本發(fā)明屬于鐵皮石斛加工領(lǐng)域，具體涉及一種制備具有體外抗氧化活性的鐵皮石斛低聚糖的方法。

背景技術(shù)：

鐵皮石斛是蘭科石斛屬氣生蘭科的名貴藥用草本植物，具有益胃生津、滋陰清熱、潤(rùn)肺止咳、延年益壽等功效及增強(qiáng)免疫力、抗氧化、降血糖、降血脂、防癌抗癌等神奇的功效。鐵皮石斛的傳統(tǒng)加工仍以石斛鮮條、鐵皮楓斗、石斛超微粉等粗放型為主。我國(guó)鐵皮石斛精深加工業(yè)的發(fā)展速度相當(dāng)緩慢，且缺乏技術(shù)的深度創(chuàng)新，已難以適應(yīng)現(xiàn)代鐵皮石斛種植業(yè)的發(fā)展。因此，如何推動(dòng)鐵皮石斛精深加工業(yè)發(fā)展是目前亟待解決的關(guān)鍵問題之一。石斛莖中含有多種生物堿、多糖、氨基酸及淀粉等。石斛多糖屬于活性多糖的一種，具有抗炎、抗病毒、修復(fù)自身提高免疫力的功效，一直被選作鐵皮石斛深加工研究的主要對(duì)象，包括多糖的提取、結(jié)構(gòu)分離及活性功能評(píng)價(jià)等，而將鐵皮石斛多糖降解成為小分子低聚糖的研究較少。眾所周知，低聚糖也具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖及提高免疫力等功效，且有研究證實(shí)某些特殊結(jié)構(gòu)的低聚糖功能性強(qiáng)于活性多糖，而且專一性更高、可吸收性更好等特點(diǎn)。因此，借助鐵皮石斛中重要的活性多糖成分制備小分子低聚糖，是提升鐵皮石斛多糖應(yīng)用層次的新思路，有望推動(dòng)鐵皮石斛精深加工業(yè)發(fā)展，具有現(xiàn)實(shí)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述問題，本發(fā)明提供了一種制備具有體外抗氧化活性的鐵皮石斛低聚糖的方法。本發(fā)明通過酶解法制備了鐵皮石斛低聚糖，提高了鐵皮石斛的抗氧化活性。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種制備具有體外抗氧化活性的鐵皮石斛低聚糖的方法，所述方法利用酶直接酶解鐵皮石斛制備鐵皮石斛低聚糖。

所述方法包括以下步驟：

磨粉：將鐵皮石斛鮮條放置于烘箱中烘干后用萬能粉碎機(jī)破碎，并過60目分離篩得鐵皮石斛干粉備用；

溶解：將鐵皮石斛干粉溶解在磷酸鹽緩沖液中得鐵皮石斛干粉液，濃度為g/ml；

限制性酶解：向鐵皮石斛干粉液中加入一定量酶制劑酶解一段時(shí)間后得酶解液；

滅酶：將酶解液100～150℃滅菌時(shí)間4～10min，使剩余酶制劑失去活性；

過濾：將滅酶后的酶解液5000～10000rpm離心5～10min取上清液；

濃縮：將上清液濃縮10-100倍得鐵皮石斛低聚糖。

所述酶解中，酶為β-甘露聚糖酶與纖維素酶復(fù)配的復(fù)合酶，β-甘露聚糖酶與纖維素酶的配比為2:1，復(fù)合酶添加量為12u/ml，酶解溫度為40℃，酶解ph值為6.0，酶解時(shí)間為8h。

所述方法制備得到的鐵皮石斛低聚糖的dpph清除率可達(dá)23.7％，總抗氧化活性可達(dá)0.65u/ml。

所述方法制備得到的鐵皮石斛低聚糖是以低聚甘露糖為主的低聚糖混合物。

所述酶選自甘露聚糖酶、纖維素酶、纖維二糖酶、葡聚糖酶、木聚糖酶中的至少一種。

所述酶解中，酶的添加量為1u/ml-20u/ml。

所述酶解中，酶解ph值為5.0-8.0。

所述酶解中，酶解溫度控制為30℃-50℃。

所述酶解中，酶解時(shí)間控制為1h-24h。

本發(fā)明的有益技術(shù)效果：本發(fā)明方法制備了鐵皮石斛低聚糖，該方法簡(jiǎn)單，可實(shí)施行強(qiáng)，制備得到的鐵皮石斛低聚糖的dpph清除率可達(dá)23.7％，總抗氧化活性可達(dá)0.65u/ml。

