本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種抑制腫瘤的短肽及其編碼基因與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

在全球范圍內(nèi)，癌癥都有著較高的發(fā)病率和致死率。近幾十年來，人類為治療癌癥付出了不懈的努力，對(duì)癌癥的研究主要集中在開發(fā)新的治療方法和減輕治療方法對(duì)病人的副作用?，F(xiàn)在常用的治療癌癥的方法主要是手術(shù)或者化療，但是很多情況下不僅不能高效的治療病人，并且還具有很高的并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)，一些治療癌癥的藥物不僅有多種副作用，而且還可能會(huì)引起多重耐藥。

抗腫瘤肽作為一種新型的治療癌癥的藥物，因?yàn)樗哂袑?duì)腫瘤細(xì)胞有選擇性，不易引起耐藥性等特點(diǎn)，正越來越受到人們的關(guān)注。

許多抗腫瘤肽是從自然界生物內(nèi)獲得的。這種直接來源于生物體內(nèi)的抗腫瘤肽一般肽鏈較長(zhǎng)，很難用化學(xué)法合成，難以純化，且具有結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，易失活等缺點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明人對(duì)自然界生物內(nèi)的多種天然多肽進(jìn)行特異性選擇和改變，通過大量的實(shí)驗(yàn)，最終獲得了一種能夠抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定不易失活的短肽，其僅由15個(gè)氨基酸組成，容易用化學(xué)法合成，具體氨基酸序列如seqidno：1所示（arg-ile-arg-asp-ala-ile-ala-his-gly-tyr-ile-val-asp-lys-val）。該短肽來源于凡納濱對(duì)蝦血藍(lán)蛋白，一般認(rèn)為血藍(lán)蛋白的主要生物學(xué)功能與機(jī)體內(nèi)的輸氧有關(guān)。雖然近年來有研究發(fā)現(xiàn)血藍(lán)蛋白有一定的抗腫瘤活性，但是凡納濱對(duì)蝦血藍(lán)蛋白分子量為75kd左右，包括662個(gè)氨基酸，難以用化學(xué)法合成，而且在體外結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，易失活。本申請(qǐng)發(fā)明人選擇地縮短了該蛋白的肽鏈長(zhǎng)度并進(jìn)行了多次優(yōu)化和實(shí)驗(yàn)，最終得到了本發(fā)明的抗腫瘤短肽。本發(fā)明抗腫瘤短肽具有廣譜性，對(duì)多種癌細(xì)胞具有抑制和殺傷作用，肽鏈長(zhǎng)度短，抗腫瘤活性高，而且穩(wěn)定不易失活

本發(fā)明還提供了上述抗腫瘤短肽的編碼基因。

本發(fā)明還提供了上述編碼基因的表達(dá)盒。

本發(fā)明還提供了上述編碼基因的重組菌。

本發(fā)明還提供了上述編碼基因的重組載體。

本發(fā)明還提供了上述編碼基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。

本發(fā)明還提供了上述多肽、編碼基因、重組載體或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系在制備抑制腫瘤的制劑中的用途。

作為對(duì)上述用途技術(shù)方案的進(jìn)一步限定，所述腫瘤為宮頸癌。

本發(fā)明還提供了一種用于治療腫瘤的制劑，其含有上述多肽、編碼基因、重組載體或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。

作為對(duì)上述制劑技術(shù)方案的進(jìn)一步限定，所述腫瘤為宮頸癌。

本發(fā)明的抗腫瘤短肽可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法合成，例如固相合成，并采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行純化，例如高效液相色譜法。本發(fā)明的抗腫瘤短肽具有廣譜性，對(duì)多種癌細(xì)胞具有抑制和殺傷作用，不僅抗腫瘤活性更高，而且穩(wěn)定不易失活。

