本發(fā)明涉及免疫學(xué)和分子生物學(xué)，t淋巴細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種利用piggybac系統(tǒng)制備分泌il-12cd19car-t細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)：

白血病俗稱(chēng)“血癌”，是一類(lèi)起源于造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病?？寺⌒园籽〖?xì)胞不斷增生，浸潤(rùn)其他非造血組織和器官，并抑制正常造血功能。在中國(guó)每年大約有上萬(wàn)名患者被診斷為b系急性淋巴白血病(b-all)，美國(guó)大約有80％的人急性白血病都是b-all，其中80％的b-all患者被一線(xiàn)化化療所緩解，但仍有60％的b-all會(huì)復(fù)發(fā)。由于白血病分型和預(yù)后分層復(fù)雜，如按起病的緩急可分為急、慢性白血病，按病變細(xì)胞種類(lèi)分類(lèi)，包括髓系和淋巴系，淋巴系又包括t和b細(xì)胞系，因此沒(méi)有千篇一律的治療方法。治療這些患者的一個(gè)方法是基因修飾t細(xì)胞以通過(guò)嵌合抗原受體(chimericantigenreceptor,car)的表達(dá)，靶向并結(jié)合在腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的抗原，將信號(hào)傳遞至細(xì)胞內(nèi)，引起t細(xì)胞增殖活化，從而靶向殺傷腫瘤細(xì)胞。

car分子主要包括胞外抗原結(jié)合區(qū)、穿膜區(qū)和胞內(nèi)信號(hào)區(qū)。第一代car由scfv、穿膜區(qū)、cd3ζ鏈或fcεriγ鏈組成，但表現(xiàn)出有限的擴(kuò)增性和持久性，以及有限的抗腫瘤效應(yīng)。第二、三代car則在第一代的基礎(chǔ)上分別引入一個(gè)或者兩個(gè)共刺激信號(hào)域(如cd28、4-1bb)，顯著提高了car-t細(xì)胞的增值能力和抗腫瘤作用，延長(zhǎng)了car-t細(xì)胞在體內(nèi)的持續(xù)存在時(shí)間。

cd19作為b-all的一個(gè)理想治療靶點(diǎn)，在治療難治性b細(xì)胞惡性腫瘤獲得了較高的緩解率。目前cd19car-t在治療兒童和成人復(fù)發(fā)b-all，慢性淋巴細(xì)胞白血病(cll)，和b細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤(b-nhl)表現(xiàn)出穩(wěn)定高效的抗腫瘤效力。在peter研究小組中，給復(fù)發(fā)難治的cll病人輸注自體含有4-1bb共刺激信號(hào)的cd19-car-t細(xì)胞后，觀察到持續(xù)超過(guò)兩年的緩解，大多數(shù)病人低劑量cd19car-t細(xì)胞輸注后，觀察到car-t細(xì)胞在體內(nèi)大量增殖、伴隨著腫瘤溶解和正常b細(xì)胞的缺乏。

靶向cd19分子的car-t細(xì)胞在針對(duì)難治、復(fù)發(fā)的b細(xì)胞來(lái)源的血液腫瘤的治療上，獲得了傳統(tǒng)療法無(wú)法達(dá)到的臨床療效，完全緩解率(cr)普遍達(dá)到了80％，有些臨床試驗(yàn)甚至高達(dá)100％，成為當(dāng)下腫瘤免疫治療中最為引人關(guān)注的領(lǐng)域。不過(guò)也暴露出在car-t細(xì)胞持久性較差、抗原逃逸導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)及安全性隱患等問(wèn)題：(1)存活時(shí)間短。存活時(shí)間的長(zhǎng)短已被證明與療效密切相關(guān)，確?；剌敽蟮腸ar-t細(xì)胞在患者體內(nèi)的存活時(shí)間成為關(guān)鍵；(2)易復(fù)發(fā)。car-t細(xì)胞體內(nèi)存活時(shí)間不夠長(zhǎng)，抗原丟失產(chǎn)生免疫逃逸機(jī)制，最終導(dǎo)致復(fù)發(fā)；(3)制備成功率不高。常用逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)來(lái)制備car-t，能有效感染宿主細(xì)胞，但其裝載量有限，且重組病毒顆粒制備工藝較復(fù)雜。并且患者由于進(jìn)行過(guò)多種治療，會(huì)使其t細(xì)胞活性過(guò)低，體外培養(yǎng)無(wú)法保證回輸car-t的量。

