定量pcr反應(yīng)的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2min；95℃變性15s，56.4℃退火20s，72℃延伸30s，40個(gè)循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后先加熱至95℃反應(yīng)10s，然后再降至65℃，開始以0.5℃/s遞增至95℃檢測(cè)熒光信號(hào)得出擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線。

所述的引物對(duì)或試劑盒在豬圓環(huán)病毒3型病毒檢測(cè)領(lǐng)域中的應(yīng)用。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：

本發(fā)明設(shè)計(jì)并篩選得到一種豬圓環(huán)病毒3型實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)引物對(duì)，所述引物對(duì)的上游引物、下游引物的序列如seqidno：1～2所示；利用該引物可特異性擴(kuò)增出豬圓環(huán)病毒3型rep基因的部分保守序列，實(shí)時(shí)熒光定量可通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)pcr過(guò)程中雙鏈dna熒光染料與pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)合情況，采集熒光數(shù)據(jù)，根據(jù)熔解曲線和cq值來(lái)鑒別pcv3；利用所述方法進(jìn)行pcr擴(kuò)增后即可鑒別pcv3，準(zhǔn)確性高、特異性好，重復(fù)性好，可以準(zhǔn)確、快速、高效地進(jìn)行鑒定pcv3，有利于在臨床實(shí)踐中推廣應(yīng)用。

本發(fā)明對(duì)多個(gè)pcv3病毒的rep區(qū)域基因序列(nc031753、kx458235、ky354039、kx966193、kx898030、kx778720、kt869077和ky354038)進(jìn)行綜合研究，針對(duì)研究所得的特定目標(biāo)擴(kuò)增區(qū)域進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物特異性較好，可以有效檢測(cè)pcv3的病毒株。

附圖說(shuō)明

圖1是實(shí)施例1的重組質(zhì)粒pmd19-t-rep的1％瓊脂糖凝膠電泳圖，其中，泳道m(xù)為dl2000marker(單位：bp)，泳道1為重組質(zhì)粒pmd19-t-rep。

圖2是實(shí)施例2的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品sybrgreeni熒光定量pcr的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

圖3是實(shí)施例2的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品sybrgreeni熒光定量pcr的熔解曲線圖。

圖4是實(shí)施例3的實(shí)時(shí)熒光定量pcr靈敏性試驗(yàn)中結(jié)果分析圖；其中，1～8的模板濃度(copies/μl)依次為1.73×10⁹、1.73×10⁸、1.73×10⁷、1.73×10⁶、1.73×10⁵、1.73×10⁴、1.73×10³、1.73×10²；nc表示陰性對(duì)照，模板為ddh2o。

圖5是實(shí)施例4的實(shí)時(shí)熒光定量pcr的特異性試驗(yàn)擴(kuò)增結(jié)果分析圖；其中，1表示pcv3陽(yáng)性對(duì)照；2～15依次分別表示fmdv、svdv、sva、pedv、pkv、psv、pbov、pdcov、prv、prrsv、csfv、pcv2、ppv和siv；nc表示陰性對(duì)照，模板為ddh2o。

圖6實(shí)施例4的時(shí)熒光定量pcr的特異性試熔解曲線結(jié)果分析圖；其中，pcv3為陽(yáng)性對(duì)照熔解曲線，其余分別為fmdv、svdv、sva、pedv、pkv、psv、pbov、pdcov、prv、prrsv、csfv、pcv2、ppv、siv和ddh2o。

圖7是實(shí)施例4的實(shí)時(shí)熒光定量pcr的特異性試驗(yàn)ddh2o(nc)和pcv3的熔解曲線圖。

圖8是實(shí)施例4的實(shí)時(shí)熒光定量pcr的特異性試驗(yàn)中pkv和pcv3的熔解曲線圖。

圖9是實(shí)施例4的實(shí)時(shí)熒光定量pcr的特異性試驗(yàn)sva和pcv3的熔解曲線圖。

圖10是實(shí)施例4的實(shí)時(shí)熒光定量pcr的特異性試驗(yàn)pcv2和pcv3的熔解曲線圖。

圖11是對(duì)比實(shí)施例中常規(guī)pcr檢測(cè)試驗(yàn)的1％瓊脂糖凝膠電泳圖，其中，泳道m(xù)為marker，泳道1～8的模板濃度(copies/μl)依次為1.73×10⁹、1.73×10⁸、1.73×10⁷、1.73×10⁶、1.73×10⁵、1.73×10⁴、1.73×10³、1.73×10²，泳道9為陰性對(duì)照，模板為ddh2o。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)施例1陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的制備