附圖說明

圖1為本發(fā)明抑制腫瘤的短肽的高效液相色譜圖。

圖2為本發(fā)明抑制腫瘤的短肽的的質(zhì)譜圖。

圖3為本發(fā)明抑制腫瘤的短肽和血藍(lán)蛋白中其他短肽片段的抗腫瘤活性比較。

圖4為本發(fā)明抑制腫瘤的短肽和血藍(lán)蛋白的抗腫瘤活性比較。

圖5為本發(fā)明抑制腫瘤的短肽對(duì)腫瘤細(xì)胞形態(tài)的影響。

圖6為本發(fā)明抑制腫瘤的短肽誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

圖7為本發(fā)明抑制腫瘤的短肽使腫瘤細(xì)胞膜穿孔從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

具體實(shí)施方式

為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員了解，下述實(shí)施例不是對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，任何在本發(fā)明基礎(chǔ)上做出的改變和變化，都在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1：抑制腫瘤的短肽的固相合成、切割、純化及鑒定

本發(fā)明利用多肽合成儀采用固相合成法合成所述抑制腫瘤的短肽：

1)以dmf為溶劑，各種α-氨基被fmoc保護(hù)的氨基酸溶液的濃度為0.25m，hbtu溶液、hobt溶液的濃度為0.33m，哌啶溶液的濃度為200ml/l，diea溶液的濃度為174.2ml/l。

2)稱取0.05mmolfmoc-ala-wang樹脂(官能團(tuán)含量0.33mmol/g)置于固相反應(yīng)器中，加8mldcm溶脹過夜，減壓抽去溶劑。加入濃度為200ml/l的哌啶溶液8ml，室溫下反應(yīng)5min，抽干；再加入濃度為200ml/l的哌啶溶液8ml，室溫下反應(yīng)20min，抽干；依次用8ml的dmf洗滌3次，每次1min。準(zhǔn)確量取0.2mmol的α-氨基被fmoc保護(hù)的氨基酸溶液、0.2mmol的hbtu溶液、0.195mmol的hobt溶液加入固相反應(yīng)器中，反應(yīng)5min后加入0.4mmol的diea，室溫下氮?dú)鈿馀菡袷幏磻?yīng)2h。依次用8ml的dmf洗滌3次，每次1min。加入濃度為200ml/l的哌啶溶液8ml，室溫下反應(yīng)5min，抽干；再加入濃度為200ml/l的哌啶溶液8ml，室溫下反應(yīng)20min，抽干；依次以8ml的dmf洗滌3次，每次1min。按照如上步驟從肽鏈的碳端到氮端逐一連續(xù)合成了本發(fā)明的抑制腫瘤的短肽arg-ile-arg-asp-ala-ile-ala-his-gly-tyr-ile-val-asp-lys-val。

3)待合成完畢后，分別用dmf和dcm先后清洗連有多肽鏈的樹脂，后將樹脂至于真空干燥箱內(nèi)干燥備用。

抑制腫瘤的短肽的切割：

1)待樹脂干燥后，用刮刀將樹脂盡量打散，轉(zhuǎn)移至雞心瓶中，加入磁子，在冰水浴下緩慢加入用于脫除樹脂的切割液10ml(切割液中tfa：純水：苯甲硫醚：苯酚：乙二硫醇比例為82.5:5:5:5:2.5)，冰水浴下反應(yīng)2h。

2)待反應(yīng)完成，將反應(yīng)液連同樹脂一同轉(zhuǎn)移至過濾器中，用水泵抽濾，將得到的濾液置于圓底燒瓶中，并在氮?dú)饬飨麓蹈伞?/p>

3)待圓底燒瓶中的樣品吹至粘稠，撤下氮?dú)夤?，在圓底燒瓶中倒入約20ml的4℃冰乙醚，混合后充分打散，然后于冷凍離心機(jī)內(nèi)，4℃下8000r/min離心15min，棄上清，再于20ml的4℃冰乙醚中打散，離心；如此重復(fù)操作3次，將沉淀再次真空干燥，即得抑制腫瘤的短肽的粗品。

