本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于冬蟲夏草真?zhèn)舞b定的二重pcr檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

冬蟲夏草(ophiocordycepssinensissym.cordyceps)為麥角菌科真菌冬蟲夏草菌寄生在鱗翅目蝙蝠蛾科昆蟲蝙蝠蛾幼蟲上的子座(子實(shí)體)及幼蟲尸體的復(fù)合體。它是藥食兩用的名貴滋補(bǔ)藥材，主要分布于青藏高原海拔3000m的雪線以上的地區(qū)，具有補(bǔ)肺益腎、平喘祛痰、鎮(zhèn)靜提神、強(qiáng)心壯血的功效，在增強(qiáng)免疫力、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化炎癥等方面均具有較好的藥理作用，具有極高的藥用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。由于其對(duì)生長(zhǎng)地理環(huán)境的特殊要求，及其嚴(yán)格的寄生性，無(wú)法進(jìn)行人工培植和規(guī)?；a(chǎn)替代，自然資源十分稀少，市場(chǎng)供給極為短缺。加之近年來(lái)對(duì)野生蟲草的過(guò)渡采挖極大地破壞了蟲草生境，蟲草資源逐年驟減，使其得顯得十分珍貴，價(jià)格昂貴。在利益的驅(qū)使下，不法商販采取摻假、造假的手段牟利，從而使市場(chǎng)上充斥著各種各樣的偽品。常見(jiàn)的有亞香棒蟲草、涼山蟲草、新疆蟲草、地蠶及模制仿品等，這些偽品外觀與冬蟲夏草相似，但藥用價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值相差甚遠(yuǎn)，對(duì)蟲草的用藥安全造成極大的威脅。因此，冬蟲夏草真?zhèn)舞b定對(duì)于肅清和純凈市場(chǎng)，維護(hù)消費(fèi)者權(quán)益具有非常重要的意義。

近些年，隨著中藥鑒定學(xué)研究和中藥標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程的不斷發(fā)展，中藥鑒定新技術(shù)、新方法不斷應(yīng)用，尤其分子生物學(xué)方法的引入，中藥品種混亂的現(xiàn)象得到了極大的改觀。冬蟲夏草真?zhèn)舞b定可通過(guò)性狀鑒定法、顯微鑒定法、理化鑒定法等傳統(tǒng)鑒定方法以及近年來(lái)發(fā)展的分子技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。由于蟲草性狀及其中活性成分含量受到其生長(zhǎng)條件、采收時(shí)間、貯藏等因素的影響而發(fā)生變化，采用傳統(tǒng)方法容易受到干擾而影響鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。且傳統(tǒng)的這幾種方法對(duì)親緣關(guān)系較近的物種難以區(qū)分，且需要長(zhǎng)期經(jīng)驗(yàn)積累，鑒定結(jié)果受主觀判斷力影響極大，或受專業(yè)領(lǐng)域的局限。以核酸和蛋白為基礎(chǔ)的分子檢測(cè)技術(shù)具有專一性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，且不受個(gè)體形態(tài)、大小和完整性的影響，目前已廣泛用于檢測(cè)及鑒定工作中。但目前冬蟲夏草真?zhèn)舞b定分子檢測(cè)技術(shù)的報(bào)道很少，現(xiàn)有的相關(guān)研究主要集中于其無(wú)性型的分離和鑒定(楊靜，2005；liangetal.，2008；zhongetal.，2010；leietal.，2013)。2015年陳士林報(bào)道了采用dna條形碼技術(shù)對(duì)冬蟲夏草真實(shí)性進(jìn)行鑒定的方法，采用真菌通用its5f/4r引物得到its2序列，通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)中冬蟲夏草its2序列比對(duì)來(lái)鑒定受檢樣品的真實(shí)屬性。冬蟲夏草是一種復(fù)型真菌，根據(jù)其所處的不同階段，分為有性型(子囊孢子階段)和無(wú)性型(分生孢子階段)。通常所指的冬蟲夏草是它的有性型，換句話說(shuō)，體現(xiàn)其商品性的是整個(gè)菌與蟲復(fù)合體。同一種真菌寄生于不同寄主上，或不同種真菌寄生于同一寄主上，產(chǎn)生的外形相似的復(fù)合體就可能作為偽品與正品混淆，而這樣的情況極大可能出現(xiàn)在冬蟲夏草與其偽品之間。因此，僅針對(duì)其真菌(包括其無(wú)性型)進(jìn)行鑒定來(lái)判斷冬蟲夏草真?zhèn)问遣粔虻?，?yīng)該同時(shí)結(jié)合對(duì)其寄主的鑒定。

