本發(fā)明涉及養(yǎng)殖業(yè)環(huán)境資源應(yīng)用領(lǐng)域，具體地說涉及一種能夠有效地降解羽毛的蠟樣芽孢桿菌及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著養(yǎng)禽業(yè)的集約化發(fā)展，養(yǎng)殖企業(yè)，尤其是大中型畜牧場在提供肉、禽、蛋的同時，每天都會產(chǎn)生糞、羽毛、骨粉、血渣等大量的廢棄物，這些廢棄物如果處理不好，常常會污染環(huán)境，傳播病原。尤其是羽毛，由于其羽毛角蛋白含量高，具有難以降解的特點，比其他廢棄物更難以回收利用。據(jù)研究報道，羽毛中的角蛋白含量高達80％，并且含有豐富的賴氨酸、色氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸、組氨酸、脯氨酸、甘氨酸以及其他一些維生素、常量元素及微量元素，由于缺乏實用的降解羽毛的手段，致使大量羽毛廢棄、污染環(huán)境。盡管高壓加溫水解法、化學(xué)酸堿水解法等處理方法能夠降解羽毛，但由于成本高，實用性不強。

研究表明，生物發(fā)酵方法已成為處理農(nóng)業(yè)廢棄物的首選，最重要的是篩選合適的微生物發(fā)酵降解菌株，最好能找到能夠降解雞、鴨、鵝、鴿等多種羽毛的角蛋白的菌株。角蛋白是外胚層細胞的結(jié)構(gòu)蛋白，是一種不溶性的纖維狀動物蛋白質(zhì)，是禽類羽毛的主要構(gòu)成物質(zhì)。角蛋白因含有較多的氫鍵、二硫鍵、鹽鍵且折疊緊密，又不溶于水，一般不容易被酶溶解。而且由于不同禽類羽毛角蛋白的結(jié)構(gòu)組成有所不同，因此，即便是能夠降解一種禽類的羽毛，不一定能降解其他禽類的羽毛。

近年來，有不少專利及研究報道，枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌能夠降解雞的羽毛，但可以較好降解鴨、鵝、鴿等羽毛的降解菌株尚未見報道，而能夠同時降解雞、鴨、鵝、鴿的羽毛的菌降解菌株更為少見。

cn106350558a公開了利用蠟樣芽孢桿菌和角蛋白酶聯(lián)合降解雞毛，但未公開可同時降解雞、鴨、鵝、鴿的羽毛，且聯(lián)合降解的效果優(yōu)于蠟樣芽孢桿菌或角蛋白酶單獨降解。目前國內(nèi)外尚未見蠟樣芽孢桿菌同時降解雞、鴨、鵝、鴿羽毛的報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的空白，提供一種能夠同時降解雞、鴨、鵝、鴿等多種羽毛的蠟樣芽孢桿菌。

本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供上述蠟樣芽孢桿菌的應(yīng)用，該菌種能夠有效降解雞、鴨、鵝、鴿等多種羽毛的角蛋白，變成易于吸收的氨基酸營養(yǎng)物質(zhì)，降低環(huán)境污染程度，并可用來制備有機肥和養(yǎng)殖蚯蚓、蠅蛆等動物源飼料。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種蠟樣芽孢桿菌，其分類命名為蠟樣芽孢桿菌(bacilluscereus)，菌株號為nj-02，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2017年3月30日，保藏編號為cctccno：m2017155，保藏地址為中國.武漢.武漢大學(xué)，郵編430072。該菌株是發(fā)明人于2016年9月從江蘇省南京市某鴿場健康鴿腸道中分離篩選獲得的，對雞、鴨、鵝、鴿等多種羽毛能夠有效降解的細菌菌株，這對降解處理養(yǎng)禽場廢棄的羽毛，降低養(yǎng)禽場環(huán)境污染程度，減少疾病的傳播具有重要意義。

菌株nj-02的主要生物學(xué)特征：菌落邊緣不整齊呈乳白色不透明，表面粗糙呈白蠟狀，純培養(yǎng)細菌經(jīng)革蘭氏染色和芽孢染色，然后置于光學(xué)顯微鏡油鏡頭下進行觀察。結(jié)果為有芽孢的g+中等大小桿菌，多數(shù)單在，少數(shù)呈3～5個短鏈狀，細菌大小1.0～1.2μm×3.0～5.0μm，芽孢圓形或柱形，中生或近中生，1.0～1.5μm，孢囊無明顯膨大。該菌株賴氨酸、鳥氨酸、精氨酸、檸檬酸鹽、肌醇、側(cè)金盞花醇、水楊苷、1％美藍牛乳均為陰性，v.p試驗、m.r、明膠液化、硝酸鹽、0.01％溶菌酶均為陽性。

