本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新型廣譜溶菌酶的高通量篩選方法。

背景技術(shù)：

溶菌酶(lysozyme，ec3.2.1.17)又稱胞壁質(zhì)酶(muramidase)，能特異性水解原核細(xì)菌細(xì)胞壁中的主要成分肽聚糖，分解微生物的細(xì)胞壁，使細(xì)菌失去細(xì)胞壁的保護(hù)并在胞內(nèi)高滲透壓的作用下破裂死亡，從而達(dá)到殺菌目的。1921年，著名英國(guó)細(xì)菌學(xué)家alexanderfleming在人的鼻液中發(fā)現(xiàn)了溶菌酶，后證實(shí)溶菌酶廣泛存在于鳥類和禽類的蛋清內(nèi)、哺乳動(dòng)物的各器官組織和體液內(nèi)、植物以及軟體動(dòng)物和昆蟲體內(nèi)。

溶菌酶作為高等有機(jī)體組織及體液中最強(qiáng)大的抗菌劑之一，是生物機(jī)體對(duì)抗外源病原菌侵襲的重要防御因子。如人溶菌酶是一種小分子堿性球蛋白，它由上皮細(xì)胞和單核-巨噬細(xì)胞分泌，可識(shí)別和破壞病原菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并通過(guò)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)吸引白細(xì)胞集中到感染部位，最終消滅侵染人體的病原菌。此外，溶菌酶還可與帶負(fù)電荷的病毒蛋白直接結(jié)合，和dna-rna脫輔基蛋白形成復(fù)鹽，使病毒失活。在植物中，如無(wú)花果的鮮汁中均含有豐富的溶菌酶，推測(cè)其與植物的抗病毒作用密切關(guān)系。另一方面，溶菌酶也廣泛存在于微生物中，如各種細(xì)菌和噬菌體。噬菌體溶菌酶與噬菌體侵染過(guò)程中細(xì)菌細(xì)胞壁的分解有關(guān)。細(xì)菌溶菌酶的主要功能是參與細(xì)胞生長(zhǎng)分裂形態(tài)改變等與細(xì)胞壁相關(guān)的代謝過(guò)程。因此，細(xì)菌不會(huì)對(duì)溶菌酶這種細(xì)菌中廣泛含有的自溶素(autolysin)，產(chǎn)生真正意義上的抵抗性，這對(duì)于解決日益嚴(yán)峻的細(xì)菌耐藥性問(wèn)題，減少抗生素濫用具有重要意義。

雖然溶菌酶的作用強(qiáng)大，但其對(duì)革蘭氏陰性菌的裂解效果并不好。這是由于細(xì)菌細(xì)胞壁構(gòu)成不同所導(dǎo)致的。革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁主要由肽聚糖構(gòu)成，肽聚糖層數(shù)較多且較厚，含有少量磷壁酸，而革蘭氏陰性菌外層主要由脂多糖(lps)構(gòu)成，內(nèi)層才含有少量肽聚糖。而溶菌酶的主要作用位點(diǎn)為細(xì)胞壁中的肽聚糖，水解β-1,4糖苷鍵，故其對(duì)于革蘭氏陰性菌的作用效果不是很理想。

在日常生活當(dāng)中，人們所接觸到的很多致病菌，如大腸桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎桿菌、痢疾桿菌和產(chǎn)氣莢膜桿菌等，都屬于革蘭氏陰性菌。為了得到對(duì)革蘭氏陰性菌具有高殺菌活性的溶菌酶，可以對(duì)溶菌酶進(jìn)行定向進(jìn)化，構(gòu)建溶菌酶基因隨機(jī)突變文庫(kù)，再?gòu)闹泻Y選出對(duì)革蘭氏陰性菌殺菌效果較強(qiáng)的溶菌酶。

定向轉(zhuǎn)化過(guò)程中，一方面，所需的突變體文庫(kù)數(shù)量龐大，需采用高通量方法以提高篩選效率；另一方面，溶菌酶對(duì)革蘭氏陰性菌裂解效果差，需采用衡量指標(biāo)較敏感、可有效反映裂解效果的篩選手段。而現(xiàn)有的篩選方法如平板抑菌圈法、牛津杯法等，無(wú)法很好的同時(shí)滿足以上兩點(diǎn)要求。因此，亟需構(gòu)建一種靈敏可靠、易操作的高通量篩選方法，用于新型廣譜溶菌酶突變體的篩選。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足提供一種新型廣譜溶菌酶的高通量篩選方法，該方法通過(guò)fret熒光蛋白對(duì)與位點(diǎn)特異性蛋白酶的級(jí)聯(lián)使用，提高了檢測(cè)的靈敏性，同時(shí)利用熒光酶標(biāo)儀和96微孔板可以實(shí)現(xiàn)溶菌酶的高通量檢測(cè)。