il-12是細(xì)胞免疫應(yīng)答過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，具有重要的生物活性。il-12能夠激活自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和t細(xì)胞，促進(jìn)其分泌大量的ifn-γ，以抑制并殺傷腫瘤細(xì)胞，專(zhuān)利號(hào)201510979423.7中利用含il-12/突變型cd62l融合基因的慢病毒修飾抗腫瘤t細(xì)胞，可以增加t細(xì)胞對(duì)腫瘤的毒殺效應(yīng)，然而該方法使用的慢病毒載體感染t細(xì)胞，存在一定的致癌內(nèi)險(xiǎn)，同時(shí)所設(shè)計(jì)的t細(xì)胞沒(méi)有特異性，具有一定的毒副作用。為了進(jìn)一步改良car的設(shè)計(jì)，建立一種克服上述缺陷的制備cd19car-t細(xì)胞的方法，特提出本發(fā)明。針對(duì)car-t細(xì)胞存活時(shí)間短、血液腫瘤易復(fù)發(fā)的問(wèn)題，本發(fā)明在cd19car-t所涉及的car表達(dá)載體上加入內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(ires)和il-12基因序列，從而使設(shè)計(jì)的cd19cart能夠表達(dá)分泌il-12，增強(qiáng)腫瘤的殺傷效應(yīng)；針對(duì)cd19car-t細(xì)胞制備成功率不高的問(wèn)題，本發(fā)明使用piggybac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，制備工藝相對(duì)簡(jiǎn)單，可塑性高，通過(guò)與其他功能蛋白融合或改變轉(zhuǎn)座酶的功能區(qū)域等，不僅能夠改變轉(zhuǎn)座酶的活性和作用方式，最重要的是可以提高外源基因轉(zhuǎn)座的靶向性；同時(shí)，本發(fā)明避免使用病毒載體，降低了致癌風(fēng)險(xiǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供了一種制備分泌il-12cd19car-t細(xì)胞的方法，該方法簡(jiǎn)單易行，分泌il-12cd19car-t細(xì)胞有效性更好，安全性更高。

本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：

一種制備分泌il-12cd19car-t細(xì)胞的方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)pbmc細(xì)胞制備；

(2)制備表達(dá)抗cd19嵌合抗原受體和分泌il-12的質(zhì)粒；

(3)將步驟(2)中制備的表達(dá)抗cd19嵌合抗原受體和分泌il-12的質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒和amaxa電轉(zhuǎn)試劑盒中的電轉(zhuǎn)試劑混合，加入pbmc細(xì)胞中進(jìn)行電轉(zhuǎn)染，然后采用偶聯(lián)cd3/cd/28抗體的磁珠富集cd3陽(yáng)性t細(xì)胞，篩選并培養(yǎng)擴(kuò)增轉(zhuǎn)染后的t細(xì)胞制備分泌il-12cd19car-t細(xì)胞。

進(jìn)一步地，所述pbmc細(xì)胞是由外周血中制得，pbmc細(xì)胞制備具體步驟為：(1)用抗凝管采集外周血，邊采集邊搖晃使外周血與抗凝劑充分混合；(2)外周血細(xì)胞與淋巴細(xì)胞分離液等體積混合，離心，吸取離心后的白膜層細(xì)胞；(3)將得到的白膜層細(xì)胞與pbs或者無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基1640混合后離心，沉淀即為所述pbmc細(xì)胞，重復(fù)三遍。

進(jìn)一步的，所述表達(dá)抗cd19嵌合抗原受體和分泌il-12的質(zhì)粒是利用piggybac-transposon載體依次串聯(lián)人啟動(dòng)子、csf2ra嵌合受體信號(hào)肽、胞膜外抗原結(jié)合區(qū)、鉸鏈區(qū)、胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)、t2a短肽連接的抗性基因puromycin和ires連接的hil-12f制備而成的。