因此同時(shí)針對(duì)冬蟲夏草中蟲草菌及其寄主蝙蝠蛾特異核酸片段，建立一種準(zhǔn)確性高，簡(jiǎn)單適用，易于推廣的冬蟲夏草高特異性pcr檢測(cè)方法，可以有效區(qū)別冬蟲夏草與偽品，或探及含有冬蟲夏草成分的產(chǎn)品，成為了本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題是：提供一種用于冬蟲夏草真?zhèn)舞b定的二重pcr檢測(cè)方法，同時(shí)針對(duì)冬蟲夏草中蟲草菌及其寄主，并綜合考慮遺傳多樣性及冬蟲夏草菌寄主專一性但非唯一的特點(diǎn)，根據(jù)冬蟲夏草中蟲草菌its及其寄主蝙蝠蛾coi基因序列分別設(shè)計(jì)兩對(duì)兼并引物，在同一pcr反應(yīng)體系中實(shí)現(xiàn)對(duì)冬蟲夏草高特異性檢測(cè)，解決了現(xiàn)有技術(shù)中僅針對(duì)其真菌(包括其無(wú)性型)來(lái)建立冬蟲夏草鑒定技術(shù)缺乏足夠準(zhǔn)確性的問(wèn)題。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明所述的一種用于冬蟲夏草真?zhèn)舞b定的二重pcr檢測(cè)方法，在同一個(gè)pcr反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)冬蟲夏草中蟲草菌的its和所述蟲草菌寄主的coi基因核酸片段，用于鑒定所述coi基因核酸片段的擴(kuò)增引物組為：

coi-f：ggaaatcchggatctttaatt

coi-r：gatgccccmgartgtgcaat；

用于鑒定所述its的擴(kuò)增引物組為：

cits-f10’：gttgcctcggcgggac

cits-r10’-2：cmtttgcttgcttcttgactgag。

進(jìn)一步地，該方法包括以下步驟：

步驟1：合成引物組：合成所述用于鑒定its基因的擴(kuò)增引物組和用于鑒定coi核酸片段的擴(kuò)增引物組；

步驟2：制備dna稀釋液；

步驟3：配制pcr反應(yīng)體系；

步驟4：pcr及電泳檢測(cè)。

進(jìn)一步地，步驟1合成的引物濃度均為10μmol/l。

進(jìn)一步地，步驟2中dna稀釋液的濃度為50ng/μl。

進(jìn)一步地，步驟3中配制pcr反應(yīng)體系，即將步驟2所得的dna稀釋液加入到25μlpcr反應(yīng)體系中，所述pcr反應(yīng)體系包括以下組分：

進(jìn)一步地，步驟4中pcr的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5～10min，1個(gè)循環(huán)；95℃變性15s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)；然后延展72℃延伸5～7min。

進(jìn)一步地，步驟4中的電泳檢測(cè)為將pcr反應(yīng)后所得的擴(kuò)增產(chǎn)物用2.5％瓊脂糖凝膠70v電泳40min后凝膠成像儀照相分析。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

(1)本發(fā)明方法簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，針冬蟲夏草的鑒別特異性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，適宜推廣。

