本發(fā)明涉及一種積累n-乙酰神經(jīng)氨酸重組枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用，屬于遺傳工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

n-乙酰神經(jīng)氨酸是生物體內(nèi)的一種單糖，廣泛存在于微生物以及哺乳動物體內(nèi)。在人體中，n-乙酰神經(jīng)氨酸是細(xì)胞信息傳遞的第一接觸位點，參與細(xì)胞識別、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多個生理過程。因此，n-乙酰神經(jīng)氨酸被廣泛應(yīng)用于調(diào)節(jié)igg抗炎活性，增強嬰兒免疫力，促進嬰兒大腦發(fā)育。目前，n-乙酰神經(jīng)氨酸主要采用從酪蛋白、燕窩等含量相對豐富的天然材料中提取，得到的產(chǎn)品容易引起過敏反應(yīng)，或是通過嚴(yán)苛條件的化學(xué)法合成，高溫、高壓工藝復(fù)雜，中間產(chǎn)物等難以分離，而且對環(huán)境污染嚴(yán)重。

枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)是一種被廣泛用作食品酶制劑及重要營養(yǎng)化學(xué)品的生產(chǎn)宿主，其產(chǎn)品被fda認(rèn)證為“generallyregardedassafe”(gras)安全級別。因此，運用代謝工程手段構(gòu)建重組枯草芽孢桿菌是生產(chǎn)食品安全級n-乙酰神經(jīng)氨酸的有效途徑。然而，枯草芽孢桿菌中氨糖代謝途徑調(diào)控嚴(yán)密，并不會形成氨糖的積累，而且沒有n-乙酰神經(jīng)氨酸關(guān)鍵基因。如何改造枯草芽孢桿菌中氨糖代謝途徑，供需前體物質(zhì)，以及建立n-乙酰神經(jīng)氨酸代謝途徑是一個值得深入探討的問題。

目前在枯草中構(gòu)建的n-乙酰神經(jīng)氨酸代謝途徑主要通過udp-n-乙酰氨基葡萄糖為前體，該代謝流從底物葡萄糖到n-乙酰氨基葡萄糖前體物質(zhì)udp-n-乙酰氨基葡萄糖需要加強氨基葡萄糖-果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶(glms)、磷酸氨基葡萄糖異構(gòu)酶(glmm)、udp-n-氨基葡萄糖焦磷酸化酶(gcad)三個酶的作用，易導(dǎo)致代謝流強度不夠，因此尋找新的、高效的合成代謝途徑十分必要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的第一個目的是構(gòu)建一種積累n-乙酰神經(jīng)氨酸的重組枯草芽孢桿菌。

本發(fā)明的重組枯草芽孢桿菌，表達(dá)外源的氨基葡萄糖乙?；妇幋a基因gna1，n-乙酰氨基葡萄糖異構(gòu)酶編碼基因age，n-乙酰神經(jīng)氨酸合酶編碼基因neub。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述氨基葡萄糖乙酰化酶編碼基因重組于基因組上整合表達(dá)，n-乙酰氨基葡萄糖異構(gòu)酶編碼基因、n-乙酰神經(jīng)氨酸合酶編碼基因重組于表達(dá)質(zhì)粒上游離表達(dá)。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述氨基葡萄糖乙?；妇幋a基因表達(dá)的氨基酸序列如seqidno.1所示。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述n-乙酰氨基葡萄糖異構(gòu)酶基因表達(dá)的氨基酸序列如seqidno.2所示。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述n-乙酰神經(jīng)氨酸合酶基因表達(dá)的氨基酸序列如seqidno.3所示。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種上述重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

1)構(gòu)建重組片段

通過融合pcr，將釀酒酵母(saccharomycescerevisiaes288c)的氨基葡萄糖乙?；妇幋a基因gna1克隆片段，與重組同源臂以及zeocin抗性基因融合；

2)構(gòu)建重組質(zhì)粒

克隆念珠藻(anabaenasp.ch1)的n-乙酰氨基葡萄糖異構(gòu)酶編碼基因，以及來源于大腸桿菌(escherichiacolik1)的n-乙酰神經(jīng)氨酸合酶編碼基因，連接到重組表達(dá)質(zhì)粒pp43nmk(zhangxz,cuizl,hongq,lisp.high-levelexpressionandsecretionofmethylparathionhydrolaseinbacillussubtiliswb800.appliedandenvironmentalmicrobiology.2005；71(7):4101-3.)上；