抑制腫瘤的短肽的純化及鑒定：

用反向高效液相色譜法對(duì)抗腫瘤肽進(jìn)行純化鑒定。采用c18半制備柱，流動(dòng)相：a相(水相)：去離子水(含0.1％tfa(m/v))；b相(有機(jī)相)：80％乙腈水溶液(含0.1％tfa(m/v))；流速：6ml/min；洗脫梯度：a相以每分鐘1％的變化從55％降到10％，b相以每分鐘1％的變化從45％升到90％。

根據(jù)高效液相色譜圖(見圖1)采集8-10min的洗脫液，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去洗脫液中的有機(jī)相乙腈，之后將剩余的抗腫瘤肽水溶液放入冰箱冷凍成冰塊，最后用冷凍干燥機(jī)除去水分，得到蓬松固體粉末，為抑制腫瘤的短肽純品。圖2為其質(zhì)譜圖。

實(shí)施例2：抑制腫瘤的短肽的抗腫瘤活性測(cè)定

（1）使用處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的人子宮頸癌細(xì)胞（hela），對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化、重懸得到細(xì)胞懸液，將細(xì)胞稀釋到50,000個(gè)/ml。在96孔板中每孔加入100μl，將鋪好的96孔板放入培養(yǎng)箱中，在37℃、5%co2條件下培養(yǎng)過夜（>8小時(shí)）。

（2）使用0.01mph7.4pbs溶解所述短肽為1mg/ml。用完全培養(yǎng)基稀釋短肽樣品至50μg/ml。將培養(yǎng)過夜的細(xì)胞培養(yǎng)基棄去，每孔加入50μg/ml的多肽100μl，每孔4個(gè)平行，重復(fù)3次。同時(shí)，用等體積的50μg/ml的5-fu和0.01mph7.4pbs作為陽性和陰性對(duì)照，在5%37^oc條件下分別培養(yǎng)18h。

（3）接著，吸棄培養(yǎng)液晾干，每孔加冰冷500g/l三氯醋酸50μl（終濃度為100g/l），固定60min后去離子水洗4~5次,干燥。

（4）之后，每孔加4g/lsrb100μl作用30min,10ml/l醋酸輕洗4次，甩干。

（5）最后，每孔加10mmol/ltris-base200μl在平板振蕩器上振蕩5min,酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定od值，按如下公式計(jì)算抑制率：抑制率(%)=(od0h/od18h-1)×100%

結(jié)果為對(duì)hela細(xì)胞抑制率有53%。

由上述結(jié)果可知，本發(fā)明的多肽對(duì)腫瘤細(xì)胞有顯著的抗腫瘤活性。

實(shí)施例3：抑制腫瘤的短肽和血藍(lán)蛋白中其他短肽片段的抗腫瘤活性比較

（1）合成12條不同血藍(lán)蛋白短肽片段，并分別命名為（b1，b2，b3，b9，b10，b13，b14，s7，s8，s9，s10），本發(fā)明的短肽命名為b11。

（2）使用處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的人子宮頸癌細(xì)胞（hela），對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化、重懸得到細(xì)胞懸液，將細(xì)胞稀釋到50,000個(gè)/ml。在96孔板中每孔加入100μl，將鋪好的96孔板放入培養(yǎng)箱中，在37℃、5%co2條件下培養(yǎng)過夜（>8小時(shí)）。

（3）使用0.01mph7.4pbs溶解所述短肽為1mg/ml。用完全培養(yǎng)基稀釋不同的短肽樣品至50μg/ml。將培養(yǎng)過夜的細(xì)胞培養(yǎng)基棄去，每孔加入50μg/ml的多肽100μl，每孔4個(gè)平行，重復(fù)3次。同時(shí)，用等體積的50μg/ml的5-fu和0.01mph7.4pbs作為陽性和陰性對(duì)照，在5%37^oc條件下分別培養(yǎng)18h。