為此，本發(fā)明提供了一種新型廣譜溶菌酶的高通量篩選方法，其包括以下步驟：

a，將目標(biāo)溶菌酶的基因突變文庫(kù)在真核細(xì)胞中進(jìn)行分泌表達(dá)，獲得含不同活性目標(biāo)溶菌酶的發(fā)酵液；

b，將含不同活性目標(biāo)溶菌酶的發(fā)酵液分別加入到反應(yīng)體系中進(jìn)行反應(yīng)，篩選出對(duì)革蘭氏陰性菌殺菌活性高的溶菌酶；

其中，所述反應(yīng)體系包括：胞內(nèi)表達(dá)“供體熒光蛋白-蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn)-受體熒光蛋白”的革蘭氏陰性菌、蛋白酶和蛋白酶反應(yīng)緩沖液。

在本發(fā)明中，根據(jù)反應(yīng)過(guò)程中供體熒光蛋白的信號(hào)強(qiáng)度增長(zhǎng)速度，判斷發(fā)酵液中的溶菌酶對(duì)革蘭氏陰性菌殺菌活性；具體地，反應(yīng)過(guò)程中供體熒光蛋白的信號(hào)強(qiáng)度增長(zhǎng)越快，發(fā)酵液中的溶菌酶對(duì)革蘭氏陰性菌殺菌活性越高。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述的蛋白酶為具有識(shí)別序列特異性的蛋白酶；在本發(fā)明的一些具體實(shí)施例中，所述的蛋白酶為tev蛋白酶、腸激酶或凝血因子xa；在本發(fā)明的一些優(yōu)選的實(shí)施例中，所述的蛋白酶為tev蛋白酶。

在本發(fā)明的另一些實(shí)施方式中，所述tev蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn)的氨基酸序列為：glu-asn-leu-tyr-phe-gln-gly。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述目標(biāo)溶菌酶基因突變文庫(kù)的構(gòu)建方法為易錯(cuò)pcr和/或dna改組。

在本發(fā)明中，由于供體熒光蛋白的發(fā)射光譜與受體熒光蛋白的吸收光譜重疊，因此當(dāng)供體熒光蛋白與受體熒光蛋白之間的距離在10nm以內(nèi)時(shí)，會(huì)發(fā)生能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，供體熒光蛋白的能量轉(zhuǎn)移至受體熒光蛋白上，使供體蛋白熒光強(qiáng)度要比它單獨(dú)存在時(shí)低得多，而受體蛋白熒光強(qiáng)度大大增強(qiáng)。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施例中，所述的供體熒光蛋白為青色熒光蛋白，所述的受體熒光蛋白為黃色熒光蛋白。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方式中，所述真核細(xì)胞為畢赤酵母。

在本發(fā)明的另一些具體實(shí)施方式中，所述方法還包括以下步驟：

c，對(duì)篩選出的對(duì)革蘭氏陰性菌殺菌活性高的溶菌酶進(jìn)行復(fù)篩，根據(jù)反應(yīng)過(guò)程中供體熒光蛋白的信號(hào)強(qiáng)度增長(zhǎng)速度，驗(yàn)證溶菌酶的活性。

本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明所述篩選方法通過(guò)fret熒光蛋白對(duì)與位點(diǎn)特異性蛋白酶的級(jí)聯(lián)，借助檢測(cè)熒光信號(hào)，顯著提高了檢測(cè)的靈敏度，可有效地發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性突變，找到優(yōu)良突變基因；同時(shí)該方法可利用熒光酶標(biāo)儀和96微孔板實(shí)現(xiàn)溶菌酶的高通量檢測(cè)。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明容易理解，下面將詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。

本發(fā)明所述篩選方法基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(fret)，即兩個(gè)熒光蛋白分子距離極近(10nm以內(nèi))時(shí)，如果供體熒光蛋白的發(fā)射光譜與受體熒光蛋白的吸收光譜重疊，則會(huì)發(fā)生能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，供體熒光蛋白的能量轉(zhuǎn)移至受體熒光蛋白上，使供體蛋白熒光強(qiáng)度要比它單獨(dú)存在時(shí)低得多，而受體蛋白熒光強(qiáng)度大大增強(qiáng)。以青色熒光蛋白和黃色熒光蛋白為例，青色熒光蛋白和黃色熒光蛋白是一對(duì)可以發(fā)生fret效應(yīng)的蛋白，其中青色蛋白的發(fā)射光譜與黃色蛋白的吸收光譜重疊。

用蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn)作為linker序列，例如，采用tev蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn)作為linker序列將青色熒光蛋白和黃色熒光蛋白連接，使青色熒光蛋白和黃色熒光蛋白形成距離極近的fret熒光蛋白對(duì)，即“青色熒光蛋白-tev蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn)-黃色熒光蛋白”。tev蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn)是由glu-asn-leu-tyr-phe-gln-gly七個(gè)氨基酸構(gòu)成。

反應(yīng)前，由于linker序列(tev蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn))的作用，青色熒光蛋白和黃色熒光蛋白距離極近，青色熒光蛋白的能量轉(zhuǎn)移至黃色熒光蛋白上，此時(shí)檢測(cè)信號(hào)呈現(xiàn)青色熒光信號(hào)弱、黃色熒光信號(hào)強(qiáng)；當(dāng)將含溶菌酶的發(fā)酵液加入反應(yīng)液中，若溶菌酶對(duì)底物菌種(革蘭氏陰性菌)有較好的殺菌活性，則細(xì)菌發(fā)生裂解并釋放內(nèi)部的fret熒光蛋白對(duì)。該蛋白對(duì)的tev蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn)被反應(yīng)液中的tev蛋白酶特異性識(shí)別并分解，得到獨(dú)立的青色熒光蛋白和黃色熒光蛋白，fret現(xiàn)象消失，使得青色熒光信號(hào)增強(qiáng)。因此，可以通過(guò)定量測(cè)定青色熒光蛋白信號(hào)強(qiáng)度的增長(zhǎng)速度，來(lái)判定溶菌酶對(duì)革蘭氏陰性菌的殺菌活性。

本發(fā)明所涉及的新型廣譜溶菌酶的高通量篩選方法的具體操作如下：

(1)構(gòu)建表達(dá)目標(biāo)溶菌酶基因突變文庫(kù)的真核細(xì)胞：

目標(biāo)溶菌酶的具體種類可根據(jù)實(shí)際需要選擇。編碼目標(biāo)溶菌酶的基因序列通過(guò)核酸數(shù)據(jù)庫(kù)查找并進(jìn)行全基因合成，得到原始目標(biāo)溶菌酶基因序列。構(gòu)建目標(biāo)溶菌酶基因隨機(jī)突變文庫(kù)主要通過(guò)易錯(cuò)pcr和dna改組(也稱dna洗牌)兩種手段實(shí)現(xiàn)。

1)易錯(cuò)pcr具體操作步驟如下：

針對(duì)原始目標(biāo)溶菌酶基因序列設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)的引物，通過(guò)調(diào)整pcr反應(yīng)體系的配比及反應(yīng)條件，如改變反應(yīng)體系中金屬離子的濃度、增加pcr反應(yīng)循環(huán)次數(shù)等，進(jìn)行易錯(cuò)pcr擴(kuò)增，使易錯(cuò)pcr產(chǎn)物中的基因序列發(fā)生點(diǎn)突變，從而引起氨基酸改變。

2)dna改組具體操作步驟如下：

選取與原始目標(biāo)溶菌酶基因具有同源性的其他溶菌酶基因序列，數(shù)目可以根據(jù)實(shí)際需要所選擇。每種基因序列各取20μl混合，加入0.2u的dnasei，16℃下酶切15min后立即加入6μledta，轉(zhuǎn)移至75℃水浴，酶失活10min。將酶切后的混合體系進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，選取合適的方法，將所需大小的片段進(jìn)行膠回收。若模板基因?yàn)?000bp左右，則切取100-200bp處膠塊，選用膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收；若模板基因?yàn)?000bp左右，則切取50bp左右處膠塊，由于片段長(zhǎng)度小，電泳時(shí)選取低熔點(diǎn)瓊脂糖進(jìn)行電泳，切取的膠塊溶在3倍體積的te溶液中，利用酚氯仿抽提，再進(jìn)行乙醇沉淀，回收小片段dna。

將回收后的片段dna作為無(wú)引物pcr的模板，進(jìn)行無(wú)引物pcr，利用基因重組的原理，使片段dna互為引物進(jìn)行pcr，體系配比如下：1μlpfu酶，5μlbuffer，10μldntp，5μl片段dna，29μl超純水，共50μl。pcr程序?yàn)椋?4℃5min，94℃30s，46℃1min，72℃30s，50個(gè)循環(huán)，72℃10min。其中72℃延伸時(shí)間根據(jù)實(shí)際需要選定。對(duì)無(wú)引物pcr產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，膠回收原始目標(biāo)溶菌酶基因大小的片段。

