技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種快速檢測蜜蜂絲狀病毒的檢測引物組、檢測試劑盒和檢測方法。

背景技術(shù)：
：

意大利蜜蜂絲狀病毒amfv(apismelliferafilamentousvirus，amfv)是其中唯一的一種dsdna病毒，其基因組達(dá)498500bp，基因組dna和核蛋白經(jīng)折疊和環(huán)化，形成長450×170nm的桿狀，根據(jù)基因組分析類似于無脊椎動物的桿狀病毒。具有較廣的宿主譜，包括意大利蜜蜂、中華蜜蜂，以及一些獨(dú)棲蜂如熊蜂。其傳播方式有水平傳播和垂直傳播。amfv單獨(dú)感染蜜蜂不會引起明顯的病理特征，與微孢子蟲共感染時會致死蜜蜂，死蜂的血淋巴呈乳白色，一般會在春季發(fā)病。因此建立一種簡單快速有效的檢測方法，采取相應(yīng)的防御措施，有助于預(yù)防疾病的發(fā)生。

lamp技術(shù)是2000年以來notomi等開發(fā)的一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，具有檢測時間短，高靈敏度和高特異性，操作簡單，僅僅需要普通水浴鍋就可以完成檢測。近年來已廣泛用于各種病原檢測。其特點(diǎn)是針對待測靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4-6條特異性引物，在bstdna聚合酶的作用下，在65℃左右等溫條件1h內(nèi)可以進(jìn)行特異高效快速的核酸擴(kuò)增，達(dá)到10⁹拷貝，擴(kuò)增結(jié)果可直接觀察焦磷酸鎂沉淀或者加入顯色劑進(jìn)行判斷。amfv病毒是目前發(fā)現(xiàn)的唯一的雙鏈dna蜜蜂病毒，還沒有相關(guān)的lamp技術(shù)的研究與開發(fā)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
：

本發(fā)明的目的是提供一種快速、特異性好、靈敏度高的快速檢測蜜蜂絲狀病毒的檢測引物組、檢測試劑盒和檢測方法。

本發(fā)明的第一個目的是提供利用環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測蜜蜂絲狀病毒的檢測引物組，其特征在于，由下列引物組成：

上游外引物f3：5’-tggatcgtcgggatcgtc-3’(如seqidno.1所示)；

下游外引物b3：5’-aactcgggaaacagtggc-3’(如seqidno.2所示)；

上游內(nèi)引物fip：5’-gtgactcaaacagactcgcggtctgcttcatctgaaccgtct-3’(如seqidno.3所示)；

下游內(nèi)引物bip：5’-gcgggacctcctatttcgctggtcaacttggcccgtaacc-3’(如seqidno.4所示)。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種非疾病的診斷和治療目的的蜜蜂絲狀病毒的檢測方法，其特征在于，提取樣品總dna，然后通過環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增的方法用上述檢測引物組對樣品dna進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，確認(rèn)是否存在有擴(kuò)增產(chǎn)物。

所述的樣品優(yōu)選為蜜蜂或蜂產(chǎn)品。蜜蜂可以為蜜蜂幼蟲、蛹、成蟲或其組織。蜂產(chǎn)品可以為蜂巢物質(zhì)，花粉等。

所述的通過環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增的方法用上述檢測引物組對樣品dna進(jìn)行選擇性擴(kuò)增具體為：環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增體系為體系總體積25μl，包括2.5μl10×thermopol反應(yīng)緩沖液、0.4μl10mmdntps、0.5μl10μm上游外引物f3、0.5μl10μm下游外引物b3、1μl40μm上游內(nèi)引物fip、1μl40μm下游內(nèi)引物bip、0.6μl100mmmgso4、12.5μl2m甜菜堿、4μl滅菌雙蒸水，1μl8u/μlbstdna聚合酶和1μl樣品dna模板，反應(yīng)條件為在溫度為60℃～65℃孵育45～60min。

所述的確認(rèn)是否存在有擴(kuò)增產(chǎn)物可以利用電泳檢測、熒光顯色檢測或濁度檢測環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物是否具有擴(kuò)增產(chǎn)物，優(yōu)選用熒光顯色檢測，具體是在80℃終止反應(yīng)1～2min，在擴(kuò)增反應(yīng)管中加入sybrgreenⅰ顯色劑，1～5min后觀察結(jié)果，如果顏色為橙色，則樣品蜜蜂絲狀病毒陰性，無蜜蜂絲狀病毒，如果顏色為綠色，則樣品蜜蜂絲狀病毒陽性，含有蜜蜂絲狀病毒。

所述的10×thermopol反應(yīng)緩沖液是現(xiàn)有技術(shù)中的物質(zhì)，可以從試劑公司購買到，其含有200mmol/lph8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸(tris-hcl)、100mmol/l氯化鉀(kcl)、100mmol/l硫酸銨((nh4)2so4)、20mmol/l硫酸鎂(mgso4)和1％曲拉通x-100(ttitonx-100)，余量為水。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種蜜蜂絲狀病毒的檢測試劑盒，包括環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增試劑和檢測引物組，其特征在于，所述的檢測引物組由下列引物組成：