附圖說明

圖1、不同加酶量對(duì)鐵皮石斛水解產(chǎn)物抗氧化活性的影響；

圖2、不同初始ph對(duì)鐵皮石斛水解產(chǎn)物抗氧化活性的影響；

圖3、酶解溫度對(duì)鐵皮石斛水解產(chǎn)物抗氧化活性的影響；

圖4、不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)鐵皮石斛水解產(chǎn)物抗氧化活性的影響。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)描述。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用于解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

相反，本發(fā)明涵蓋任何由權(quán)利要求定義的在本發(fā)明的精髓和范圍上做的替代、修改、等效方法以及方案。進(jìn)一步，為了使公眾對(duì)本發(fā)明有更好的了解，在下文對(duì)本發(fā)明的細(xì)節(jié)描述中，詳盡描述了一些特定的細(xì)節(jié)部分。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說沒有這些細(xì)節(jié)部分的描述也可以完全理解本發(fā)明。

實(shí)施例1

將鐵皮石斛鮮條放置于烘箱中烘干后用萬能粉碎機(jī)將其破碎并過60目分離篩備用。

取1g鐵皮石斛干粉置100ml錐形瓶中，加入50ml的磷酸鹽緩沖液中混勻，添加12u/ml的酶制劑進(jìn)行酶解，酶解溫度為40℃，酶解時(shí)間為8h，酶解后將樣品放置于沸水中蒸煮5min以滅酶活，離心酶解產(chǎn)物留取上清液，將上清液濃縮至1ml，最后測(cè)定各樣品的體外抗氧化活性。

其中，磷酸鹽緩沖液的ph為6.0；酶制劑為β-甘露聚糖酶與纖維素酶的復(fù)合物，配比為2:1。

在上述條件下酶解之后，所得結(jié)果如下：

在上述酶解條件下所得的酶解鐵皮石斛產(chǎn)物的dpph清除率可達(dá)23.7％，總抗氧化活性為0.65u/ml。

鐵皮石斛水解物多糖主要測(cè)定體外抗氧化活性，包括dpph自由基清除率和總抗氧化活力等。具體方法如下：

dpph自由基清除率的測(cè)定：取500μl的低聚糖混合液加入500μldpph無水乙醇溶液(0.2mg/ml)后，混合振蕩，黑暗中放置30min后以蒸餾水為空白溶液，517nm處測(cè)定吸光度值b1；以無水乙醇代替dpph乙醇溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定樣品溶液本底的吸光度值b2；以蒸餾水代替樣品溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定空白對(duì)照溶液的吸光度值b0。計(jì)算公式為：dpph自由基清除率(％)＝(b1-b2)/b0*100。

參照總抗氧化能力(t-aoc)測(cè)定試劑盒中的操作方法：向離心管中依次加入試劑一0.5ml，低聚糖混合液0.5ml，試劑二應(yīng)用液1ml，試劑三應(yīng)用液0.25ml后，用渦旋振蕩器充分混勻，37℃水浴30min，取出加入0.05ml的試劑四混勻，放置10min，用雙蒸水調(diào)零，于波長(zhǎng)520nm處測(cè)定各管吸光度值。對(duì)照組中，不同濃度的低聚糖混合液在水浴后加入，加入量不變，其它溶液的加入順序不變。計(jì)算公式如下：總抗氧化能力(單位/毫升)＝(od測(cè)定值-od對(duì)照值)/0.01/30*反應(yīng)液總量/取樣量/樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù)。

實(shí)施例2

將鐵皮石斛鮮條放置于烘箱中烘干后用萬能粉碎機(jī)將其破碎并過60目分離篩備用。

取1g鐵皮石斛干粉置100ml錐形瓶中，加入50ml的磷酸鹽緩沖液中混勻，添加5u/ml的酶制劑進(jìn)行酶解，酶解溫度為30℃，酶解時(shí)間為12h，酶解后將樣品放置于沸水中蒸煮5min以滅酶活，離心酶解產(chǎn)物留取上清液，將上清液濃縮至1ml，最后測(cè)定各樣品的體外抗氧化活性。

其中，磷酸鹽緩沖液的ph為7.0；酶制劑為單一β-甘露聚糖酶。

在上述條件下酶解之后，所得結(jié)果如下：

在上述酶解條件下所得的酶解鐵皮石斛產(chǎn)物的dpph清除率可達(dá)15.6％，總抗氧化活性為0.32u/ml。

實(shí)施例3

將鐵皮石斛鮮條放置于烘箱中烘干后用萬能粉碎機(jī)將其破碎并過60目分離篩備用。取1g鐵皮石斛干粉置100ml錐形瓶中，加入50ml的磷酸鹽緩沖液中混勻，添加一定量的酶制劑進(jìn)行酶解，酶解溫度為30℃，酶解時(shí)間為12h，酶解后將樣品放置于沸水中蒸煮5min以滅酶活，離心酶解產(chǎn)物留取上清液，將上清液濃縮置1ml左右即可。