根據(jù)幾種同源基因設(shè)計(jì)含有相同酶切位點(diǎn)的引物，加入所設(shè)計(jì)的引物，利用上一步無(wú)引物pcr產(chǎn)物作為模板，進(jìn)行有引物pcr。按常規(guī)pcr體系配比，按照正常pcr反應(yīng)條件進(jìn)行pcr反應(yīng)。將有引物pcr產(chǎn)物再進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，膠回收原始目標(biāo)溶菌酶基因大小的片段。

將易錯(cuò)pcr或dna改組后的產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，將表達(dá)載體也采用同樣的酶進(jìn)行雙酶切，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，回收所需大小片段，取5μl回收產(chǎn)物再次進(jìn)行電泳，根據(jù)條帶亮度確定目的基因和表達(dá)載體比例，配制連接體系，16℃連接過(guò)夜，構(gòu)建重組質(zhì)粒。

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入top10感受態(tài)細(xì)胞中，然后將轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的感受態(tài)細(xì)胞懸液全部涂于平板上，每個(gè)直徑90mm的平板上涂布100-200μl轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的感受態(tài)細(xì)胞懸液，37℃培養(yǎng)16h左右。用無(wú)菌水將生長(zhǎng)好的菌株從平板上沖下，形成菌懸液，回收菌懸液，利用提質(zhì)粒試劑盒提取菌懸液中的重組質(zhì)粒。

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入真核生物感受態(tài)細(xì)胞中，例如畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的真核生物感受態(tài)細(xì)胞懸液全部平分涂于平板上，靜置培養(yǎng)，獲得含目標(biāo)溶菌酶基因突變文庫(kù)的真核細(xì)胞。

(2)構(gòu)建胞內(nèi)表達(dá)“供體熒光蛋白-蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn)-受體熒光蛋白”的革蘭氏陰性菌：

所采用的供體熒光蛋白為青色熒光蛋白，受體熒光蛋白為光色熒光蛋白，蛋白酶為tev蛋白酶；

通過(guò)ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)查找出青色熒光蛋白和黃色熒光蛋白的基因序列，加入tev蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn)基因作為中間linker序列，設(shè)計(jì)出兩端帶有限制性酶切位點(diǎn)的“青色熒光蛋白-tev蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn)-黃色熒光蛋白”fret熒光蛋白對(duì)基因序列，通過(guò)人工進(jìn)行合成。將fret熒光蛋白對(duì)基因和革蘭氏陰性菌胞內(nèi)表達(dá)載體均進(jìn)行雙酶切，電泳后回收片段進(jìn)行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒。

將重組質(zhì)粒導(dǎo)入革蘭氏陰性菌感受態(tài)細(xì)胞中，誘導(dǎo)發(fā)酵表達(dá)，通過(guò)sds-page鑒定fret熒光蛋白對(duì)成功在菌種中得到表達(dá)。離心收集菌體，棄上清，加入無(wú)菌水重懸菌種，再離心后加入無(wú)菌水，使其形成具有特定濃度的菌懸液。

(3)篩選對(duì)革蘭氏陰性菌殺菌活性高的溶菌酶：

將成功分泌表達(dá)目標(biāo)溶菌酶基因突變文庫(kù)的酵母體系，逐孔轉(zhuǎn)入裝有酵母培養(yǎng)基的96深孔板中，在深孔板中進(jìn)行誘導(dǎo)發(fā)酵，獲得含目標(biāo)溶菌酶的發(fā)酵液。

每孔吸取100μl發(fā)酵液，并將其逐孔對(duì)應(yīng)地轉(zhuǎn)移入透明的酶標(biāo)板中，每孔再加入100μl純水，混勻后在酶標(biāo)儀中測(cè)得每孔發(fā)酵液的od600值。

向胞內(nèi)表達(dá)“青色熒光蛋白-tev蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn)-黃色熒光蛋白”的革蘭氏陰性菌的菌懸液中，加入tev蛋白酶及tev蛋白酶緩沖液，加入量根據(jù)檢測(cè)量所需計(jì)算(檢測(cè)時(shí)，每孔加入150μl菌懸液、0.8μltev蛋白酶緩沖液和0.5μltev蛋白酶)，混勻后形成底物混合液，向熒光酶標(biāo)板中每孔加入151μl底物混合液。

然后向熒光酶標(biāo)板中每孔加入50μl發(fā)酵液(最后兩孔不加入發(fā)酵液，只加入底物混合液作為陰性對(duì)照)，立即吸打1-2次后，放入酶標(biāo)儀中進(jìn)行檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為433nm，發(fā)射波長(zhǎng)為475nm，每隔1min檢測(cè)一次，共檢測(cè)45min，反應(yīng)4h后，再檢測(cè)10min，每隔1min檢測(cè)一次。