(2)本發(fā)明首次考慮到冬蟲夏草嚴(yán)格的寄生性的特點(diǎn)以及菌與蟲的復(fù)合體是冬蟲夏草商品性存在的前提，同時(shí)針對(duì)冬蟲夏草中蟲草菌及其寄主蝙蝠蛾來(lái)設(shè)計(jì)其真?zhèn)舞b定的pcr引物。并將針對(duì)蟲草菌its和其寄主的coi基因兩個(gè)不同靶標(biāo)序列的兩對(duì)引物放在同一個(gè)pcr反應(yīng)體系中，建立高特異性二重pcr檢測(cè)技術(shù)體系，可以有效區(qū)別冬蟲夏草與偽品，并探及含有冬蟲夏草成分的產(chǎn)品。

(3)本發(fā)明充分考慮到冬蟲夏草菌遺傳多態(tài)性和寄主非唯一性的特點(diǎn)，采用了兼并引物，保證方法的準(zhǔn)確性和有效性。根據(jù)genbank中77條冬蟲夏草its序列及其古尼蟲草、亞香棒蟲草、新疆蟲草的its序列，在冬蟲夏草菌保守穩(wěn)定但與其他幾個(gè)偽品序列差異較大的序列區(qū)域，以及寄主鉤蝠蛾屬(thitarodes)、無(wú)鉤蝠蛾屬(ahamus)、蝠蛾屬(hepialus)、擬蝠蛾屬(parahepialus)coi基因保守穩(wěn)定但與其他幾個(gè)近似屬差異較大的序列區(qū)域，分別設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，建立針對(duì)冬蟲夏草的檢測(cè)鑒定pcr方法。在保守序列段存在變異的堿基位置采用兼并堿基方法，也即設(shè)計(jì)兼并引物以保證所建立方法可以探及所有冬蟲夏草菌及其可能的寄主，本發(fā)明方法可以精準(zhǔn)有效地檢測(cè)到所有冬蟲夏草(原草)及含有冬蟲夏草成分的產(chǎn)品。

(4)本發(fā)明直接以基因組dna為模板進(jìn)行pcr反應(yīng)，流程少、操作簡(jiǎn)單，穩(wěn)定，檢測(cè)成本低，易推廣至普通檢測(cè)機(jī)構(gòu)中運(yùn)用，具有更強(qiáng)的適用性。

(5)本發(fā)明為蟲草真?zhèn)舞b定技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化奠定基礎(chǔ)，對(duì)于有效打擊制假、售假的不法行為，保障消費(fèi)大眾食藥用安全，具有重要意義。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明流程圖

圖2為本發(fā)明特異性檢測(cè)冬蟲夏草的結(jié)果示意圖。

圖3為本發(fā)明對(duì)冬蟲夏草真實(shí)性檢測(cè)穩(wěn)定性驗(yàn)證結(jié)果示意圖。

其中附圖1中對(duì)應(yīng)的標(biāo)記名稱為：m-2000marker(天根)，1-蟲草陽(yáng)性對(duì)照(標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))，2-空白對(duì)照，3-冬蟲夏草，4-蝙蝠蛾幼蟲，5-蟲草菌絲，6-亞香棒蟲草，7-涼山蟲草，8-新疆蟲草，9-蟲草花(北蟲草)，10-淀粉模制偽品，11-玉米，12-水稻，13-大豆，14-油菜，15-雞，16-豬。

附圖2中對(duì)應(yīng)的標(biāo)記名稱為：m-2000marker(天根)，1-冬蟲夏草陽(yáng)性對(duì)照品(標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))，2-空白對(duì)照，3～9-來(lái)自西藏七個(gè)地區(qū)的冬蟲夏草樣品，10～15-來(lái)自青海的六個(gè)冬蟲夏草樣品，16-來(lái)自四川的冬蟲夏草樣品。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖說(shuō)明和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，本發(fā)明的方式包括但不僅限于以下實(shí)施例。