上游外引物f3：5’-tggatcgtcgggatcgtc-3’(如seqidno.1所示)；

下游外引物b3：5’-aactcgggaaacagtggc-3’(如seqidno.2所示)；

上游內(nèi)引物fip：5’-gtgactcaaacagactcgcggtctgcttcatctgaaccgtct-3’(如seqidno.3所示)；

下游內(nèi)引物bip：5’-gcgggacctcctatttcgctggtcaacttggcccgtaacc-3’(如seqidno.4所示)。

本發(fā)明針對蜜蜂絲狀病毒的atpase特異性靶基因設(shè)計和篩選了一套特異性檢測引物組以及含有該檢測引物組的檢測試劑盒和利用該檢測試劑盒通過環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增的檢測方法，進(jìn)而確定待檢測樣品中是否存在蜜蜂絲狀病毒的檢測方法。本發(fā)明的檢測試劑盒和檢測方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確率好、檢測時間短的優(yōu)點(diǎn)，從樣品處理到報告結(jié)果只需花4h，不需要pcr儀和電泳儀，操作過程簡單，比其他pcr技術(shù)具有更高的特異性。特別適合蜜蜂病原調(diào)查與疾病防控。

具體實(shí)施方式：

以下實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。

1、蜜蜂組織dna提取液

蜜蜂組織dna提取液是購買的kapa公司的昆蟲組織dna提取試劑盒。

2、lamp快速檢測系列試劑

(1)環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)液：含有10×thermopol反應(yīng)緩沖液、300-500μmdntps(四種脫氧核苷酸的混合物)、4-6ml硫酸鎂(mgso4)、0.1-0.3μm外引物(f3/b3)，1-2μm內(nèi)引物(fip/bip)、0.8-1m甜菜堿。

其中10×thermopol緩沖液含有200mmph8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸(tris-hcl)、100mm氯化鉀(kcl)、100mm硫酸銨((nh4)2so4)、20mm硫酸鎂(mgso4)和1％曲拉通x-100(ttitonx-100)，余量為水。

檢測引物組：

上游外引物f3(5’-3’)：tggatcgtcgggatcgtc(如seqidno.1所示)；

下游外引物b3(5’-3’)：aactcgggaaacagtggc(如seqidno.2所示)；

上游內(nèi)引物fip(5’-3’)：gtgactcaaacagactcgcggtctgcttcatctgaaccgtct(如seqidno.3所示)；

下游內(nèi)引物bip(5’-3’)：gcgggacctcctatttcgctggtcaacttggcccgtaacc(如seqidno.4所示)。

(2)bstdna聚合酶：每微升含有8個活性單位(8u/μl)

(3)顯色劑：10％的熒光染料sybrgreenⅰ

上述環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(lamp)反應(yīng)液每管23μl的最佳組成為：2.5μl10×thermopol反應(yīng)緩沖液、0.4μl10mmdntps、0.5μl10μm上游外引物f3、0.5μl10μm下游外引物b3、1μl40μm上游內(nèi)引物fip、1μl40μm下游內(nèi)引物bip、0.6μl100mmmgso4、12.5μl2m甜菜堿、4μl滅菌雙蒸水ddh2o。

實(shí)施例1：意大利蜜蜂幼蟲組織中amfv的檢測

1、意大利蜜蜂幼蟲組織處理

取10mg意大利蜜蜂幼蟲組織，搗碎。

2、樣品組織dna的提取

往上述樣品中加入昆蟲組織dna提取液50μl，混勻，于95℃水浴10min，12000r/min離心5min，取上清備用，得到待檢測模板dna。

3、lamp擴(kuò)增

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(lamp)反應(yīng)液每管25μl的組成為：2.5μl10×thermopol反應(yīng)緩沖液、0.4μl10mmdntps、0.5μl10μm上游外引物f3、0.5μl10μm下游外引物b3、1μl40μm上游內(nèi)引物fip、1μl40μm下游內(nèi)引物bip、0.6μl100mmmgso4、12.5μl2m甜菜堿、1μl8u/μlbstdna聚合酶、1μl待檢測模板dna和4μl滅菌雙蒸水ddh2o，于恒溫水浴鍋上60℃孵育60min，80℃終止反應(yīng)1-2min，取出反應(yīng)管。

以不加dna作為陰性對照，以加攜帶amfv病毒的意大利蜜蜂幼蟲組織dna作為陽性對照。

4、顯色劑觀察

在反應(yīng)管中加入1μl顯色劑(10％的sybrgreenⅰ顯色劑)，直接用肉眼觀察顏色變化，待檢測樣品反應(yīng)管顏色變?yōu)榫G色，陰性對照反應(yīng)管顏色變?yōu)槌壬?，陽性對照反?yīng)管顏色變?yōu)榫G色，由此說明待檢測樣品(蜜蜂組織)中含有amfv。該結(jié)果與普通pcr產(chǎn)物測序結(jié)果吻合，證明此方法數(shù)據(jù)可靠。

