本發(fā)明涉及一株異菌脲單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株zxl-2及其應(yīng)用，屬于食品安全免疫檢測(cè)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
異菌脲（iprodione，又稱撲海因）是一種二甲酰亞胺類高效廣譜、觸殺型低毒殺菌劑，適用于防治多種果樹、蔬菜、瓜果類等作物早期落葉病、灰霉病、早疫病等病害?？茖W(xué)研究信息表明，若根據(jù)現(xiàn)有標(biāo)簽使用，異菌脲對(duì)人類健康造成的風(fēng)險(xiǎn)已不符合標(biāo)準(zhǔn)，因此加拿大有害生物管理局（pmra）于2016年建議取消殺菌劑異菌脲的所有用途。我國(guó)農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定香蕉、蘋果、油菜籽中異菌脲的最大殘留限量值（mrl）分別為10、5、2mg/kg。cac、日本、美國(guó)和歐盟也制定了其在水果、蔬菜和糧食中的mrl值，并對(duì)其殘留量進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
為了有效監(jiān)督監(jiān)測(cè)食品中使用異菌脲的情況，需要尋找一種特異性好，靈敏度高的測(cè)定方法，而目前檢測(cè)方法如薄層層析法、氣相色譜法、液相色譜法等，分離純化過程冗長(zhǎng)，靈敏度低，加上食品中干擾物多，難以獲得準(zhǔn)確結(jié)果。因此建立快速簡(jiǎn)便的異菌脲檢測(cè)方法具有重要意義。酶聯(lián)免疫法（elisa）是一種極為高效、敏感、快速的檢測(cè)方法，檢測(cè)時(shí)對(duì)樣本的純度要求不高而且操作簡(jiǎn)便，適用于大量樣本的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。建立高效的免疫學(xué)檢測(cè)方法，篩選高特異性的單克隆抗體是重要前提。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一株異菌脲單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，由該細(xì)胞株制備的抗體對(duì)異菌脲具有較好特異性和檢測(cè)靈敏度，可以用來建立異菌脲的免疫學(xué)檢測(cè)方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案：一株異菌脲單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株zxl-2，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱cgmcc，保藏編號(hào)為cgmccno.13093。
異菌脲單克隆抗體，它由所述保藏編號(hào)為cgmccno.13093的異菌脲單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株zxl-2分泌產(chǎn)生。
所述異菌脲單克隆抗體的應(yīng)用，用于食品安全檢測(cè)中異菌脲殘留的分析檢測(cè)。
本發(fā)明提供的異菌脲單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株zxl-2的制備基本步驟為：
1）半抗原的合成：
將異菌脲（15.0g，45.45mmol）,三乙胺（4.59g，45.45mmol），3-巰基丙酸（4.82g，45.45mmol）和四三苯基磷鈀（5.24g，4.545mmol）加入到乙二醇二甲醚（50.0ml）中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下升溫至100℃過夜。向反應(yīng)液中加純水（100ml），二氯甲烷萃?。?00ml×3次），飽和食鹽水洗一次，無水硫酸鈉干燥，濃縮得粗品，制備得半抗原ipma。
2）完全抗原的制備：
免疫原ipma-klh的制備：稱取4.2mgipma，1-乙基碳二亞胺鹽酸鹽7mg，n-羥基琥珀酰亞胺4mg，用300μl無水n,n-二甲基甲酰胺溶解，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4～5h(稱為a液)。取匙孔血藍(lán)蛋白klh1.47ml(6.8mg/ml,ipma與klh摩爾比為4500︰1)，加入等體積硼酸緩沖溶液（稱為b液）。在室溫條件，逐滴將a液加入到b液中，室溫反應(yīng)過夜，即得偶聯(lián)物ipma-klh混合液，通過透析分離完全抗原和未偶聯(lián)的小分子半抗原；包被原ipma-bsa的制備：稱取2.5mgipma，1-乙基碳二亞胺鹽酸鹽4mg，n-羥基琥珀酰亞胺2.5mg，用300μl無水n,n-二甲基甲酰胺溶解，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4～5h(稱為a液)。稱取10mg牛血清蛋白bsa（ipma與bsa摩爾比為30︰1），溶解于2ml硼酸緩沖溶液中，(稱為b液)。在室溫條件下，逐滴將a液加入到b液中，室溫反應(yīng)過夜，即得偶聯(lián)物ipma-bsa混合液，通過透析分離完全抗原和未偶聯(lián)的小分子半抗原。
3）小鼠的免疫：ipma-klh完全抗原與等量弗氏佐劑混合乳化后，通過背部皮下注射免疫balb/c小鼠。首次免疫用完全弗氏佐劑，多次加強(qiáng)免疫用不完全弗氏佐劑。首次免疫與第二次加強(qiáng)免疫之間間隔一個(gè)月，多次加強(qiáng)免疫之間間隔21天。最后一次用ipma-klh完全抗原（不含佐劑）沖擊免疫；通過間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法（ic-elisa）檢測(cè)血清效價(jià)和抑制；
