本發(fā)明屬于干細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化的方法。

背景技術(shù)：

血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞是構(gòu)成血管壁的兩種主要血管細(xì)胞，它們都可以由間充質(zhì)干細(xì)胞分化而來(lái)。間充質(zhì)干細(xì)胞是一種來(lái)源于中胚層具有自我復(fù)制力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，可以分化成脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞和血管細(xì)胞等多種成體細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞分布于全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，生理狀態(tài)下數(shù)量稀少且處于靜息休眠狀態(tài)，受到刺激后遷移至病變部位(也叫做歸巢)，分化為成體細(xì)胞。

vegf(vascularendothelialgrowthfactor)是誘導(dǎo)干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的重要細(xì)胞因子^[1]，其結(jié)構(gòu)上由兩條同源肽鏈通過(guò)二硫鍵連接而成。vegf包括7個(gè)亞型，其中vegf-a應(yīng)用最廣泛，vegf-a有5種異構(gòu)體，它們都能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖。vegfr(vegfreceptor)屬于酪氨酸激酶受體，包括三種亞型，其中vegfr-2主要介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂、存活和通透性，被認(rèn)為是血管新生的一種標(biāo)志^[2]。vegf是一種重要的促有絲分裂原，能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖、遷移和趨化^[3]。

pdgf(platelet-derivedgrowthfactor)是誘導(dǎo)干細(xì)胞向血管平滑肌細(xì)胞分化的重要細(xì)胞因子^[1]，其結(jié)構(gòu)上由兩條肽鏈通過(guò)二硫鍵連接而成，這些肽鏈包括a、b、c和d四種，這使得pdgf具有多種亞型，即為pdgf-aa、pdgf-bb、pdgf-ab、pdgf-cc以及pdgf-dd。pdgfr(pdgfreceptor)由α和β兩個(gè)亞單位構(gòu)成，它們與不同亞型pdgf的親和力差別很大，pdgf-aa和pdgf-cc選擇性結(jié)合pdgfrα亞單位，pdgf-bb和pdgf-ab與pdgfrα和β亞單位都可以結(jié)合，pdgf-dd只結(jié)合pdgfrβ亞單位。pdgf是一種重要的促有絲分裂原，可以誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，從收縮型轉(zhuǎn)化成分泌型，促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移^[4]。

雖然，目前間充質(zhì)干細(xì)胞的分化機(jī)制和誘導(dǎo)分化的信號(hào)通路還不十分清楚，但是間充質(zhì)干細(xì)胞所處的微環(huán)境是決定其分化的重要因素^[5]。在復(fù)雜環(huán)境下(如vegf和pdgf等多種誘導(dǎo)分化因子同時(shí)存在的條件下^[6,7])，間充質(zhì)干細(xì)胞的分化傾向確實(shí)難以判斷。此時(shí)，如何采取有效的方法調(diào)控干細(xì)胞定向分化是本領(lǐng)域的一項(xiàng)技術(shù)難題。

hmgb1(highmobilitygroupbox1)是一種高度保守的小分子核蛋白，結(jié)構(gòu)上包括abox和bbox兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，bbox是hmgb1發(fā)揮促進(jìn)炎癥反應(yīng)作用的功能區(qū)域，abox具有抗炎作用，是抑制hmgb1誘發(fā)炎癥反應(yīng)的拮抗劑。abox和bbox都能夠與dna結(jié)合，并參與dna雙鏈的構(gòu)象改變。hmgb1還是一種損傷相關(guān)分子模式(damageassociatedmoleculepattern)分子，當(dāng)組織受損時(shí)細(xì)胞核內(nèi)hmgb1賴(lài)氨酸殘基發(fā)生乙?；揎?，促使hmgb1由細(xì)胞核轉(zhuǎn)位至細(xì)胞質(zhì)，隨后被釋放到細(xì)胞外傳遞損傷信號(hào)。此外，損傷引起的細(xì)胞死亡(necrosis)可以直接釋放大量hmgb1至細(xì)胞外。細(xì)胞外hmgb1與細(xì)胞膜受體結(jié)合，通過(guò)激活mapk(mitogen-activatedproteinkinase)和nf-κb(nuclearfactorkappa-light-chain-enhancerofactivatedbcells)等下游信號(hào)通路，誘發(fā)炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答^[8]。