實(shí)施例2：無病理癥狀的健康蜜蜂樣品的amfv檢測

1、意大利蜜蜂幼蟲組織處理

取10mg意大利蜜蜂幼蟲組織，搗碎。

2、樣品組織dna的提取

往上述樣品中加入昆蟲組織dna提取液50μl，混勻，于95℃水浴10min，12000r/min離心5min，取上清備用，得到待檢測模板dna。

3、lamp擴(kuò)增

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(lamp)反應(yīng)液每管25μl的組成為：2.5μl10×thermopol反應(yīng)緩沖液、0.4μl10mmdntps、0.5μl10μm上游外引物f3、0.5μl10μm下游外引物b3、1μl40μm上游內(nèi)引物fip、1μl40μm下游內(nèi)引物bip、0.6μl100mmmgso4、12.5μl2m甜菜堿、1μl8u/μlbstdna聚合酶、1μl待檢測模板dna和4μl滅菌雙蒸水ddh2o，于恒溫水浴鍋上60℃孵育60min，80℃終止反應(yīng)1-2min，取出反應(yīng)管。

以不加dna作為陰性對照，以加攜帶amfv病毒的意大利蜜蜂幼蟲組織dna作為陽性對照。

4、顯色劑觀察

在反應(yīng)管中加入1μl顯色劑(10％的sybrgreenⅰ顯色劑)，直接用肉眼觀察顏色變化，待檢測樣品反應(yīng)管顏色變?yōu)榫G色，陰性對照反應(yīng)管顏色變?yōu)槌壬栃詫φ辗磻?yīng)管顏色變?yōu)榫G色，由此說明待檢測樣品(蜜蜂組織)中含有amfv。該結(jié)果與普通pcr產(chǎn)物測序結(jié)果吻合，證明此方法數(shù)據(jù)可靠。

實(shí)施例3：特異性實(shí)驗(yàn)

收集攜帶amfv及不攜帶amfv但攜帶其他蜜蜂病毒的蜜蜂樣品17份(其他蜜蜂病毒見表1)，分別取10mg相應(yīng)的蜜蜂樣品組織，搗碎，加入昆蟲組織dna提取液50μl，混勻，于95℃水浴10min，12000r/min離心5min，取上清備用，得到待檢測模板dna。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(lamp)反應(yīng)液，每管25μl的組成為：2.5μl10×thermopol反應(yīng)緩沖液、0.4μl10mmdntps、0.5μl10μm上游外引物f3、0.5μl10μm下游外引物b3、1μl40μm上游內(nèi)引物fip、1μl40μm下游內(nèi)引物bip、0.6μl100mmmgso4、12.5μl2m甜菜堿、1μl8u/μlbstdna聚合酶、1μl待檢測模板dna和4μl滅菌雙蒸水ddh2o，于恒溫水浴鍋上63℃孵育50min，80℃終止反應(yīng)1-2min，取出反應(yīng)管。

反應(yīng)管中加入1μl顯色劑(10％的sybrgreenⅰ顯色劑)，直接用肉眼觀察顏色變化，如果顏色為橙色，則樣品amfv陰性，無amfv，如果顏色為綠色，則樣品amfv陽性，含有amfv。結(jié)果如表1所示。

表1：試驗(yàn)所用不同病毒陽性的蜜蜂樣品及測試結(jié)果

注：+：amfv陽性；-：amfv陰性

由表1可以看出，本發(fā)明中的lamp方法具有較好的特異性，只有amfv擴(kuò)增陽性，其他非amfv病毒為陰性。該結(jié)果與普通pcr產(chǎn)物測序結(jié)果吻合。

實(shí)施例4：靈敏度實(shí)驗(yàn)

將amfv陽性樣品dna稀釋成2.0×10⁰ge/μl、2.0×10¹ge/μl、2.0×10²ge/μl、2.0×10³ge/μl4個濃度梯度(ge：genomeequivalents病毒基因組當(dāng)量)，同時進(jìn)行定量pcr測定和lamp擴(kuò)增(方法同實(shí)施例1)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證該方法的靈敏度。經(jīng)過3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，其中2次實(shí)驗(yàn)結(jié)果靈敏度為2.0×10¹ge/μl，1次實(shí)驗(yàn)結(jié)果靈敏度為1.32×10²ge/μl，因此確定本發(fā)明的lamp方法的最低檢測限為2.0×10¹ge/μl～1.32×10²ge/μl，具有較高的靈敏度。

序列表

<110>廣東省生物資源應(yīng)用研究所

<120>一種快速檢測蜜蜂絲狀病毒的檢測引物組、檢測試劑盒和檢測方法

<160>4

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

tggatcgtcgggatcgtc18

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

aactcgggaaacagtggc18

<210>3

<211>42

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

gtgactcaaacagactcgcggtctgcttcatctgaaccgtct42

<210>4

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

gcgggacctcctatttcgctggtcaacttggcccgtaacc40