3)構(gòu)建產(chǎn)n-乙酰神經(jīng)氨酸重組枯草芽孢桿菌

將上述步驟1)中重組片段轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis168δnagpδnagpδgampδgamaδnagaδnagbδ1dhδpta::lox72，liuy,zhuy,lij,shinh-d,chenrr,dug,liul,chenj.modularpathwayengineeringofbacillussubtilisforimprovedn-acetylglucosamineproduction.metabolicengineering,2014.23:42-52)，重組到基因組上，獲得重組枯草芽孢桿菌工程菌，命名為b6c；而后將上述步驟2)中重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到b6c菌株中，得到產(chǎn)n-乙酰神經(jīng)氨酸重組枯草芽孢桿菌，命名為b6can。

本發(fā)明另一個目的是提供一種上述重組枯草芽孢桿菌在營養(yǎng)保健品方面的應(yīng)用。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述枯草芽孢桿菌用于發(fā)酵生產(chǎn)n-乙酰神經(jīng)氨酸。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述枯草芽孢桿菌用于發(fā)酵生產(chǎn)n-乙酰神經(jīng)氨酸是將35-38℃、180-220rpm下培養(yǎng)10-20h的重組枯草芽孢桿菌以10％-20％的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，于35-38℃、180-220rpm條件下發(fā)酵30-50h。

本發(fā)明的有益效果

本發(fā)明構(gòu)建了利用n-乙酰氨基葡萄糖異構(gòu)酶編碼基因age以及n-乙酰神經(jīng)氨酸合酶編碼基因neub合成n-乙酰神經(jīng)氨酸的新途徑，利用枯草芽孢桿菌自有的代謝途徑，從底物葡萄糖到n-乙酰神經(jīng)氨酸的前體物質(zhì)n-乙酰氨基葡萄糖僅需要強化氨基葡萄糖-果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶(glms)和氨基葡萄糖乙?；?gna1)兩個酶的作用即可，有助于強化合成代謝流。

本發(fā)明提供的重組枯草芽孢桿菌可實現(xiàn)n-乙酰神經(jīng)氨酸在胞外積累，其濃度可達(dá)到190mg/l，為進一步代謝工程改造枯草芽孢桿菌生產(chǎn)n-乙酰神經(jīng)氨酸奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明提供的重組枯草芽孢桿菌構(gòu)建方法簡單，便于使用，具有很好的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1是重組枯草芽孢桿菌b6can中葡萄糖到n-乙酰神經(jīng)氨酸的合成改造途徑。

具體實施方式

重組枯草芽孢桿菌種子培養(yǎng)及發(fā)酵：

種子培養(yǎng)基(g/l)：胰蛋白胨10，酵母粉5，nacl10。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/l)：葡萄糖60，胰蛋白胨10，酵母粉5，尿素6，nacl10。

培養(yǎng)條件：將37℃、200rpm下培養(yǎng)10h的種子以10％的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，于37℃、200rpm條件下培養(yǎng)35h。

n-乙酰神經(jīng)氨酸的測定方法：

高效液相色譜(hplc)檢測法：agilent1200，uv檢測器，hpx-87h柱(300×7.8mm，5μm)，流動相：5mm稀硫酸，流速0.50ml/min，柱溫60℃，進樣體積為10μl。

實施例1重組片段的構(gòu)建

根據(jù)質(zhì)粒p43nmk-cegna1(本實驗前期構(gòu)建)序列信息，設(shè)計序列分別如seqidno.4和seqidno.5的引物gna1-f：5’-aacgacaagaggatggtgctgaattgataggtggtatgttttcgcttgaac-3’，gna1-r：5’-cctgtgtgaaattgttatccgctcttaaaagcgctgggtcataaaattacag-3’，使用上述引物以質(zhì)粒pp43nmk-cegna1為模板，擴增含有p43啟動子的氨基葡萄糖乙?；妇幋a基因gna1；根據(jù)枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis168)基因組為模板，根據(jù)ncbi上公布的50s核糖體蛋白l25基因(ctc，genbank：nc_000964.3)，設(shè)計兩側(cè)同源臂引物，序列分別如seqidno.6和seqidno.7左側(cè)同源臂引物：ctc-1f:5’-acggggaagtccaaattaatatcg-3’，ctc-1r:5’-ttcaagcgaaaacataccacctatcaattcagcaccatcctcttgtcgtt-3’，序列分別為seqidno.8和seqidno.9的右側(cè)同源臂引物：ctc-2f:5’-gtcgtgactgggaaaaccctggcgatgctcagcctgaaggtgaaaac-3’，ctc-2r:5’-atgtgtgatattcgtggtaatgcgg-3’，使用上述引物從枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis168)基因組中擴增50s亞基核糖體蛋白l25基因ctc兩側(cè)同源臂基因序列；以p7z6質(zhì)粒(yan,x.,yu,h.j.,hong,q.&li,s.p.cre/loxsystemandpcr-basedgenomeengineeringinbacillussubtilis.appliedandenvironmentalmicrobiology74,5556-5562,doi:10.1128/aem.01156-08(2008).)為模板，設(shè)計序列分別為seqidno.10和seqidno.11zeocin抗性基因擴增引物：zeocin-f:5’-ctgtaattttatgacccagcgcttttaagagcggataacaatttcacacagg-3’，zeocin-r:5’-gttttcaccttcaggctgagcatcgccagggttttcccagtcacgac-3’。4段擴增片段通過融合pcr技術(shù)融合，獲得重組片段cpzc。