一、病毒總dna的抽提

按invitrogen公司trizollsreagentrna提取試劑盒使用說(shuō)明書進(jìn)行。在1.5mleppendorf管中加入250μl已分裝好的pcv3陽(yáng)性病料(來(lái)自廣東某豬場(chǎng))，該陽(yáng)性病料由本實(shí)驗(yàn)室新發(fā)現(xiàn)并通過(guò)提取組織方式獲得。上清和750μltrizol，充分混勻，室溫放置10min；加入200μl的氯仿，劇烈搖動(dòng)15s，室溫靜置5min；4℃，12000rpm離心15min；將上清轉(zhuǎn)移到新的1.5mleppendorf管中，加入500μl異戊醇，充分混勻，室溫放置10min；4℃，12000rpm離心10min；棄去上清液，沉淀用冰預(yù)冷的70％乙醇1000μl，輕輕混勻，洗滌一次，4℃，12000rpm離心10min；棄去上清液，風(fēng)干；用20μldepc處理的三蒸水溶解dna，-80℃保存。

二、引物設(shè)計(jì)

根據(jù)genbank中pcv3的rep區(qū)域基因序列(genbank號(hào)為nc031753、kx458235、ky354039、kx966193、kx898030、kx778720、kt869077和ky354038)，設(shè)計(jì)pcr引物：上游引物p1：5'-tgaagttgcggagaagat-3'(seqidno.1)；下游引物p2：5'-cctggaggaccaataaaa-3'(seqidno.2)，利用該引物擴(kuò)增rep基因部分保守序列，反應(yīng)體系如下：premixtaq^tm(lataq^tmversion2.0)酶(購(gòu)自takara公司，貨號(hào)rr900q)25μl、上游引物p11μl、下游引物p21μl、模板dna(步驟一最終得到的dna)1μl，最后用ddh2o補(bǔ)足反應(yīng)體系總體積為50μl。

擴(kuò)增程序?yàn)椋?1)94℃預(yù)變性5min；(2)94℃變性1min，50℃退火30s，72℃延伸30s，共30個(gè)循環(huán)；(3)72℃延伸10min。

回收pcr產(chǎn)物(參照omega公司gelextractionkit的使用說(shuō)明書)，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，鑒定為正確的目標(biāo)片段，用于后續(xù)的克隆。

三、目的基因的克隆

(1)回收產(chǎn)物連接pmd19-t載體

參照19-tvector試劑盒(購(gòu)自takara公司，貨號(hào)3271)說(shuō)明書，連接反應(yīng)體系為：通過(guò)膠回收后純化的pcr產(chǎn)物4μl、pmd19-tvector1μl、solutioni5μl；最終連接反應(yīng)體系的總體積為10μl。

在premixtaq^tm(lataq^tmversion2.0)酶的作用擴(kuò)增得到目的片段的pcr產(chǎn)物3′端附有一個(gè)“a”堿基，可與pmd19-t直接連接，進(jìn)行ta克隆。

將上述反應(yīng)體系混勻并稍作離心后，4℃連接過(guò)夜。

(2)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化

將步驟(1)中得到的連接產(chǎn)物5μl輕輕地加到50μl的e.colidh5α感受態(tài)細(xì)胞(購(gòu)自takara公司，貨號(hào)9057)中，冰浴30min；42℃熱休克90s然后迅速轉(zhuǎn)移到冰浴中冷卻2min；加到200μllb液體培養(yǎng)基中，37℃，160rpm振搖培養(yǎng)45min，使大腸桿菌復(fù)蘇，抗性基因表達(dá)；將以上復(fù)蘇的感受態(tài)細(xì)胞均勻涂布amp⁺/lb固體培養(yǎng)基平皿，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。

(3)重組子的pcr鑒定與篩選

從步驟(2)中得到的過(guò)夜培養(yǎng)的固體培養(yǎng)基平皿中挑取三個(gè)單菌落，分別接種于1ml含有100μg/mlamp⁺的lb液體培養(yǎng)基中，37℃，220rpm振搖培養(yǎng)6h以上(od600值0.3～0.4)；取菌液進(jìn)行pcr鑒定。反應(yīng)體系如下：2×taqmastermix(dye)酶(購(gòu)自康為世紀(jì)公司，貨號(hào)cw0682s)10μl、上游引物p1(seqidno.1)(10μm)1μl、下游引物p2(seqidno.2)(10μm)1μl、模板dna1μl，最后用ddh2o補(bǔ)足反應(yīng)體系總體積為20μl。

擴(kuò)增程序?yàn)椋?1)94℃預(yù)變性5min；(2)94℃變性1min，50℃退火30s，72℃延伸30s，共32個(gè)循環(huán)；(3)72℃延伸10min。