分別選取不同酶水解鐵皮石斛并測(cè)定了其酶解產(chǎn)物體外抗氧化活性，結(jié)果如表1所示。

表1、不同種類酶對(duì)鐵皮石斛水解產(chǎn)物抗氧化活性的影響

結(jié)果表明，選用的幾種酶均能直接水解鐵皮石斛，水解產(chǎn)物均具備體外抗氧化活性，其中以甘露聚糖酶的作用最為顯著，其次為纖維素酶的水解產(chǎn)物。自由基的清除率分別為15.6％和11.2％，總抗氧化活力分別為0.32u/ml和0.28u/ml。甘露聚糖酶及纖維素酶主要被用來水解以甘露糖及葡萄糖以β-1,4糖苷鍵連接而成的聚糖類物質(zhì)。多糖是鐵皮石斛中最為主要的功能活性成分之一，很多鐵皮石斛品種中的多糖是由甘露糖及葡萄糖為主的單糖連接而成，以此當(dāng)選擇甘露聚糖酶和纖維素酶為水解酶時(shí)鐵皮石斛水解產(chǎn)物最多。

實(shí)施例4

分別選取不同酶水解鐵皮石斛并測(cè)定了其酶解產(chǎn)物體外抗氧化活性，結(jié)果如表2所示。酶選用不同比例的甘露聚糖酶和纖維素酶。酶解過程中酶解溫度為30℃，酶解ph值為7.0，酶解時(shí)間為12h。

表2、酶的不同比例對(duì)鐵皮石斛水解產(chǎn)物抗氧化活性的影響

實(shí)施例5

不同酶的添加量的體外抗氧化活性如圖1所示。選用的酶為甘露聚糖酶與纖維素酶的復(fù)合酶(配比為2:1)，酶解溫度為30℃，酶解ph值為7.0，酶解時(shí)間為12h。

當(dāng)加酶量增加時(shí)水解產(chǎn)物的自由基清除率及總抗氧化活力均不斷提高，添加至12u/ml時(shí)效果最好，此時(shí)自由基清除率為20.5％，總抗氧化活力為0.54u/ml。

實(shí)施例6

不同酶解過程ph對(duì)體外抗氧化活性如圖2所示。選用的酶為甘露聚糖酶與纖維素酶的復(fù)合酶(配比為2:1)，酶解溫度為30℃，酶添加量為12u/ml，酶解時(shí)間為12h。

結(jié)果顯示不同ph值對(duì)酶解反應(yīng)的影響不同，隨著ph的增高，鐵皮石斛酶解產(chǎn)物的抗氧化活性呈現(xiàn)先增高再降低的趨勢(shì)。當(dāng)ph升高至6.0時(shí)活性最高，自由基清除率為21.5％，總抗氧化活力為0.56u/ml。當(dāng)ph過低或過高時(shí)都會(huì)直接影響水解產(chǎn)物的生成，制約其抗氧化活性的高低，在不合適的ph條件下水解酶的活性不穩(wěn)定，出現(xiàn)失活情況，影響了酶解反應(yīng)的正常作用。

實(shí)施例7

不同酶解溫度對(duì)體外抗氧化活性如圖3所示。選用的酶為甘露聚糖酶與纖維素酶的復(fù)合酶(配比為2:1)，酶解ph為6.0，酶添加量為12u/ml，酶解時(shí)間為12h。

溫度對(duì)鐵皮石斛酶解反應(yīng)的影響很大，過低的溫度限制了酶的反應(yīng)速率，降低了水解的效率，而過高的反應(yīng)溫度又導(dǎo)致作用酶出現(xiàn)失活現(xiàn)象，使酶促反應(yīng)停止。

實(shí)施例8

不同酶解時(shí)間對(duì)體外抗氧化活性如圖4所示。選用的酶為甘露聚糖酶與纖維素酶的復(fù)合酶(配比為2:1)，酶解ph為6.0，酶添加量為12u/ml，酶解溫度為40℃。

隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，鐵皮石斛水解產(chǎn)物的抗氧化活性逐漸提高，反應(yīng)至8h后趨于穩(wěn)定，再進(jìn)一步延長(zhǎng)水解時(shí)間也不能顯著提高抗氧化活性。當(dāng)水解至8h時(shí)自由基清除率為23.7％，總抗氧化活力為0.65u/ml。說明鐵皮石斛能夠在以上條件下被直接水解，且水解產(chǎn)物具備明顯的體外抗氧化功能。