實施例2重組質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)ncbi上公布的念珠藻(anabaenasp.ch1，genbank：dq661858.1)中的n-乙酰氨基葡萄糖異構(gòu)酶基因age，通過枯草芽孢桿菌偏好密碼子優(yōu)化后，基因合成，設(shè)計序列分別為seqidno.12和seqidno.13的引物：age-f:5’-ataaagtgatagcggtaccattataggtaagagaggaatgtacacatgggcaaaaactacaagctctg-3’,age-r:5’-acgatgtagatgttagacatgtgtacattcctctcttaccccgggttatgaaagtgcttcaaactgttgcc-3’，使用上述引物，以合成n-乙酰氨基葡萄糖異構(gòu)酶基因為模板擴增age基因片段；根據(jù)ncbi上公布的大腸桿菌(escherichiacolik1，genbank：u05248.1)的n-乙酰神經(jīng)氨酸合酶基因neub，通過枯草芽孢桿菌偏好密碼子優(yōu)化后，基因合成，設(shè)計序列分別為seqidno.14和seqidno.15的引物：neub-f:5’-atgtctaacatctacatcgtggcagaaat-3’，neub-r:5’-ccgcccttggcggcatccgcgaaggcctttattctccctggtttttaaattcgc-3’，以合成n-乙酰神經(jīng)氨酸合酶基因為模板擴增neub基因片段；質(zhì)粒pp43nmk經(jīng)kpni和stui雙酶切后與以上兩段擴增基因片段通過gibsonassemblyclongingkit(newenglandbiolabs)，構(gòu)建重組質(zhì)粒，雙酶切驗證及測序，確認(rèn)重組質(zhì)粒pp43nmk-an構(gòu)建成功。

實施例3重組cpzc片段枯草芽孢桿菌的構(gòu)建

將構(gòu)建好的重組片段cpzc轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis168δnagpδnagpδgampδgamaδnagaδnagbδ1dhδpta::lox72)。采用gna1-f及gna1-r引物挑選轉(zhuǎn)化子進行菌落pcr，出現(xiàn)864bp條帶，驗證重組枯草芽孢桿菌b6c構(gòu)建成功。

實施例4重組pp43nmk-an質(zhì)?？莶菅挎邨U菌的構(gòu)建

將構(gòu)建好的pp43nmk-an質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌b6c。采用neub-f及neub-r引物挑選轉(zhuǎn)化子進行菌落pcr，出現(xiàn)1069bp條帶，驗證重組枯草芽孢桿菌b6can構(gòu)建成功。重組枯草芽孢桿菌b6can中葡萄糖到n-乙酰神經(jīng)氨酸的合成改造途徑如圖1所示。

實施例5發(fā)酵生產(chǎn)n-乙酰神經(jīng)氨酸

將37℃、200rpm下培養(yǎng)10h的種子以15％的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，于37℃、200rpm條件下培養(yǎng)35h。最終發(fā)酵上清液中n-乙酰神經(jīng)氨酸含量達(dá)到190mg/l。過量表達(dá)氨基葡萄糖乙?；妇幋a基因gna1，n-乙酰氨基葡萄糖異構(gòu)酶基因age，n-乙酰神經(jīng)氨酸合酶基因neub，實現(xiàn)了n-乙酰神經(jīng)氨酸在重組枯草芽孢桿菌胞外的積累。