菌株nj-0216srdna基因序列，見seqidno.1所示。

將菌株16srdna序列與genbank數(shù)據(jù)庫中的序列進行blast比對。結(jié)果表明，菌株nj-02的669bp核苷酸片段與已知蠟樣芽孢桿菌對應(yīng)核苷酸片段同源性均高達97％以上。結(jié)合形態(tài)、生理生化特征及16srdna序列分析，鑒定為蠟樣芽孢桿菌(bacilluscereus)。

上述蠟樣芽孢桿菌在降解羽毛中的應(yīng)用也在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。

其中，所述的羽毛優(yōu)選為雞毛、鴨毛、鵝毛或鴿毛，最優(yōu)選鵝毛。

具體的應(yīng)用方法是，將羽毛作為蠟樣芽孢桿菌nj-02的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成部分，蠟樣芽孢桿菌nj-02的發(fā)酵過程與羽毛的降解過程同步。

優(yōu)選的是，羽毛的降解過程包括如下步驟：

(1)蠟樣芽孢桿菌菌株nj-02的活化

將蠟樣芽孢桿菌菌株nj-02劃線于活化培養(yǎng)基上，35℃～40℃下培養(yǎng)24h～48h，由此獲得經(jīng)過活化的nj-02菌株；

(2)種子液的制備

將步驟(1)活化后的菌株，接種于種子培養(yǎng)基中，35～40℃震蕩培養(yǎng)24～36h，得種子液；

(3)發(fā)酵降解

以5～10％的體積比的接種量，將步驟(2)得到的種子液接種于含有羽毛的發(fā)酵培養(yǎng)基中，35～40℃發(fā)酵48-60h，直接降解羽毛。

其中，所述的活化培養(yǎng)基按如下方法制備得到：稱取營養(yǎng)瓊脂38g，蒸餾水800ml，調(diào)整ph7.5，加蒸餾水至1000ml，高壓滅菌，制得。

其中，所述的種子培養(yǎng)基按如下方法制備得到：稱取牛肉膏1.5g，蠅蛆消化濃縮膏1.5g，蛋白胨5g，nacl5g，k2hpo41g，蒸餾水800ml，初始ph7.5，加蒸餾水至1000毫升，高壓滅菌，制得。

其中，蠅蛆消化濃縮膏自行制備，具體步驟為：將500g新鮮蠅蛆，用水沖洗干凈后，加水至800ml，置組織搗碎機中高速搗碎后，取出置提取罐中，加水沖洗合并，使搗碎后的混合物體積為1500ml，加入胰蛋白酶1.5g(酶活：每毫克胰蛋白酶效價不少于2500酶活單位)，邊加邊攪拌均勻，置于50℃條件下酶解8-10h，期間每小時攪拌一次，加熱升溫至沸騰后停止升溫，靜置30min，用四層紗布過濾，去除濾渣，將濾液減壓濃縮，使每克浸膏相當于原新鮮蠅蛆5g。

使用蠅蛆消化濃縮膏替代部分牛肉膏是基于以下考慮：蠅蛆作為一種完整的生命個體，營養(yǎng)成分更全面，含有18種氨基酸和7種必需氨基酸，含有豐富的礦物質(zhì)元素、維生素、微量元素及不飽和脂肪酸，其每一種氨基酸含量都高于魚粉。蠅蛆粉與牛肉粉營養(yǎng)價值相近，但營養(yǎng)成分更全面，蠅蛆粉已達到聯(lián)合國糧農(nóng)組織提出的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)飼料標準。因此，為了使種子培養(yǎng)基更有效地培養(yǎng)細菌，在1000毫升培養(yǎng)液體系中添加了蠅蛆消化濃縮膏1.5g。

其中，所述的含有羽毛的發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下：羽毛粉20g/l，k2hpo40.4g/l，feso40.1g/l，nacl0.5g/l，溶劑為水，初始ph7.5，高壓滅菌。