產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

取20μl鑒定陽(yáng)性的菌液以1：100的比例接種到2mlamp⁺的lb液體培養(yǎng)基中，37℃，220rpm振搖培養(yǎng)過(guò)夜。

(4)重組質(zhì)粒的提取與鑒定

參照omega公司plasmidminikiti的說(shuō)明書，對(duì)步驟(3)中過(guò)夜培養(yǎng)得到的菌液進(jìn)行質(zhì)粒抽提，用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)粒抽提效果。

將重組質(zhì)粒抽提產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，鑒定結(jié)果見圖1，m為dl2000marker(購(gòu)自takara公司，貨號(hào)3427q)，單位為bp。將陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為pmd19-t-rep。經(jīng)鑒定陽(yáng)性的重組pmd19-t-rep質(zhì)粒送北京奧科生物科技有限責(zé)任公司進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定。

從而制備得到pcv3陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品。

實(shí)施例2熒光定量pcr反應(yīng)條件優(yōu)化和標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

經(jīng)優(yōu)化后熒光定量pcr反應(yīng)體系為：realstargreenfastmixture(2×)(購(gòu)自北京康潤(rùn)科技有限公司，貨號(hào)a301)10μl，0.8μl上游引物(seqidno.1)(10μm)，0.8μl下游引物(seqidno.2)(10μm)、dna模板1μl、ddh2o7.4μl。最佳反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2min；95℃變性15s，56.4℃退火20s，72℃延伸30s，40個(gè)循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后先加熱至95℃反應(yīng)10s，然后再降至65℃，開始以0.5℃/s遞增至95℃檢測(cè)熒光信號(hào)得出擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線。

測(cè)定實(shí)施例1制得的pcv3陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品(pmd19-t-rep)的od260nm和od280nm值及其比值，計(jì)算質(zhì)粒濃度，并換算成拷貝數(shù)，以雙蒸水10倍系列稀釋成8個(gè)梯度(10²～10⁹copies/μl)。分別以所得的8個(gè)濃度梯度的pmd19-t-rep為dna模板，建立20μl反應(yīng)體系，根據(jù)優(yōu)化后的熒光定量pcr反應(yīng)體系，在bio-rad熒光定量pcr儀上擴(kuò)增，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2，sybr擴(kuò)增效率(e)為94.3％，標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.465，y軸截距為42.338。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)曲線與cq值之間的線性關(guān)系緊密，r²(相關(guān)系數(shù))可達(dá)0.998。

所建立的熔解曲線如圖3所示，熔解曲線為單一峰，熔解溫度為82.5℃，無(wú)特異性峰值產(chǎn)生。

實(shí)施例3實(shí)時(shí)熒光定量pcr的靈敏性試驗(yàn)

以實(shí)施例1制得的pcv3陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品雙蒸水10倍系列稀釋分別作為模板(l.73×10⁰～l.73×10⁹copies/μl，共10個(gè)梯度，模板濃度根據(jù)od260nm和od280nm值及其比值，計(jì)算質(zhì)粒濃度，并換算成拷貝數(shù))按實(shí)施例2中優(yōu)化后的熒光定量pcr反應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr，以確定它們的檢出下限。結(jié)果如圖4所示，1～8的模板濃度(copies/μl)依次為1.73×10⁹、1.73×10⁸、1.73×10⁷、1.73×10⁶、1.73×10⁵、1.73×10⁴、1.73×10³、1.73×10²，ddh2o為陰性對(duì)照(nc)模板，分析可知，本發(fā)明的實(shí)時(shí)熒光定量pcr的檢出下限為1.73×10²copies/μl。

實(shí)施例4實(shí)時(shí)熒光定量pcr的特異性試驗(yàn)

以豬口蹄疫病毒(fmdv)、豬水皰病病毒(svdv)、豬塞內(nèi)加谷病毒(sva)、豬流行性腹瀉病毒(pedv)、豬庫(kù)布病毒(pkv)、豬薩佩羅病毒(psv)、豬博卡病毒(pbov)、豬三角冠狀病毒(pdcov)、豬偽狂犬病毒(prv)、豬藍(lán)耳病病毒(prrsv)、豬瘟病毒(csfv)、豬圓環(huán)病毒2型(pcv2)、豬細(xì)小病毒(ppv)、豬流感病毒(siv)和pcv3的cdna或dna為模板，其中pbov、prv、pcv2和ppv的模板為dna，其余為cdna。以上病毒株均為華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院家禽研究室保存毒株。應(yīng)用實(shí)施例2所建立的優(yōu)化的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增，結(jié)果如圖5、圖6、圖7，圖8、圖9和圖10所示，該pcr擴(kuò)增只有pcv3呈陽(yáng)性，熔解曲線為單一峰，且熔解溫度為82.5℃；而其他病毒cdna或dna均無(wú)特異性擴(kuò)增，熔解曲線為非單一峰，或熔解曲線為單一峰但熔解溫度遠(yuǎn)低于82.5℃。表明本發(fā)明建立的pcv3sybrgreenⅰ實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)方法具有良好的特異性。