4）細(xì)胞融合與細(xì)胞株建立：通過聚乙二醇（peg4000）法將小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，通過hat培養(yǎng)基培養(yǎng)，利用間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法（ic-elisa）檢測(cè)陽性細(xì)胞孔，并進(jìn)一步利用ic-elisa測(cè)定陽性細(xì)胞孔的抑制效果，通過有限稀釋法對(duì)有最好抑制的陽性細(xì)胞孔進(jìn)行三次亞克隆，最終篩選獲得異菌脲單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株zxl-2；
5）雜交瘤細(xì)胞株性質(zhì)的鑒定：通過ic-elisa測(cè)定靈敏度和特異性。
取高效價(jià)低ic50小鼠的脾細(xì)胞，通過peg方法與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)過間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法篩選和三次亞克隆，得到一株雜交瘤細(xì)胞株。
本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供的細(xì)胞株zxl-2分泌的單克隆抗體，對(duì)異菌脲具有較好的特異性和檢測(cè)靈敏度（ic50值為5ng/ml），可實(shí)現(xiàn)對(duì)水、果蔬、谷物中異菌脲殘留量的檢測(cè)，為食品中異菌脲殘留的免疫檢測(cè)提供了原料，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
生物材料樣品保藏：一株單克隆細(xì)胞株zxl-2，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱cgmcc，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏日期2016年10月31日，保藏編號(hào)為cgmccno.13093。
附圖說明
圖1zxl-2分泌的單克隆抗體對(duì)異菌脲的抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明下面的實(shí)施例僅作為本發(fā)明內(nèi)容的進(jìn)一步說明，不能作為本發(fā)明的限定內(nèi)容或范圍。下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
本發(fā)明通過將異菌脲完全抗原免疫小鼠，通過細(xì)胞融合，hat選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)，通過ic-elisa篩選細(xì)胞上清，最終得到了對(duì)異菌脲有較好特異性和靈敏度的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。
實(shí)施例1雜交瘤細(xì)胞株zxl-2的制備
（1）半抗原的合成：
將異菌脲（15.0g，45.45mmol）,三乙胺（4.59g，45.45mmol），3-巰基丙酸（4.82g，45.45mmol）和四三苯基磷鈀（5.24g，4.545mmol）加入到乙二醇二甲醚（50.0ml）中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下升溫至100℃過夜。向反應(yīng)液中加純水（100ml），二氯甲烷萃?。?00ml×3次），飽和食鹽水洗一次，無水硫酸鈉干燥，濃縮得粗品，制備得半抗原ipma。
（2）完全抗原的合成：
免疫原ipma-klh的制備：稱取4.2mgipma，1-乙基碳二亞胺鹽酸鹽7mg，n-羥基琥珀酰亞胺4mg，用300μl無水n,n-二甲基甲酰胺溶解，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4～5h(稱為a液)。取匙孔血藍(lán)蛋白klh1.47ml(6.8mg/ml,ipma與klh摩爾比為4500︰1)，加入等體積硼酸緩沖溶液（稱為b液）。在室溫條件，逐滴將a液加入到b液中，室溫反應(yīng)過夜，即得偶聯(lián)物ipma-klh混合液，通過透析分離完全抗原和未偶聯(lián)的小分子半抗原；包被原ipma-bsa的制備：稱取2.5mgipma，1-乙基碳二亞胺鹽酸鹽4mg，n-羥基琥珀酰亞胺2.5mg，用300μl無水n,n-二甲基甲酰胺溶解，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4～5h(稱為a液)。稱取10mg牛血清蛋白bsa（ipma與bsa摩爾比為30︰1），溶解于2ml硼酸緩沖溶液中（稱為b液）。在室溫條件下，逐滴將a液加入到b液中，室溫反應(yīng)過夜，即得偶聯(lián)物ipma-bsa混合液，通過透析分離完全抗原和未偶聯(lián)的小分子半抗原。
（3）動(dòng)物免疫：選擇健康的6～8周齡的balb/c小鼠進(jìn)行免疫。取異菌脲完全抗原與等量弗氏佐劑混合乳化后，通過背部皮下注射免疫balb/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐劑，之后都用不完全弗氏佐劑。首次免疫與第二次加強(qiáng)免疫之間間隔一個(gè)月，多次加強(qiáng)免疫之間間隔21天。第3次免疫后7天采血，使用ic-elisa測(cè)定小鼠血清效價(jià)和抑制，選擇效價(jià)高抑制好的小鼠，在第5次免疫后21天沖擊免疫，腹腔注射，要求沖免劑量減半且不含任何佐劑。