其中，所述的羽毛粉，粒徑為750μm～1200μm，優(yōu)選粒徑為900μm～1100μm。

有益效果：本發(fā)明的蠟樣芽孢桿菌nj-02可直接用于羽毛的降解，對鵝毛的降解效果最佳，在第15天時，降解率達到100％，對鴨毛、雞毛、鴿毛均有較好的降解作用，對雞毛而言，發(fā)酵3天羽毛分解率已有35.3％，鴨毛、雞毛、鴿毛在第15天時降解率都已達75％以上。蠟樣芽孢桿菌nj-02可應(yīng)用于家禽的廢棄物回收利用，促進生態(tài)、循環(huán)養(yǎng)殖，屬安全微生物，可用于羽毛的降解、養(yǎng)殖廢棄物發(fā)酵及生物肥料領(lǐng)域。

附圖說明

圖1為蠟狀芽孢桿菌nj-02菌落形態(tài)。

圖2為蠟樣芽孢桿菌nj-02菌體形態(tài)(革蘭氏染色)。

圖3為蠟樣芽孢桿菌nj-02菌體形態(tài)(芽孢染色)。

圖4為蠟樣芽孢桿菌nj-0216srdna671bpncbi網(wǎng)blast系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

圖5為蠟樣芽孢桿菌nj-02對鵝羽毛降解5天結(jié)果(左管為對照)。

圖6為蠟樣芽孢桿菌nj-02對鵝羽毛降解10天結(jié)果(左管為對照)。

圖7為蠟樣芽孢桿菌nj-02對鵝羽毛降解15天結(jié)果(左管為對照)。

圖8為蠟樣芽孢桿菌nj-02對鴨羽毛降解5天結(jié)果(右管為對照)。

圖9為蠟樣芽孢桿菌nj-02對鴨羽毛降解10天結(jié)果(右管為對照)。

圖10為蠟樣芽孢桿菌nj-02對鴨羽毛降解15天結(jié)果(右管為對照)。

圖11為蠟樣芽孢桿菌nj-02對雞羽毛降解5天結(jié)果(左管為對照)。

圖12為蠟樣芽孢桿菌nj-02對雞羽毛降解10天結(jié)果(左管為對照)。

圖13為蠟樣芽孢桿菌nj-02對雞羽毛降解15天結(jié)果(右管為對照)。

圖14為蠟樣芽孢桿菌nj-02對鴿羽毛降解5天結(jié)果(左管為對照)。

圖15為蠟樣芽孢桿菌nj-02對鴿羽毛降解10天結(jié)果(左管為對照)。

圖16為蠟樣芽孢桿菌nj-02對鴿羽毛降解15天結(jié)果(左管為對照)。

圖17為雞鴨鵝鴿羽毛降解殘留量測定比較。

具體實施方式

根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當也不會限制權(quán)利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。

實施例1：菌株的培養(yǎng)鑒定。

1、原始菌株的獲得

從南京某鴿場取健康鴿子數(shù)只，于酒精燈旁將鴿子進行剖解，并直接用滅菌接種環(huán)采取其盲腸內(nèi)容物劃線接種于普通瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24h后，觀察生長出的單個菌落形態(tài)，取直徑大小6mm左右，邊緣不整齊呈乳白色不透明，表面粗糙呈白蠟狀菌落進行進一步的分離培養(yǎng)，獲得單個菌落后進行純培養(yǎng)。細菌分離培養(yǎng)結(jié)果：通過細菌分離培養(yǎng)，獲得一株純培養(yǎng)細菌，命名為nj-02。分離到的細菌經(jīng)革蘭氏染色和芽孢染色，然后置于光學(xué)顯微鏡油鏡頭下進行觀察。結(jié)果為有芽孢的g+中等大小桿菌，多數(shù)單在，少數(shù)呈3～5個短鏈狀，細菌大小1.0～1.2μm××3.0～5.0μm，芽孢圓形或柱形，中生或近中生，1.0～1.5μm，孢囊無明顯膨大。如附圖1(菌落形態(tài))、圖2(革蘭氏染色)、圖3(芽孢染色)。

2、細菌的生化反應(yīng)鑒定

取分離培養(yǎng)出的單個細菌菌落在載玻片上涂片進行革蘭氏染色和芽孢染色，然后置于光學(xué)顯微鏡油鏡頭下進行觀察。挑取菌落接種于微量生化鑒定管，37℃培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。并按常規(guī)方法接種瓊脂斜面和進行明膠液化試驗、mr試驗、vp試驗、0.01％溶菌酶生長和檸檬酸鹽利用試驗并觀察。結(jié)果見表1。