如圖1所示，一種用于冬蟲夏草真?zhèn)舞b定的二重pcr檢測(cè)方法，在同一個(gè)pcr反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)蟲草菌的its和蟲草菌寄主的coi基因核酸片段，用于鑒定所述coi基因核酸片段的擴(kuò)增引物組為：

coi-f：ggaaatcchggatctttaatt

coi-r：gatgccccmgartgtgcaat；

用于鑒定所述its的擴(kuò)增引物組為：

cits-f10’：gttgcctcggcgggac

cits-r10’-2：cmtttgcttgcttcttgactgag。

該方法包括以下步驟：

步驟1：合成引物組：合成用于鑒定its的擴(kuò)增引物組和用于鑒定coi基因核酸片段的擴(kuò)增引物組；

步驟2：制備dna稀釋液；

步驟3：配制pcr反應(yīng)體系；

步驟4：pcr及電泳檢測(cè)。

步驟1合成的引物濃度均為10μmol/l。

步驟2中dna稀釋液的濃度為50ng/μl。

步驟3中配制pcr反應(yīng)體系，即將步驟2所得的dna稀釋液加入到25μlpcr反應(yīng)體系中，pcr反應(yīng)體系包括以下組分：

步驟4中pcr的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5～10min，1個(gè)循環(huán)；95℃變性15s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)；然后延展72℃延伸5～7min。

步驟4中的電泳檢測(cè)為將pcr反應(yīng)后所得的擴(kuò)增產(chǎn)物用2.5％瓊脂糖凝膠70v電泳40min后凝膠成像儀照相分析。

實(shí)施例1

冬蟲夏草二重pcr鑒別方法，在同一個(gè)pcr反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)蟲草菌的its和蟲草菌寄主的coi基因核酸片段，步驟如下：

步驟1：合成用于鑒定its的擴(kuò)增引物組，該擴(kuò)增引物組為：

cits-f10’：gttgcctcggcgggac

cits-r10’-2：cmtttgcttgcttcttgactgag。

合成用于鑒定coi基因核酸片段的擴(kuò)增引物組，該擴(kuò)增引物組為：

coi-f：ggaaatcchggatctttaatt

coi-r：gatgccccmgartgtgcaat。

兩組引物的濃度均為10μmol/l。

步驟2：制備dna稀釋液；

待測(cè)樣品dna稀釋液：從待測(cè)樣品中提取dna，并稀釋為50ng/μl的dna稀釋液；

陽(yáng)性對(duì)照品dna稀釋液：從從冬蟲夏草陽(yáng)性對(duì)照品(標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院)提取dna，并稀釋為50ng/μl的dna稀釋液溶液；

空白對(duì)照：滅菌純水(h2o)作為空白對(duì)照。

步驟3：配制pcr反應(yīng)體系；

將步驟2制備好的dna稀釋液加入25μl反應(yīng)體系中即可。

以上25μl反應(yīng)體系包括以下組分：

本實(shí)施例中采用的pcr試劑為taqpcrmastermix(abi，canada)。也可采用quickhsdyemix(toyoboco.，ltd.，osaka，japan)或multiplexpcrkit(qiagengroup，sample&assaytechnologies，japan)?？筛鶕?jù)不同試劑采用相應(yīng)pcr反應(yīng)體系。

步驟4：pcr擴(kuò)增和電泳檢測(cè)分析：

pcr的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5～10min，1個(gè)循環(huán)；95℃變性15s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)；然后延展72℃延伸5～7min。

本實(shí)施例中采用的是abi公司生產(chǎn)的pcr儀(abiappliedbiosystemsveriti96wellthermalcycler儀器)或eppendorf公司生產(chǎn)的pcr儀(eppendorfmastercycler)。

電泳檢測(cè)分析：擴(kuò)增完畢后，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，并根據(jù)是否擴(kuò)增出兩條目標(biāo)條帶而判定樣品中是否存在冬蟲夏草成分。