前人研究發(fā)現(xiàn)hmgb1可以作為趨化因子促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢^[9,10]，hmgb1過(guò)表達(dá)的間充質(zhì)干細(xì)胞可以分泌細(xì)胞因子vegf和pcna(proliferatingcellnuclearantigen)^[11]。但是，前人研究不涉及hmgb1在間充質(zhì)干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化中的調(diào)控作用，也不涉及hmgb1在間充質(zhì)干細(xì)胞向血管平滑肌細(xì)胞分化中的調(diào)控作用。以上涉及的參考文獻(xiàn)如下：

[1]patschc,challet-meylanl,thomaec,etal.generationofvascularendothelialandsmoothmusclecellsfromhumanpluripotentstemcells[j].natcellbiol,2015,17(8):994-1003.

[2]kajdaniukd,marekb,borgiel-marekh,etal.vascularendothelialgrowthfactor(vegf)-part1:inphysiologyandpathophysiology[j].endokrynolpol,2011,62(5):444-455.

[3]wux,zhaoy,tangc,etal.re-endothelializationstudyonendovascularstentsseededbyendothelialcellsthroughup-ordownregulationofvegf[j].acsapplmaterinterfaces,2016,8(11):7578-7589.

[4]spinjm,maegdefessell,tsaops.vascularsmoothmusclecellphenotypicplasticity:focusonchromatinremodelling[j].cardiovascres,2012,95(2):147-155.

[5]劉佳佳,張亦婷,彭航,等.間充質(zhì)干細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化治療中的研究進(jìn)展[j].生物工程學(xué)報(bào),2013,29(11):1538-1547.

[6]nykanenai,krebsr,tikkanenjm,etal.combinedvascularendothelialgrowthfactorandplatelet-derivedgrowthfactorinhibitioninratcardiacallografts:beneficialeffectsoninflammationandsmoothmusclecellproliferation[j].transplantation,2005,79(2):182-189.

[7]cagnins,biscuolam,patuzzoc,etal.reconstructionandfunctionalanalysisofalteredmolecularpathwaysinhumanatheroscleroticarteries[j].bmcgenomics,2009,10:13.

[8]huebenerp,hernandezc,schwaberf.hmgb1andinjuryamplification[j].oncotarget,2015,6(27):23048-23049.

[9]lotfir,eisenbacherj,solgig,etal.humanmesenchymalstemcellsrespondtonativebutnotoxidizeddamageassociatedmolecularpatternmoleculesfromnecrotic(tumor)material[j].eurjimmunol,2011,41(7):2021-2028.

[10]xiehl,zhangy,huangyz,etal.regulationofhighmobilitygroupbox1andhypoxiainthemigrationofmesenchymalstemcells[j].cellbiolint,2014,38(7):892-897.

[11]nius,jianl,zhangl.protectiveeffectsofmesenchymalstemcellswithtransientoverexpressionofhmgblonballoon-inducedcarotidarteryinjury[j].europeanjournalofinflammation,2012,10(3):347-356.

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化的方法，該方法可以促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化，同時(shí)又能抑制間充質(zhì)干細(xì)胞向血管平滑肌細(xì)胞分化。

本發(fā)明的目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化的方法，具體為：上調(diào)間充質(zhì)干細(xì)胞中hmgb1的表達(dá)。

所述定向分化的分化方向?yàn)椋捍龠M(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化，抑制間充質(zhì)干細(xì)胞向血管平滑肌細(xì)胞分化。

所述定向分化的方法為：利用攜帶表達(dá)所述hmgb1基因的慢病毒轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞，促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞中hmgb1表達(dá)上調(diào)。

所述攜帶表達(dá)hmgb1基因的慢病毒的構(gòu)建過(guò)程為：采用primer-blast軟件設(shè)計(jì)兩條引物用于rt-pcr擴(kuò)增hmgb1cdna，兩端插入flag蛋白編碼序列、終止序列及限制性酶切識(shí)別位點(diǎn)，取合成的寡核苷酸片段，退火，在t4dna連接酶作用下，連接入經(jīng)限制性酶切線(xiàn)性化的慢病毒穿梭質(zhì)粒，獲得連接產(chǎn)物plvth-hmgb1-gfp-puro，轉(zhuǎn)化感受態(tài)dh-5α大腸桿菌，經(jīng)卡那霉素篩選擴(kuò)增后，利用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取純化質(zhì)粒，酶切后測(cè)序鑒定，證實(shí)穿梭質(zhì)粒中插入片段的堿基序列與設(shè)計(jì)序列完全一致，并設(shè)陰性對(duì)照重組質(zhì)粒；取慢病毒穿梭質(zhì)粒plvth-hmgb1-gfp-puro、包裝質(zhì)粒pcmv-dr8.2dvpr和包膜質(zhì)粒pcmv-vsv-g共同轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞，包裝獲得攜帶hmgb1基因的慢病毒質(zhì)粒，即plv-hmgb1；該病毒質(zhì)粒中還含有嘌呤霉素抗性基因(puro)和綠色熒光蛋白基因(gfp)，與hmgb1基因在同一個(gè)啟動(dòng)子調(diào)控下實(shí)現(xiàn)共同表達(dá)；陰性對(duì)照病毒(plv-control)不含hmgb1cdna，但保留嘌呤霉素抗性基因和綠色熒光蛋白基因。