實(shí)施例5實(shí)時(shí)熒光定量pcr的重復(fù)性試驗(yàn)

將pcv3的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒(即實(shí)施例1制得的pmd19-t-rep)分別稀釋為1.9×10⁹、1.9×10⁸、1.9×10⁷、1.9×10⁶、1.9×10⁵、1.9×10⁴、1.9×10³、1.9×10²copies/μl共8梯度，依次以之作為模板，用本發(fā)明建立的實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法擴(kuò)增檢測(cè)，進(jìn)行組內(nèi)和組間的重復(fù)性檢驗(yàn)，每個(gè)梯度進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，每次5個(gè)重復(fù)。通過(guò)pmd19-t-rep標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒對(duì)本發(fā)明所建立起來(lái)的pcv3實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法進(jìn)行重復(fù)性檢驗(yàn)。結(jié)果如表1所示，組內(nèi)和組間的變異系數(shù)(cv)均小于2.27％，說(shuō)明本發(fā)明建立的pcv3sybrgreenⅰ實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)方法具有良好的重復(fù)性。

表1pcv3實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增pmd19-t-rep的重復(fù)性分析

實(shí)施例6試劑盒的組成

按照下列組成配制用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒3型的試劑盒：上游引物、下游引物、陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品(即實(shí)施例1制得的pmd19-t-rep)、realstargreenfastmixture(2×)、ddh2o。

該試劑盒的反應(yīng)體系為：realstargreenfastmixture(2×)10μl(購(gòu)自genstar，貨號(hào)a301)，0.8μl上游引物(10μm)，0.8μl下游引物(10μm)、dna模板1.0μl、ddh2o7.4μl，反應(yīng)總體積為20μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2min；95℃變性15s，56.4℃退火20s，72℃延伸30s，40個(gè)循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后先加熱至95℃反應(yīng)10s，然后再降至65℃，開始以0.5℃/s遞增至95℃檢測(cè)熒光信號(hào)得出擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線。

結(jié)果判定方法：熔解曲線為單一峰，熔解溫度在80.5～82.5℃之間，且擴(kuò)增曲線cq值在10.17～34.81之間判定為陽(yáng)性(圖5～圖10)。熔解曲線非單一峰(圖8)，或熔解曲線為單一峰但熔解溫度不在80.5～82.5℃范圍內(nèi)(圖9、圖10)，判定為陰性。

對(duì)比實(shí)施例常規(guī)pcr檢測(cè)試驗(yàn)

以實(shí)施例3制得的pcv3陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液為模板(l.73×10²～l.73×10⁹copies/μl，共8個(gè)梯度)進(jìn)行常規(guī)pcr擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下：2×taqmastermix(dye)酶(購(gòu)自康為世紀(jì)公司，貨號(hào)cw0682s)10μl、上游引物p1(seqidno.1)(10μm)1μl、下游引物p2(seqidno.2)(10μm)1μl、模板dna1μl，最后用ddh2o補(bǔ)足反應(yīng)體系總體積為20μl。

擴(kuò)增程序?yàn)椋?1)94℃預(yù)變性5min；(2)94℃變性1min，56.4℃退火30s，72℃延伸30s，共32個(gè)循環(huán)；(3)72℃延伸10min。

產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

結(jié)果如圖8所示，泳道1～8的模板濃度(copies/μl)依次為1.73×10⁹、1.73×10⁸、1.73×10⁷、1.73×10⁶、1.73×10⁵、1.73×10⁴、1.73×10³、1.73×10²，ddh2o為陰性對(duì)照(nc)模板，由此可知，常規(guī)pcr的檢出下限為1.73×10⁴copies/μl，對(duì)比實(shí)施例3的結(jié)果表明，本發(fā)明的實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)pcv3的靈敏性(檢出下限為1.73×10²copies/μl)比常規(guī)pcr的靈敏性高2個(gè)數(shù)量級(jí)，即靈敏100倍。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>華南農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>一種檢測(cè)豬圓環(huán)病毒3型病毒的引物對(duì)、方法及試劑盒

<130>1

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>上游引物p1

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tgaagttgcggagaagat18

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>下游引物p2

<400>2

cctggaggaccaataaaa18