篩選指標(biāo)的處理分析如下：

反應(yīng)前45min以時(shí)間(min)為橫坐標(biāo)、青色熒光信號(hào)強(qiáng)度值為縱坐標(biāo)做圖，檢測(cè)反應(yīng)開始時(shí)的穩(wěn)定性。如果反應(yīng)穩(wěn)定，即反應(yīng)趨勢(shì)平緩上升，則可以求前10min熒光信號(hào)強(qiáng)度平均值，同時(shí)求反應(yīng)4h后10min內(nèi)的平均值。兩個(gè)平均值之差再除以每孔發(fā)酵液的od600值，即熒光信號(hào)強(qiáng)度差值/od600(青色熒光蛋白的信號(hào)強(qiáng)度增長(zhǎng)速度)，以此數(shù)據(jù)對(duì)突變?nèi)芫该富畹母叩瓦M(jìn)行排序，同時(shí)將各孔的數(shù)據(jù)與陰性對(duì)照孔的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)。其中青色熒光信號(hào)增長(zhǎng)越快且高于對(duì)照孔數(shù)值的，表示發(fā)酵液中的溶菌酶對(duì)革蘭氏陰性菌殺菌活性越高。

對(duì)篩選出的含對(duì)革蘭氏陰性菌殺菌活性高的溶菌酶的陽(yáng)性酵母進(jìn)行放大培養(yǎng)和復(fù)篩，根據(jù)反應(yīng)過(guò)程中青色熒光蛋白的信號(hào)強(qiáng)度增長(zhǎng)速度，驗(yàn)證溶菌酶的活性。提取最終得到的陽(yáng)性酵母的全基因組，擴(kuò)增目的基因并進(jìn)行測(cè)序，得到具有高革蘭氏陰性菌殺菌活性的新型溶菌酶的基因序列。

本發(fā)明中所述的“柞蠶溶菌酶基因”為經(jīng)密碼子優(yōu)化后的柞蠶溶菌酶基因。

實(shí)施例

為使本發(fā)明更加容易理解，下面將結(jié)合實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，這些實(shí)施例僅起說(shuō)明性作用，并不局限于本發(fā)明的應(yīng)用范圍。本發(fā)明中所使用的原料或組分若無(wú)特殊說(shuō)明均可以通過(guò)商業(yè)途徑或常規(guī)方法制得。

實(shí)施例1：構(gòu)建柞蠶溶菌酶基因突變文庫(kù)

柞蠶是一種北方經(jīng)濟(jì)昆蟲，柞蠶溶菌酶(aplyz)具有適應(yīng)溫度范圍廣、最適溫度較低等特性，具有良好的應(yīng)用價(jià)值。由ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)中查找到柞蠶溶菌酶基因序列，成熟肽序列共363bp，由公司進(jìn)行全基因合成，合成后的基因序列如下：

aagtggtttaccaaatgtggtctagtgcacgagctgaggagacaaggcttcgacgagagcctaatgagagactgggtctgtttggttgagaacgaaagcagcagatatactaataaaatcggtaaagtgaataagaatggttctcaagactacggtttgttccagatcaatgacaaatattggtgtagtaagacctccacccccggaaaggattgcaatgtgacttgtaatcaattgttgactgacgatattacagttgctgctacctgtgcgaagaagatttacaagagacataagtttaacgcttggtacggatggttaaaccactgtcaacactctcttccagacattagcgactgttaa；

根據(jù)要連接的表達(dá)載體ppiczαa和上述柞蠶溶菌酶基因序列，選擇noti和xhoi兩種限制性內(nèi)切酶，設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)的上下游引物，引物序列如下：

aplyz-f：tctactcgagaaaagaaagtggtttacca

aplyz-r：tcgctgacaattcgccggcgtatat

首先進(jìn)行正常pcr，擴(kuò)增柞蠶溶菌酶基因，與t載體連接后留存菌種，后選用易錯(cuò)pcr和dna改組兩種方法構(gòu)建柞蠶溶菌酶的基因突變文庫(kù)。