所述轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞的方法為：將所述慢病毒轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，經(jīng)蛋白定量檢測(cè)確定細(xì)胞hmgb1表達(dá)上調(diào)。

更進(jìn)一步地，所述轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞的方法為：將間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁培養(yǎng)在dmem培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液中添加了10％胎牛血清和青霉素-鏈霉素抗菌液。將間充質(zhì)干細(xì)胞接種于六孔培養(yǎng)板中，每孔含2×10⁵個(gè)細(xì)胞，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，加入plv-hmgb1(陰性對(duì)照組加入plv-control)，再培養(yǎng)8小時(shí)后更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)第4天加入嘌呤霉素篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)染克隆，借助免疫熒光顯微鏡觀察陽(yáng)性轉(zhuǎn)染細(xì)胞(發(fā)綠色熒光)。使用westernblot檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的蛋白表達(dá)情況，檢測(cè)hmgb1表達(dá)所用一抗為兔抗大鼠hmgb1抗體，二抗為hrp標(biāo)記山羊抗兔抗體，通過(guò)病毒轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)的hmgb1含有flag蛋白標(biāo)記，可以用抗flag抗體檢測(cè)，所用一抗為小鼠抗flag抗體，二抗為hrp標(biāo)記山羊抗小鼠抗體。

本發(fā)明采用上調(diào)hmgb1表達(dá)的方法，獲得以下有益效果：

采用hmgb1表達(dá)上調(diào)方法改變間充質(zhì)干細(xì)胞的分化傾向，促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞在vegf誘導(dǎo)下向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化，抑制間充質(zhì)干細(xì)胞在pdgf誘導(dǎo)下向血管平滑肌細(xì)胞分化。

附圖說(shuō)明

圖1-1：plv-control轉(zhuǎn)染的間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)gfp(發(fā)綠色熒光)；

圖1-2：plv-hmgb1轉(zhuǎn)染的間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)gfp(發(fā)綠色熒光)；

圖1-3：westernblot檢測(cè)plv-control和plv-hmgb1轉(zhuǎn)染的間充質(zhì)干細(xì)胞hmgb1表達(dá)情況；

圖1-4：westernblot檢測(cè)plv-hmgb1轉(zhuǎn)染的間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)有flag標(biāo)記的hmgb1；

圖2-1：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)plv-control和plv-hmgb1轉(zhuǎn)染的間充質(zhì)干細(xì)胞向cd31表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞分化情況；

圖2-2：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)plv-control和plv-hmgb1轉(zhuǎn)染的間充質(zhì)干細(xì)胞向αsma表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞分化情況；

圖3-1：熒光顯微鏡下檢查plv-control大鼠移植動(dòng)脈新生血管內(nèi)膜gfp標(biāo)記細(xì)胞(發(fā)綠色熒光)；

圖3-2：熒光顯微鏡下檢查plv-control大鼠移植動(dòng)脈新生血管內(nèi)膜cd31表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞(發(fā)紅色熒光)；

圖3-3：熒光顯微鏡下檢查plv-hmgb1大鼠移植動(dòng)脈新生血管內(nèi)膜gfp標(biāo)記細(xì)胞(發(fā)綠色熒光)；

圖3-4：熒光顯微鏡下檢查plv-hmgb1大鼠移植動(dòng)脈新生血管內(nèi)膜cd31表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞(發(fā)紅色熒光)；

圖3-5：熒光顯微鏡下檢查plv-control大鼠移植動(dòng)脈新生血管內(nèi)膜gfp標(biāo)記細(xì)胞(發(fā)綠色熒光)；

圖3-6：熒光顯微鏡下檢查plv-control大鼠移植動(dòng)脈新生血管內(nèi)膜αsma表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞(發(fā)紅色熒光)；