對照實施例1整合表達(dá)age、neub積累n-乙酰神經(jīng)氨酸

根據(jù)pp3nmk-an質(zhì)粒序列信息及pax01質(zhì)粒序列信息，設(shè)計序列分別為seqidno.16和seqidno.17的age和neub基因擴增引物：an-f:5’-aaaatcaaagggggaaatgggatccatgggcaaaaacttacaagctctgg-3’，an-r:5’-cggccgcccgcgggagctcggatccttattctccctggtttttaaattcgctatg-3’，使用上述引物，以pp43nmk-an質(zhì)粒為模板，擴增age和neub基因；將擴增所得基因片段與經(jīng)過bamhi單酶切的pax01質(zhì)粒通過gibsonassemblyclongingkit(newenglandbiolabs)，構(gòu)建整合型重組表達(dá)質(zhì)粒pax-an，酶切、測序確定質(zhì)粒構(gòu)建成功。pax-an經(jīng)pvui線性化后，轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌b6c，將age和neub整合至枯草芽孢桿菌b6c基因組。菌落pcr驗證age和neub基因整合成功。

將37℃、200rpm下培養(yǎng)10h的種子以15％的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，于37℃、200rpm條件下培養(yǎng)35h。最終發(fā)酵上清液中檢測不到n-乙酰神經(jīng)氨酸含量。

對照實施例2游離表達(dá)gna1、age、neub積累n-乙酰神經(jīng)氨酸

根據(jù)pp3nmk-an質(zhì)粒序列信息及氨基葡萄糖乙酰化酶編碼基因gna1基因序列，設(shè)計序列分別為seqidno.18和seqidno.19的gna1基因重組構(gòu)建引物：cz_gna1-f:5’-taaaaaccagggagaataaaggcctgtaagagaggaatgtacacatgc-3’，cz_gna1-r:5’-cttggcggcatccgcgaaggcctttaaaagcgctgggtcat-3’，使用上述引物，擴增gna1基因；將pp43nmk-an質(zhì)粒eco147i單酶切后柱純化回收；將線性化質(zhì)粒與擴增gna1基因由vazyme的onestepcloningkit重組構(gòu)建，酶切、測序確定質(zhì)粒構(gòu)建成功。將構(gòu)建成功質(zhì)粒轉(zhuǎn)化b6c菌，菌落pcr驗證轉(zhuǎn)化成功。

將37℃、200rpm下培養(yǎng)10h的種子以15％的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，于37℃、200rpm條件下培養(yǎng)35h。最終發(fā)酵上清液中檢測不到n-乙酰神經(jīng)氨酸含量。

雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動和修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應(yīng)該以權(quán)力要求書所界定的為準(zhǔn)。

序列表

<110>江南大學(xué)

<120>一種積累n-乙酰神經(jīng)氨酸重組枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用

<160>19

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>159

<212>prt

<213>釀酒酵母（saccharomycescerevisiaes288c）

<400>1

metserleuproaspglyphetyrileargargmetglugluglyasp

151015

leugluglnvalthrgluthrleulysvalleuthrthrvalglythr

202530

ilethrprogluserpheserlysleuilelystyrtrpasngluala

354045

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65707580

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859095

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100105110

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115120125

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130135140

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145150155

<210>2

<211>388

<212>prt

<213>念珠藻（anabaenasp.ch1）

<400>2

metglylysasnleuglnalaleualaglnleutyrlysasnalaleu

151015

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202530

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355360365

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370375380

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385

<210>3

<211>346

<212>prt

<213>大腸桿菌（escherichiacolik1）

<400>3

metserasniletyrilevalalagluileglycysasnhisasngly

151015

servalaspilealaargglumetileleulysalalysglualagly

202530

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354045

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245250255

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260265270

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290295300

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305310315320

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340345

<210>4

<211>51

<212>dna

<213>人工合成

<400>4

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<210>5

<211>52

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<213>人工合成

<400>5

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<210>6

<211>24

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<213>人工合成

<400>6

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<210>7

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<213>人工合成

<400>7

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<211>47

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<213>人工合成

<400>8

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<210>9

<211>25

<212>dna

<213>人工合成

<400>9

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<210>10

<211>52

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<213>人工合成

<400>10

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<210>11

<211>47

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<213>人工合成

<400>11

gttttcaccttcaggctgagcatcgccagggttttcccagtcacgac47

<210>12

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<213>人工合成

<400>12

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<210>13

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<212>dna

<213>人工合成

<400>13

acgatgtagatgttagacatgtgtacattcctctcttaccccgggttatgaaagtgcttc60

aaactgttgcc71

<210>14

<211>29

<212>dna

<213>人工合成

<400>14

atgtctaacatctacatcgtggcagaaat29

<210>15

<211>54

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