表1菌株生化反應(yīng)試驗結(jié)果

注：反應(yīng)狀態(tài)分為陽性和陰性，陽性形狀編碼為“+”，陰性形狀編碼為“-”。

從表1可以看出，該菌株賴氨酸、鳥氨酸、精氨酸、檸檬酸鹽、肌醇、側(cè)金盞花醇、水楊苷、1％美藍牛乳均為陰性，v.p試驗、m.r、明膠液化、硝酸鹽、0.01％溶菌酶均為陽性。對照伯杰細菌鑒定手冊第八版，該分離的菌株在生化鑒定上屬于蠟樣芽孢桿菌。

3、細菌16srdna基因片段序列測定及16srdna系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析結(jié)果

為了進一步鑒定該菌種，本研究作了細菌16srdna基因片段序列測定。取分離培養(yǎng)細菌接種瓊脂斜面，37℃培養(yǎng)10h后，送斯普金公司合成測定分離細菌16srdna核苷酸片段序列。

細菌16srdna基因片段pcr產(chǎn)物有669bp序列測序結(jié)果如seqidno.1所示。

將nj-02菌株16srdna669bp核苷酸片段上述測序結(jié)果在ncbi網(wǎng)進行blast，結(jié)果表明，nj-02菌株669bp核苷酸片段與genbank中已知蠟樣芽孢桿菌對應(yīng)核苷酸片段同源性均高達97％以上。具體進化說明見圖4。

綜合通過以上結(jié)果分析表明，該分離的菌株為蠟樣芽孢桿菌(bacilluscereus)。

以下實施例中，菌株nj-02種子液按照如下方法獲得：

(1)蠟樣芽孢桿菌菌株nj-02的活化

將蠟樣芽孢桿菌菌株nj-02劃線于活化培養(yǎng)基上，35℃～40℃下培養(yǎng)24h～48h，由此獲得經(jīng)過活化的nj-02菌株；

(2)種子液的制備

將步驟(1)活化后的菌株，接種于種子培養(yǎng)基中，35～40℃震蕩培養(yǎng)24～36h，得種子液；

其中，所述的活化培養(yǎng)基按如下方法制備得到：稱取營養(yǎng)瓊脂38g，蒸餾水800ml，調(diào)整ph7.5，加蒸餾水至1000ml，高壓滅菌，制得。

其中，所述的種子培養(yǎng)基按如下方法制備得到：稱取牛肉膏1.5g，蠅蛆消化濃縮膏1.5g，蛋白胨5g，nacl5g，k2hpo41g，蒸餾水800ml，初始ph7.5，加蒸餾水至1000毫升，高壓滅菌，制得。

其中，蠅蛆消化濃縮膏自行制備，具體步驟為：將500g新鮮蠅蛆，用水沖洗干凈后，加水至800ml，置組織搗碎機中高速搗碎后，取出置提取罐中，加水沖洗合并，使搗碎后的混合物體積為1500ml，加入胰蛋白酶1.5g(酶活：每毫克胰蛋白酶效價不少于2500酶活單位)，邊加邊攪拌均勻，置于50℃條件下酶解8-10h，期間每小時攪拌一次，加熱升溫至沸騰后停止升溫，靜置30min，用四層紗布過濾，去除濾渣，將濾液減壓濃縮，使每克浸膏相當于原新鮮蠅蛆5g。

實施例2：細菌對雞、鴨、鵝、鴿多種家禽的羽毛降解形態(tài)觀察。

為觀察分離培養(yǎng)出的nj-02蠟樣芽孢桿菌能否對雞、鴨、鵝、鴿多種家禽的羽毛進行降解，設(shè)計了nj-02蠟樣芽孢桿菌對雞、鴨、鵝、鴿多種家禽的羽毛降解形態(tài)觀察試驗。在玻璃試管中加入5ml降解羽毛基礎(chǔ)培養(yǎng)基(k2hpo40.4g/l，nacl0.5g/l，feso40.1g/l初始ph7.5)，和一片潔凈家禽羽毛(雞鴨鵝鴿的羽毛均同樣處理觀察)，高壓滅菌15磅121℃15min，待冷后接種適量分離培養(yǎng)出的細菌，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d～15d后觀察結(jié)果。

1、鵝毛降解情況：第5天羽毛片：羽干不再完整，羽枝變得松軟，大多數(shù)羽小枝解體，羽枝鉤溶解，羽毛網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)消失(見附圖5，左邊為空白對照)。

第10天羽毛片：羽干大部分降解，羽枝消失，羽小枝完全溶解消失(見附圖6，左邊為空白對照)。

第15天羽毛片：羽干全部消失，羽毛整體形態(tài)消失，羽毛絕全部溶解(見附圖7，左邊為空白對照)。每組對照羽毛片：可見到完整的羽干，上面分出眾多的纖細羽枝，每根羽枝上又伸出若干更細的羽小枝，相連的羽小枝上面的小鉤子相互鉤連，羽毛片呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