（4）細(xì)胞融合：在沖擊免疫三天后，按照常規(guī)peg（聚乙二醇，分子量為4000）方法進(jìn)行細(xì)胞融合，具體步驟如下：
a、摘眼球取血，頸椎脫臼法處死小鼠后，立即放入75%酒精中消毒，浸泡5min左右，無菌操作取出小鼠的脾臟，用注射器的膠頭適度研磨并通過200目細(xì)胞篩網(wǎng)得到脾細(xì)胞懸液，收集，離心（1200rpm，8min），用rpmi-1640培養(yǎng)基洗滌脾細(xì)胞3次，最后一次離心后，將脾細(xì)胞稀釋到一定體積，計(jì)數(shù)，備用；
b、收集sp2/0細(xì)胞：融合前7～10天，將sp2/0瘤細(xì)胞用含10%fbs（胎牛血清）rpmi-1640培養(yǎng)基在5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。融合前要求sp2/0瘤細(xì)胞數(shù)量達(dá)到（1~4）×107，保證融合前sp2/0瘤細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。融合時(shí)，收集瘤細(xì)胞，懸浮于rpmi-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；
c、融合過程7min。第1min，將1ml的peg1500由慢到快滴加到細(xì)胞中；第2min，靜置。第3min和第4min，在1min內(nèi)滴加1mlrpmi-1640培養(yǎng)基；第5min和第6min，在1min內(nèi)滴加2mlrpmi-1640培養(yǎng)基；第7min，每10s滴加1ml的rpmi-1640培養(yǎng)基。然后37℃溫浴5min。離心（800rpm，8min），棄上清，重懸入含20%胎牛血清、2%的50×hat的rpmi-1640篩選培養(yǎng)液中，按照200μl/孔加到96孔細(xì)胞板，置于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
（5）細(xì)胞篩選與細(xì)胞株建立：在細(xì)胞融合的第3天對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行rpmi-1640篩選培養(yǎng)液半換液，第5天進(jìn)行用含20%胎牛血清、1%的100×ht的rpmi-1640過渡培養(yǎng)液進(jìn)行全換液，在第7天取細(xì)胞上清進(jìn)行篩選。篩選分兩步：第一步先用ic-elisa篩選出陽性細(xì)胞孔，第二步選用異菌脲為標(biāo)準(zhǔn)品，用ic-elisa對(duì)陽性細(xì)胞進(jìn)行抑制效果測(cè)定。選擇對(duì)異菌脲標(biāo)準(zhǔn)品均有較好抑制的細(xì)胞孔，采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，用同樣的方法進(jìn)行檢測(cè)。重復(fù)三次，獲得細(xì)胞株zxl-2。
（6）單克隆抗體的制備與鑒定：取8～10周齡balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射無菌石蠟油1ml；7天后每只小鼠腹腔注射1×106雜交瘤細(xì)胞，從第7天開始收集腹水，將腹水通過辛酸-硫酸銨法純化。在偏酸條件下，正辛酸可以沉淀腹水中除igg免疫球蛋白外的其他雜蛋白，然后離心，棄沉淀；再用等量飽和度的硫酸銨溶液沉淀igg型的單克隆抗體，離心，棄上清，用0.01mpbs溶液（ph7.4）溶解后，透析脫鹽，最終得到純化后的單克隆抗體置于-20℃保存。
6.1包被：將包被原ipma-bsa用0.05mph9.6碳酸鹽緩沖液從1μg/ml開始倍比稀釋，100μl/孔，37℃反應(yīng)2h；
6.2洗滌：將板內(nèi)溶液傾去，并用洗滌液洗滌3次，每次3min；
6.3封閉：拍干后，加入200μl/孔封閉液，37℃反應(yīng)2h。洗滌后烘干備用；
6.4加樣：將抗血清從1︰1000開始倍比稀釋，并加入到各稀釋度的包被孔中，100μl/孔，37℃反應(yīng)30min；充分洗滌后，加入1︰3000稀釋的hrp-羊抗鼠igg，100μl/孔，37℃反應(yīng)30min；
6.5顯色：將酶標(biāo)板取出，充分洗滌后，每孔加入100μl的tmb顯色液，37℃避光反應(yīng)15min；
6.6終止和測(cè)定：每孔加入50μl終止液2mh2so4以終止反應(yīng)，然后用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的od450值。
用ic-elisa測(cè)定單克隆抗體異菌脲的ic50為5ng/ml，說明對(duì)異菌脲有很好的靈敏度，可用于異菌脲免疫分析檢測(cè)。
溶液的配置：碳酸鹽緩沖液（cbs）：稱取na2co31.59g，nahco32.93g，分別溶于少量雙蒸水后混合，加雙蒸水至約800ml混勻，調(diào)ph值至9.6，加雙蒸水定容至1000ml，4℃貯存?zhèn)溆茫?/p>
磷酸鹽緩沖液（pbs）：8.00gnacl，0.2gkcl，0.2gkh2po4，2.9gna2hpo4·12h2o，溶于800ml純水中，用naoh或hcl調(diào)ph到7.2～7.4，定容至1000ml；
pbst：含0.05%吐溫20的pbs；
tmb顯色液：a液：na2hpo4.12h2o18.43g，檸檬酸9.33g，純水定容至1000ml；b液：60mgtmb溶于100ml乙二醇中。a、b液按體積比1︰5混合即為tmb顯色液，現(xiàn)用現(xiàn)混。