（4）接著，吸棄培養(yǎng)液晾干，每孔加冰冷500g/l三氯醋酸50μl（終濃度為100g/l），固定60min后去離子水洗4~5次,干燥。

（5）之后，每孔加4g/lsrb100μl作用30min,10ml/l醋酸輕洗4次，甩干。

（6）最后，每孔加10mmol/ltris-base200μl在平板振蕩器上振蕩5min,酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定od值，按如下公式計(jì)算抑制率：抑制率(%)=(od0h/od18h-1)×100%

結(jié)果為本發(fā)明的短肽（b11）對(duì)hela細(xì)胞抑作用最強(qiáng)。圖3為抑制腫瘤的短肽和血藍(lán)蛋白中其他短肽片段的抗腫瘤活性比較。

實(shí)施例4：抑制腫瘤的短肽和血藍(lán)蛋白的抗腫瘤活性比較

（1）使用處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的人子宮頸癌細(xì)胞（hela），對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化、重懸得到細(xì)胞懸液，將細(xì)胞稀釋到50,000個(gè)/ml。在96孔板中每孔加入100μl，將鋪好的96孔板放入培養(yǎng)箱中，在37℃、5%co2條件下培養(yǎng)過夜（>8小時(shí)）。

（2）使用0.01mph7.4pbs溶解所述短肽為1mg/ml。用完全培養(yǎng)基稀釋短肽（b11）樣品至50μg/ml，將血藍(lán)蛋白（hmc）稀釋成50μg/ml。將培養(yǎng)過夜的細(xì)胞培養(yǎng)基棄去，每孔加入50μg/ml的多肽或血藍(lán)蛋白100μl，每孔4個(gè)平行，重復(fù)3次。同時(shí)，用等體積的50μg/ml的5-fu和0.01mph7.4pbs作為陽性和陰性對(duì)照，在5%37^oc條件下分別培養(yǎng)18h。

（3）接著，吸棄培養(yǎng)液晾干，每孔加冰冷500g/l三氯醋酸50μl（終濃度為100g/l），固定60min后去離子水洗4~5次,干燥。

（4）之后，每孔加4g/lsrb100μl作用30min,10ml/l醋酸輕洗4次，甩干。

（5）最后，每孔加10mmol/ltris-base200μl在平板振蕩器上振蕩5min,酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定od值，按如下公式計(jì)算抑制率：抑制率(%)=(od0h/od18h-1)×100%

結(jié)果為本發(fā)明的肽（b11）比血藍(lán)蛋白（hmc）對(duì)hela細(xì)胞有更強(qiáng)的生長(zhǎng)抑制作用。圖4為抑制腫瘤的短肽和血藍(lán)蛋白的抗腫瘤活性比較。

實(shí)施例5：抑制腫瘤的短肽對(duì)腫瘤細(xì)胞形態(tài)的影響

（1）使用處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的人子宮頸癌細(xì)胞（hela），對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化、重懸得到細(xì)胞懸液，將細(xì)胞稀釋到50,000個(gè)/ml。在96孔板中每孔加入100μl，將鋪好的96孔板放入培養(yǎng)箱中，在37℃、5%co2條件下培養(yǎng)過夜（>8小時(shí)）。

（2）使用0.01mph7.4pbs溶解所述短肽為1mg/ml。用完全培養(yǎng)基稀釋短肽樣品至50μg/ml。將培養(yǎng)過夜的細(xì)胞培養(yǎng)基棄去，每孔加入50μg/ml的多肽100μl，每孔4個(gè)平行，重復(fù)3次。同時(shí)，用等體積的50μg/ml的5-fu和0.01mph7.4pbs作為陽性和陰性對(duì)照，在5%37^oc條件下分別培養(yǎng)24h。