易錯(cuò)pcr的具體操作步驟如下：

以柞蠶溶菌酶基因?yàn)槟０?，加入設(shè)計(jì)好的上下游引物，調(diào)整體系配比以及反應(yīng)條件，進(jìn)行易錯(cuò)pcr，反應(yīng)體系配比如下：

pcr反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3min，94℃變性1min，56℃退火30s，72℃延伸30s，共50個(gè)循環(huán)。1％瓊脂糖凝膠電泳45min，凝膠成像儀檢測(cè)并記錄結(jié)果。

dna改組的具體操作步驟如下：

選取與柞蠶溶菌酶基因序列具有同源性的人源溶菌酶基因4(lyzl4)的基因和人源溶菌酶基因6(lyzl6)的基因，對(duì)柞蠶溶菌酶基因進(jìn)行改組。其中，人源溶菌酶基因4的基因序列如下：

gaattcctcgagtacatcttaggtagatgtactgtcgcaaagaaactgcatgacggaggtctggattacttcgaaggatactctcttgagaattgggtgtgcttggcctattttgagtctaagttcaatccaatggccatatatgaaaatactagagagggttataccggatttggattgtttcagatgagaggtagtgattggtgcggtgaccatggtagaaacagatgtcatatgtcatgttccgcattattgaacccaaaccttgaaaaaactattaagtgcgctaaaactattgttaagggtaaagaaggtatgggtgcttggcctacctggtctagatattgtcaatacagtgatacattggctagatggctagacggatgtaagctttaagcggccgc

人源溶菌酶基因6的基因序列如下：

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根據(jù)柞蠶溶菌酶基因序列、人源溶菌酶基因4基因序列和人源溶菌酶基因6基因序列設(shè)計(jì)含有相同酶切位點(diǎn)的引物。設(shè)計(jì)引物如下：

柞蠶溶菌酶基因、人源溶菌酶基因4、人源溶菌酶基因6各取20μl進(jìn)行混合，加入6μl的dnasei緩沖液，加入0.2u左右的dnasei，酶切15min，加入10μledta，75℃酶失活10min。酶切后的混合體系采用1.5％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳45min，凝膠成像儀檢測(cè)并記錄結(jié)果。

選取50bp左右處條帶，在紫外燈下將膠塊切下，加入3倍體積te溶液，放入70℃水浴中至凝膠熔化，加入等體積的平衡酚抽提一次，12000rpm離心10min取上清轉(zhuǎn)入另一pe管中，去除多余的瓊脂。用等體積的酚:(氯仿:異戊醇)(1:1)和氯仿:異戊醇(24:1)各抽提一次，取上清。

加入總體積1/10的乙酸鈉(ph5.2)，再加入三倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，混勻后在-20℃冰箱中冷凍過(guò)夜。將離心管取出，放入預(yù)冷的4℃離心機(jī)，13000rpm高速離心15min，將上清盡可能吸除干凈后，向兩離心管中各加入1ml75％的冰凍乙醇，13000rpm，離心10min。重復(fù)加入1ml75％的冰凍乙醇，再次除鹽。室溫下自然風(fēng)干，向兩支離心管中各加入13μl去離子水溶解dna，后從離心管中各取3μldna溶液跑電泳檢查乙醇沉淀后回收效果。

以回收的小片段dna產(chǎn)物為模板，不加引物，利用同源重組，使小片段之間互相作為模板，進(jìn)行無(wú)引物pcr，體系如下：

pcr反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，46℃退火1min，72℃延伸30s，共50個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。對(duì)無(wú)引物pcr產(chǎn)物采用1％瓊脂糖凝膠電泳45min，凝膠成像儀檢測(cè)并記錄結(jié)果，并利用膠回收試劑盒回收400bp左右處dna。為了增加片段的豐富性，可再次利用dnasei進(jìn)行酶切并無(wú)引物pcr，再次回收。

利用無(wú)引物pcr產(chǎn)物為模板，加入上述的六種引物，進(jìn)行有引物pcr，體系如下：

pcr反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，55.5℃退火30s，72℃延伸30s，共33個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物采用1％瓊脂糖凝膠電泳45min，凝膠成像儀檢測(cè)并記錄結(jié)果，并利用膠回收試劑盒回收400bp左右處dna。

選用noti和xhoi限制性內(nèi)切酶，對(duì)易錯(cuò)pcr產(chǎn)物和dna改組產(chǎn)物以及表達(dá)質(zhì)粒ppiczαa進(jìn)行雙酶切。雙酶切后對(duì)體系進(jìn)行電泳，回收所需大小片段，再次將膠回收產(chǎn)物進(jìn)行電泳，根據(jù)條帶亮度判斷濃度比例，將目的基因和表達(dá)質(zhì)粒連接過(guò)夜，構(gòu)成重組表達(dá)質(zhì)粒。