2、鴨毛降解情況：第5天羽毛片：羽干仍然完整，羽枝變得松軟，羽小枝未解體，少許羽枝鉤溶解，羽毛網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)仍可見(如圖8，右邊為空白對照)。

第10天羽毛片：羽干大部分降解，羽枝消失，羽小枝完全溶解消失(圖9，右邊為空白對照)。

第15天羽毛片：羽干全部消失，僅有少許羽毛纖維狀結(jié)構(gòu)。至此，羽毛整體形態(tài)消失，羽毛絕大多數(shù)溶解(圖10，右邊為空白對照)。

對照羽毛組：可見到完整的羽干，上面分出眾多的纖細羽枝，每根羽枝上又伸出若干更細的羽小枝，相連的羽小枝上面的小鉤子相互鉤連，羽毛片呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

3、雞毛降解情況：第5天羽毛片：羽枝變得松軟，部分羽小枝解體，羽枝鉤溶解，羽毛網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)消失(圖11，左邊為空白對照)。

第10天羽毛片：羽小枝完全溶解消失(圖12，左邊為空白對照)。

第15天羽毛片：羽毛絕大多數(shù)溶解(圖13，右邊為空白對照)。

每組對照羽毛：可見到完整的羽干，上面分出眾多的纖細羽枝，每根羽枝上又伸出若干更細的羽小枝，相連的羽小枝上面的小鉤子相互鉤連，羽毛片呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

4、鴿毛降解情況：第5天羽毛片：羽干仍然完整，羽枝變得松軟，但羽小枝、羽枝鉤及羽毛網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)仍然存在(圖14，左邊為空白對照)。

第10天羽毛片：羽干松軟并稍稍降解，羽枝可見，部分羽小枝溶解消失(圖15，左邊為空白對照)。

第15天羽毛片：羽干有所消失，有少許羽毛纖維狀結(jié)構(gòu)(圖16，左邊為空白對照)。

每組對照原始片：可見到完整的羽干，上面分出眾多的纖細羽枝，每根羽枝上又伸出若干更細的羽小枝，相連的羽小枝上面的小鉤子相互鉤連，羽毛片呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

結(jié)果表明，該菌株對鵝的羽毛降解效果最好，在15d時，羽干全部消失，至此，羽毛整體形態(tài)消失，羽毛絕大多數(shù)溶解。對鴨毛、雞毛及鴿毛也能夠降解絕大多數(shù)。

實施例3：細菌對雞、鴨、鵝、鴿等多種家禽的羽毛降解殘留量測定

羽毛粉預(yù)處理：將收集的羽毛先經(jīng)過0.04％的naoh溶液于20～25℃浸泡1h，用清水漂洗后過濾，烘干，粉碎粒徑在750μm～1200μm之間，備用。

取250ml規(guī)格三角燒瓶24個，各加入粒徑750μm～1200μm的雞羽毛粉1克及發(fā)酵培養(yǎng)基50ml(發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下：k2hpo40.4g/l，feso40.1g/l，nacl0.5g/l，溶劑為水，初始ph7.5，高壓滅菌)，高壓滅菌15磅121℃15min，待冷后備用。然后分成二組，第一組12個，每個各接種適量分離培養(yǎng)出的細菌nj-02(不少于10⁹cfu/ml)，另一組12個作空白對照，置37℃振蕩培養(yǎng)箱中150rpm/min培養(yǎng)后第3天、第5天、第10天及第15天分別從第一組及對照組各取樣3份，取出羽毛粉降解混合物，用滅菌的純水反復(fù)沖洗，濾紙過濾，并將羽毛粉置60-80℃烘干，進行稱重，觀察結(jié)果。鴨、鵝、鴿羽毛同樣處理。

結(jié)果表明，nj-02菌株對鵝毛的降解效果最佳，在第15天時，降解率達到100％，同時nj-02菌株對鴨毛、雞毛、鴿毛均有一定的降解作用，對雞毛而言，發(fā)酵3天羽毛分解率已有35.3％。在第15時雞鴨鴿的羽毛降解率都已達75％以上。

sequencelisting

<110>金陵科技學(xué)院

<120>一種蠟樣芽孢桿菌及其在降解羽毛中的應(yīng)用

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<213>蠟樣芽孢桿菌（bacilluscereus）

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