圖3-7：熒光顯微鏡下檢查plv-hmgb1大鼠移植動(dòng)脈新生血管內(nèi)膜gfp標(biāo)記細(xì)胞(發(fā)綠色熒光)；

圖3-8：熒光顯微鏡下檢查plv-hmgb1大鼠移植動(dòng)脈新生血管內(nèi)膜αsma表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞(發(fā)紅色熒光)。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明采用的調(diào)控方法進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實(shí)施例1：制備hmgb1過(guò)表達(dá)的間充質(zhì)干細(xì)胞

1、材料和試劑，見(jiàn)下表1：

表1

2、方法：

病毒構(gòu)建過(guò)程：primer-blast軟件設(shè)計(jì)兩條引物用于rt-pcr擴(kuò)增hmgb1cdna，兩端插入flag蛋白編碼序列、終止序列及限制性酶切識(shí)別位點(diǎn)，取合成的寡核苷酸片段，緩慢退火，在t4dna連接酶作用下，連接入經(jīng)限制性酶切線(xiàn)性化的慢病毒穿梭質(zhì)粒，獲得連接產(chǎn)物plvth-hmgb1-gfp-puro，轉(zhuǎn)化感受態(tài)dh-5α大腸桿菌，經(jīng)卡那霉素篩選擴(kuò)增后，利用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取純化質(zhì)粒，酶切后測(cè)序鑒定，證實(shí)穿梭質(zhì)粒中插入片段的堿基序列與設(shè)計(jì)序列完全一致，并設(shè)陰性對(duì)照重組質(zhì)粒。取慢病毒穿梭質(zhì)粒plvth-hmgb1-gfp-puro、包裝質(zhì)粒pcmv-dr8.2dvpr和包膜質(zhì)粒pcmv-vsv-g共同轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞，包裝獲得攜帶hmgb1基因的慢病毒質(zhì)粒(plv-hmgb1)。該病毒質(zhì)粒中還含有嘌呤霉素抗性基因(puro)和綠色熒光蛋白基因(gfp)，與hmgb1基因在同一個(gè)啟動(dòng)子調(diào)控下實(shí)現(xiàn)共同表達(dá)。陰性對(duì)照病毒(plv-control)不含hmgb1cdna，但保留嘌呤霉素抗性基因和綠色熒光蛋白基因。

病毒轉(zhuǎn)染過(guò)程：間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁培養(yǎng)在dmem培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液中添加了10％胎牛血清和青霉素-鏈霉素抗菌液。將間充質(zhì)干細(xì)胞接種于六孔培養(yǎng)板中，每孔含2×10⁵個(gè)細(xì)胞，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，加入plv-hmgb1(陰性對(duì)照組加入plv-control)，再培養(yǎng)8小時(shí)后更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)第4天加入嘌呤霉素篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)染克隆，借助免疫熒光顯微鏡觀察陽(yáng)性轉(zhuǎn)染細(xì)胞(發(fā)綠色熒光)。使用westernblot檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞的蛋白表達(dá)情況，檢測(cè)hmgb1表達(dá)所用一抗為兔抗大鼠hmgb1抗體，二抗為hrp標(biāo)記山羊抗兔抗體，通過(guò)病毒轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)的hmgb1含有flag蛋白標(biāo)記，可以用抗flag抗體檢測(cè)，所用一抗為小鼠抗flag抗體，二抗為hrp標(biāo)記山羊抗小鼠抗體。

3、結(jié)果：病毒轉(zhuǎn)染后大于99.9％間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)gfp，發(fā)綠色熒光(見(jiàn)圖1-1和圖1-2)，plv-hmgb1轉(zhuǎn)染的間充質(zhì)干細(xì)胞hmgb1表達(dá)水平比plv-control顯著升高(圖1-3)，檢測(cè)到plv-hmgb1轉(zhuǎn)染的間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)含有flag蛋白標(biāo)記的hmgb1(圖1-4)。由此表明采用病毒轉(zhuǎn)染的方法，間充質(zhì)干細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了hmgb1表達(dá)上調(diào)。

實(shí)施例2：實(shí)施例1中hmgb1過(guò)表達(dá)的間充質(zhì)干細(xì)胞體外分化能力的評(píng)價(jià)