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入top10感受態(tài)細(xì)胞中，后將轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的感受態(tài)細(xì)胞懸液全部涂于平板上，每個(gè)直徑90mm的平板上涂布100-200μl轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的感受態(tài)細(xì)胞懸液，37℃培養(yǎng)16h左右。用無(wú)菌水將生長(zhǎng)好的菌株從平板上沖下，形成菌懸液，回收菌懸液，利用提質(zhì)粒試劑盒提取菌懸液中的重組質(zhì)粒。

實(shí)施例2：將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母細(xì)胞

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是一種良好的真核表達(dá)系統(tǒng)，結(jié)合ppiczαa表達(dá)質(zhì)?？梢詫?shí)現(xiàn)良好的胞外表達(dá)。

畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞制備具體操作步驟如下：

(1)挑取ypds平板上的畢赤酵母gs115單克隆接種于10mlypd液體培養(yǎng)基中，為保證通氣量，用6層紗布封口，30℃，250rpm培養(yǎng)過(guò)夜。

(2)按1％的接種量轉(zhuǎn)接于含50mlypd液體培養(yǎng)基的250ml帶擋板錐形瓶中。30℃，250rpm震蕩培養(yǎng)約20h至od600為1.3-1.5。

(3)將菌液移入預(yù)冷的50ml的離心管中，冰浴至少30min，使細(xì)胞充分冷卻，4℃，4000rpm，離心5min收集細(xì)胞。

(4)小心棄上清液，用50ml冰預(yù)冷的無(wú)菌去離子水重懸菌體，4℃，4000rpm，離心5min。

(5)用25ml冰預(yù)冷的無(wú)菌去離子水再次重懸菌體。

(6)小心棄上清，用5ml冰預(yù)冷的1mol/l的山梨醇溶液重懸細(xì)胞菌體，4℃，4000rpm，離心5min。

(7)小心棄上清液，用1ml山梨醇重懸菌體，按每管80μl分裝備用。

重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入畢赤酵母gs115感受態(tài)細(xì)胞的具體步驟如下：

(1)將10μl線性化的重組質(zhì)粒ppiczαa-aplyz加入80μl畢赤酵母gs115感受態(tài)細(xì)胞中，冰上預(yù)冷10min。

(2)將電轉(zhuǎn)儀的電轉(zhuǎn)電壓調(diào)節(jié)到1.5kv。

(3)將冰浴后的混合液加入到0.2cm預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中，輕扣幾下，使混合液沉到電轉(zhuǎn)杯底部，輕輕拭去電轉(zhuǎn)杯外的水。

(4)將電轉(zhuǎn)杯放入電轉(zhuǎn)儀中，電擊時(shí)間約5.0ms，電擊結(jié)束后立即加入1ml預(yù)冷的1mol/l的山梨醇溶液。

(5)將電擊后的菌液移入無(wú)菌離心管中，30℃靜置培養(yǎng)1h后加入500μlypd液體培養(yǎng)基輕輕混勻，繼續(xù)靜置復(fù)蘇1h。

(6)復(fù)蘇液涂布于含較低濃度zeocin(100μg/ml)抗性的ypds篩選平板上，每個(gè)平板涂布200μl，將全部復(fù)蘇液涂完。

(7)30℃恒溫靜置培養(yǎng)48h。

實(shí)施例3：構(gòu)建胞內(nèi)表達(dá)“青色熒光蛋白-tev蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn)-黃色熒光蛋白”的大腸桿菌

大腸桿菌是一種典型的革蘭氏陰性菌，方便得到，易操作易培養(yǎng)，細(xì)胞壁具有脂多糖外膜，溶菌酶對(duì)其裂解效果較差。

根據(jù)ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)中查找到的熒光蛋白基因和tev蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn)基因序列，合成兩端分別含有xhoi、noci酶切位點(diǎn)的“青色熒光蛋白-tev蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn)-黃色熒光蛋白”基因序列。利用兩種限制性內(nèi)切酶分別對(duì)含有該蛋白對(duì)基因的克隆質(zhì)粒和表達(dá)質(zhì)粒pet28a進(jìn)行雙酶切，電泳回收所需片段。配制連接體系，將熒光蛋白對(duì)基因和表達(dá)質(zhì)粒pet28a過(guò)夜連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。

取出bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞在冰上融化1-2min，將過(guò)夜連接體系全部加入感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min后轉(zhuǎn)入42℃水浴90s，立即轉(zhuǎn)入冰中2-3min后，每管加入900μllb培養(yǎng)基，37℃200rpm復(fù)蘇1h。將復(fù)蘇好的菌懸液吸取100μl涂于含有卡那霉素的lb平板上。

利用pet28a通用引物，對(duì)平板上長(zhǎng)出菌落進(jìn)行菌落pcr擴(kuò)增，驗(yàn)證成功轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的大腸桿菌，然后進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵具體步驟如下：