（3）利用普通倒置顯微鏡觀察拍照記錄細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果為與陰性對(duì)照相比，其中短肽樣品組hela細(xì)胞數(shù)目明顯較少，同時(shí)細(xì)胞發(fā)生皺縮，變圓，并出現(xiàn)抱團(tuán)現(xiàn)象。圖5顯示了抑制腫瘤的短肽對(duì)腫瘤細(xì)胞（hela）形態(tài)的影響。

實(shí)施例6：抑制腫瘤的短肽可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡

（1）凋亡檢測(cè)采用流式細(xì)胞儀，使用annexinv-fitc凋亡檢測(cè)試劑盒（北京，碧云天）。簡(jiǎn)要如下：

（2）使用處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的人子宮頸癌細(xì)胞（hela），對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化、重懸得到細(xì)胞懸液，將細(xì)胞稀釋到100,000個(gè)/ml。在24孔板中每孔加入1ml，將鋪好的24孔板放入培養(yǎng)箱中，在37℃、5%co2條件下培養(yǎng)過夜（>8小時(shí)）。

（3）使用0.01mph7.4pbs溶解所述短肽為1mg/ml。用完全培養(yǎng)基稀釋短肽樣品至50μg/ml。將培養(yǎng)過夜的細(xì)胞培養(yǎng)基棄去，每孔加入50μg/ml的多肽1ml。同時(shí)，用等體積的50μg/ml的5-fu和0.01mph7.4pbs作為陽性和陰性對(duì)照，在5%37^oc條件下分別培養(yǎng)8-48h。

（4）接著，收集細(xì)胞，用pbs洗滌3次，用195μl結(jié)合液重懸細(xì)胞，加入5μlannexinv-fitc和10μlpi在室溫下避光染色15min。

（5）用bd生物公司c6流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

結(jié)果為短肽樣品可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞（hela）發(fā)生凋亡。圖6顯示抑制腫瘤的短肽誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

實(shí)施例7：抑制腫瘤的短肽可造成細(xì)胞膜穿孔從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

（1）使用處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的人子宮頸癌細(xì)胞（hela），對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化、重懸得到細(xì)胞懸液，將細(xì)胞稀釋到100,000個(gè)/ml。細(xì)胞加入在含有用多聚賴氨酸包被的載玻片的24孔板中，每孔加入1ml，將鋪好的24孔板放入培養(yǎng)箱中，在37℃、5%co2條件下培養(yǎng)過夜（>8小時(shí)）。

（2）使用0.01mph7.4pbs溶解所述短肽為1mg/ml。用完全培養(yǎng)基稀釋短肽樣品至50μg/ml。將培養(yǎng)過夜的細(xì)胞培養(yǎng)基棄去，每孔加入50μg/ml的多肽1ml。同時(shí)，用等體積的50μg/ml的5-fu和0.01mph7.4pbs作為陽性和陰性對(duì)照，在5%37^oc條件下分別培養(yǎng)8-24h。

（3）接著，吸棄培養(yǎng)液，用pbs洗滌2遍，用2.5%戊二醛4^oc固定2h。用pbs漂洗2次，每次10min。然后樣品用乙醇脫水處理，即依次用30%，50%，70%，80%，90%，95%，100%處理，每個(gè)濃度處理2次，每次15分鐘。

（4）然后，樣品用乙腈干燥處理，即依次用50%，70%，80%，90%，95%，100%處理，每個(gè)處理15分鐘，之后真空干燥，然后噴金，并用jsm6360la掃描電鏡觀察。結(jié)果為短肽樣品可造成腫瘤細(xì)胞膜穿孔。圖7顯示抑制腫瘤的短肽可造成細(xì)胞膜穿孔。

序列表

<110>汕頭大學(xué)

<120>一種抑制腫瘤的短肽及其編碼基因

<160>1

<210>1

<160>15

<212>prt

<213>人工合成

<400>1

arg-ile-arg-asp-ala-ile-ala-his-gly-tyr-ile-val-asp-lys-val

151015