該步驟中，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物用2.5％瓊脂糖凝膠電泳分析。

本實(shí)施例中的引物組是基于冬蟲夏草中冬蟲夏草菌its及其寄主蝙蝠蛾coi基因特定位點(diǎn)設(shè)計(jì)，通過(guò)該設(shè)計(jì)分別擴(kuò)增113bp和302bp大小的目標(biāo)片段，可以精準(zhǔn)有效地檢測(cè)到所有冬蟲夏草(原草)及含有冬蟲夏草成分的產(chǎn)品。

擴(kuò)增結(jié)果分析：若陽(yáng)性對(duì)照和待檢測(cè)樣品均擴(kuò)增出二條目標(biāo)條帶，而空白對(duì)照未出現(xiàn)條帶，則可判定檢測(cè)的樣品中含有冬蟲夏草成分；若陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增出條帶，空白對(duì)照未出現(xiàn)條帶，待檢測(cè)對(duì)照未擴(kuò)增出條帶，則可判定檢測(cè)的樣品中不含有冬蟲夏草成分。若待測(cè)樣品中僅在302bp位置有一條帶，表明該樣品為蝙蝠蛾，若待測(cè)樣品中僅在113bp位置有一條帶，表明該樣品含蟲草菌。

實(shí)施例2

特異性實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)方法步驟如下：

步驟1：同實(shí)施例1

步驟2：制備dna稀釋液；

待測(cè)樣品dna稀釋液：從待測(cè)樣品中提取dna，皆稀釋為50ng/μl的dna稀釋液；待測(cè)樣品為冬蟲夏草、蝙蝠蛾幼蟲、蟲草菌菌絲、涼山蟲草、亞香棒蟲草、新疆蟲草、蟲草花(北蟲草)、淀粉模制偽品、玉米、水稻、大豆、油菜、雞、豬。

陽(yáng)性對(duì)照品dna稀釋液及空白對(duì)照同實(shí)施例1。

步驟3、步驟4同實(shí)施例1。

擴(kuò)增結(jié)果如附圖2所示。只有冬蟲夏草陽(yáng)性對(duì)照品、冬蟲夏草樣品中擴(kuò)增出兩條目標(biāo)條帶(泳道1、3)，空白對(duì)照、蟲草偽品及玉米、水稻、大豆、油菜籽、雞、豬等其他物種的dna中未能擴(kuò)增出條帶(泳道6～16)，這說(shuō)明兩個(gè)引物對(duì)coi-f/r和cits-f10’/cits-r10’-2對(duì)冬蟲夏草特異性非常高。而在蝙蝠蛾幼蟲和蟲草菌絲中dna分別擴(kuò)增到302bp(泳道4)、113bp(泳道5)特異條帶，證明針對(duì)蝙蝠蛾的coi基因的引物對(duì)coi-f/r、針對(duì)蟲草菌的its的引物對(duì)cits-f10’/cits-r10’-2的正確性。

實(shí)施例3

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。

采用實(shí)施例1的方法對(duì)冬蟲夏草陽(yáng)性對(duì)照樣品(購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院的冬蟲夏草標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))和青海、西藏、四川等地搜集到的冬蟲夏草樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如附圖3所示。所有冬蟲夏草檢測(cè)樣品均可擴(kuò)增出兩條(113bp和302bp)目標(biāo)條帶(泳道1、3～16)，空白對(duì)照(泳道2)則未擴(kuò)增出條帶。且該結(jié)果可多次重復(fù)再現(xiàn)，具有可重復(fù)性。因此，本發(fā)明對(duì)冬蟲夏草的真?zhèn)舞b別穩(wěn)定可靠。

按照上述實(shí)施例，便可很好地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。由以上檢測(cè)結(jié)果可得知，本發(fā)明的擴(kuò)增效率高、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，結(jié)果穩(wěn)定可靠。

上述實(shí)施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式之一，不應(yīng)當(dāng)用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，但凡在本發(fā)明的主體設(shè)計(jì)思想和精神上作出的毫無(wú)實(shí)質(zhì)意義的改動(dòng)或潤(rùn)色，其所解決的技術(shù)問(wèn)題仍然與本發(fā)明一致的，均應(yīng)當(dāng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。