1)將成功轉(zhuǎn)入重組表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌轉(zhuǎn)入50ml含有適量卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基(錐形瓶，250ml規(guī)格)，37℃搖床培養(yǎng)至od600為0.4-1之間，最好為0.6，大約3h。

2)取現(xiàn)制的濃度為100mm的iptg0.5ml加入一組培養(yǎng)基中，使其工作濃度為1mm(由于pet28a含有t7lac啟動(dòng)子，如果其他質(zhì)粒含有t7啟動(dòng)子，則將iptg工作濃度稀釋為0.4mm)；另一組培養(yǎng)基不加iptg，作對(duì)照，將兩組繼續(xù)搖床培養(yǎng)3h。

3)將錐形瓶在冰上放置5min后，4℃5000×g離心5min，棄上清，菌體用1/4容器體積經(jīng)預(yù)冷的無(wú)菌水重懸菌種，再次離心，4℃5000×g離心5min。

4)無(wú)菌水重懸菌種。

實(shí)施例4：篩選對(duì)大腸桿菌殺菌活性高的新型柞蠶溶菌酶

將ypd平板上長(zhǎng)好的帶有溶菌酶基因的畢赤酵母，挑入裝有1mlbmgy培養(yǎng)基的96深孔板中，一個(gè)菌種挑入一個(gè)孔中，培養(yǎng)3天后，4000rpm離心20min，棄上清，每孔加入1ml的bmmy培養(yǎng)基，加入20μl甲醇，每隔24h每孔加入20μl甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵表達(dá)，發(fā)酵72h后停止發(fā)酵。

將表達(dá)好的發(fā)酵液每孔吸取100μl，孔孔對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)移入透明的正常96孔板后，每孔再加入100μl水，吹打混勻，放入酶標(biāo)儀中測(cè)得od600值。

向胞內(nèi)表達(dá)熒光蛋白對(duì)的大腸桿菌菌懸液中，加入tev蛋白酶及tev蛋白酶緩沖液，加入量根據(jù)檢測(cè)量所需計(jì)算(檢測(cè)時(shí)，每孔加入150μl菌懸液、0.8μltev蛋白酶緩沖液和0.5μltev蛋白酶)，混合好后形成底物混合液，向黑色96孔板中每孔加入151μl底物混合液。

向黑色96孔板中每孔加入50μl發(fā)酵液(最后兩孔不加入發(fā)酵液，只加入底物混合液作為陰性對(duì)照)，立即吸打1-2次，放入酶標(biāo)儀中進(jìn)行檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為433nm，發(fā)射波長(zhǎng)為475nm，每隔1min檢測(cè)一次，共檢測(cè)45min中，反應(yīng)4h后，再檢測(cè)10min，每隔1min檢測(cè)一次。

檢測(cè)后，將數(shù)據(jù)經(jīng)前文所說(shuō)方法分析處理，得到含對(duì)大腸桿菌殺菌活性高的溶菌酶的酵母菌種，將菌種擴(kuò)大培養(yǎng)，誘導(dǎo)發(fā)酵，進(jìn)行復(fù)篩，將數(shù)據(jù)經(jīng)前文所說(shuō)方法分析處理，驗(yàn)證其活性。提取最終得到的陽(yáng)性酵母的全基因組，擴(kuò)增目的基因并進(jìn)行測(cè)序，得到具有高革蘭氏陰性菌殺菌活性的新型溶菌酶的基因序列。

應(yīng)當(dāng)注意的是，以上所述的實(shí)施例僅用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制。通過(guò)參照典型實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但應(yīng)當(dāng)理解為其中所用的詞語(yǔ)為描述性和解釋性詞匯，而不是限定性詞匯?？梢园匆?guī)定在本發(fā)明權(quán)利要求的范圍內(nèi)對(duì)本發(fā)明作出修改，以及在不背離本發(fā)明的范圍和精神內(nèi)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行修訂。盡管其中描述的本發(fā)明涉及特定的方法、材料和實(shí)施例，但是并不意味著本發(fā)明限于其中公開的特定例，相反，本發(fā)明可擴(kuò)展至其他所有具有相同功能的方法和應(yīng)用。

sequencelisting

<110>北京工商大學(xué)

<120>一種新型廣譜溶菌酶的高通量篩選方法

<130>2017

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<213>柞蠶溶菌酶上游引物

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<213>柞蠶溶菌酶下游引物

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<213>人源溶菌酶4上游引物

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<213>人源溶菌酶4下游引物

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<213>柞蠶溶菌酶基因

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<213>人源溶菌酶基因6

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<170>手工

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