1、材料和試劑，見(jiàn)下表2：

表2

2、方法：培養(yǎng)液中加入vegf誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化，vegf在培養(yǎng)液中濃度為25ng/ml，體外培養(yǎng)14天；培養(yǎng)液中加入pdgf誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向血管平滑肌細(xì)胞分化，pdgf在培養(yǎng)液中濃度為12.5ng/ml，體外培養(yǎng)14天。

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分化結(jié)果。cd31是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性蛋白標(biāo)記，流式細(xì)胞術(shù)中用pe標(biāo)記cd31抗體檢測(cè)cd31表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞，細(xì)胞cd31表達(dá)陽(yáng)性提示成功分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞。αsma是血管平滑肌細(xì)胞特異性蛋白標(biāo)記，流式細(xì)胞術(shù)中用pe標(biāo)記αsma抗體檢測(cè)αsma表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞，細(xì)胞αsma表達(dá)陽(yáng)性提示成功分化成血管平滑肌細(xì)胞。

3、結(jié)果：plv-hmgb1轉(zhuǎn)染的間充質(zhì)干細(xì)胞分化成cd31表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞的比例比plv-control增加(圖2-1，圖中豎線(xiàn)表示使用同型對(duì)照抗體設(shè)置的陰性閾值)，分化成αsma表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞的比例比plv-control降低(圖2-2，圖中豎線(xiàn)表示使用同型對(duì)照抗體設(shè)置的陰性閾值)。由此可見(jiàn)上調(diào)hmgb1表達(dá)可以促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化，抑制間充質(zhì)干細(xì)胞向血管平滑肌細(xì)胞分化。

實(shí)施例3：實(shí)施例1中hmgb1過(guò)表達(dá)的間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)分化能力的評(píng)價(jià)

1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，見(jiàn)下表3：

表3

2、方法：

構(gòu)建移植動(dòng)脈硬化模型：f344和lewis都是近交系大鼠，它們的基因型比較接近，主要組織相容性復(fù)合體(mhc)位點(diǎn)基本一樣，只是非mhc上部分不同，因此，這兩個(gè)品系大鼠之間移植的腹主動(dòng)脈可以發(fā)生慢性排斥反應(yīng)，在病理形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為移植動(dòng)脈硬化。首先獲取lewis大鼠的腹主動(dòng)脈作為移植物，然后取f344大鼠為受體鼠，阻斷血流后剪斷腹主動(dòng)脈，將lewis大鼠的腹主動(dòng)脈橋接在兩側(cè)斷端之間，恢復(fù)腹主動(dòng)脈通暢性。術(shù)后90天發(fā)現(xiàn)移植入腹主動(dòng)脈發(fā)生動(dòng)脈硬化。

動(dòng)物分組和處理方式：取移植動(dòng)脈硬化模型大鼠24只，分成兩組，每組8只，詳見(jiàn)表4。兩組大鼠從移植術(shù)后30天開(kāi)始以尾靜脈注射的方式分別接種實(shí)施例1中兩種慢病毒轉(zhuǎn)染的間充質(zhì)干細(xì)胞，每次接種細(xì)胞量2×10⁶個(gè)細(xì)胞，每15天接種一次，共4次。

表4.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組

術(shù)后90天取大鼠移植動(dòng)脈制作冰凍切片，利用免疫熒光技術(shù)標(biāo)記cd31表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞和αsma表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞，分析比對(duì)歸巢細(xì)胞(發(fā)綠色熒光)表達(dá)cd31和αsma情況。

3、結(jié)果：plv-hmgb1組大鼠的新生血管內(nèi)膜中歸巢細(xì)胞表達(dá)cd31(圖3-3和圖3-4是同一視野，注意箭頭標(biāo)記的細(xì)胞)的比例比plv-control組升高(圖3-1和圖3-2是同一視野，注意箭頭標(biāo)記的細(xì)胞)，plv-hmgb1組大鼠的新生血管內(nèi)膜中歸巢細(xì)胞表達(dá)αsma(圖3-8和圖3-7是同一視野，注意箭頭標(biāo)記的細(xì)胞)的比例比plv-control組降低(圖3-5和圖3-6是同一視野，注意箭頭標(biāo)記的細(xì)胞)降低。由此可見(jiàn)hmgb1可以促進(jìn)移植動(dòng)脈新生血管內(nèi)膜中歸巢細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化，抑制其向血管平滑肌細(xì)胞分化。