進(jìn)一步地，所述胞膜外抗原結(jié)合區(qū)為用于結(jié)合cd19蛋白的cd19單鏈抗體(scfv)，依次串聯(lián)c-myc表位標(biāo)記、cd8hinge嵌合受體鉸鏈、cd8transmembrane嵌合受體跨膜區(qū)。

進(jìn)一步地，所述胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)為cd28-4-1bb-itam，cd28和4-1bb為嵌合受體共刺激分子。

本發(fā)明的有益效果：相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明優(yōu)選采用第三代car，使用piggybac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)提高了轉(zhuǎn)染效率和轉(zhuǎn)基因的表達(dá)效率；采用人自身的ef1α啟動(dòng)子，使car基因能夠在人體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)表達(dá)；此外，本發(fā)明所制備的t細(xì)胞還能分泌il-12，有利于t細(xì)胞和nk細(xì)胞的活化，增強(qiáng)了t細(xì)胞的抗腫瘤能力?？梢?jiàn)，本發(fā)明所述的分泌il-12cd19car-t細(xì)胞的制備將給淋巴細(xì)胞白血病的免疫治療提供可靠的保障。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為使用的pb-cd19car-t-bbz-puro表達(dá)載體的基因結(jié)構(gòu)圖；

圖2為分泌il-12cd19car-t細(xì)胞和cd19car-t細(xì)胞中car表達(dá)率的對(duì)比結(jié)果圖；

圖3為分泌il-12cd19car-t細(xì)胞和cd19car-t細(xì)胞，分別與raji人淋巴瘤細(xì)胞和k562白血病細(xì)胞系共培養(yǎng)后，細(xì)胞毒殺傷能力檢測(cè)的對(duì)比圖。

圖4為分泌il-12cd19car-t細(xì)胞和cd19car-t細(xì)胞il-12分泌量檢測(cè)結(jié)果圖；

具體實(shí)施方式

展示一下實(shí)例來(lái)具體說(shuō)明本發(fā)明的某些實(shí)施例，且不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明的范圍。對(duì)本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容可以同時(shí)從材料、方法和反應(yīng)條件進(jìn)行改進(jìn)，所有這些改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明的的精神和范圍之內(nèi)。

實(shí)施例1：

pbmc細(xì)胞制備

用抗凝管采集健康人外周血，邊采集邊搖晃使得外周血與抗凝劑充分混合；將抗凝血緩慢加入裝有等體積的淋巴細(xì)胞分離液(ficoll)的50ml離心管中，450g，慢升慢降離心25min，中間不能停止離心；離心結(jié)束后，小心吸取淋巴細(xì)胞分離液上方的白膜層細(xì)胞，轉(zhuǎn)入一個(gè)新的50ml離心管中，加入pbs，300g，慢升慢降離心10min，棄上清，保留離心管底部的細(xì)胞沉淀；再次加入pbs，160g，慢升慢降離心15min，棄上清；最后加入pbs，300g，慢升慢降離心10min，棄上清，即得到pbmc細(xì)胞。

實(shí)施例2：

制備car-t細(xì)胞

將pbmc用含10％fbs的aim-v培養(yǎng)基(含il-12細(xì)胞因子)進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞激活一段時(shí)間后細(xì)胞數(shù)目達(dá)到2-3×10⁷個(gè)。

如圖1所示piggybac-transposon載體結(jié)構(gòu)圖(pb-cd19car-bbz-puro-hil-12f)，包括依次串聯(lián)的人ef1α啟動(dòng)子、csf2ra嵌合受體信號(hào)肽、胞膜外抗原結(jié)合區(qū)、鉸鏈區(qū)、胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)、t2a短肽連接的抗性基因puromycin和ires連接的hil-12f制備而成的。具體步驟為：將piggybac-transposon載體、轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒各5μg與amaxa電轉(zhuǎn)試劑盒中的電轉(zhuǎn)試劑混合，獲得包含該2種質(zhì)粒的100μl電轉(zhuǎn)混合液，其中原始質(zhì)粒pb-cd19car-bbz-puro和轉(zhuǎn)座酶2個(gè)質(zhì)粒作為對(duì)照；將所述兩組電轉(zhuǎn)混合液加入2-3×10⁷個(gè)pbmc細(xì)胞中進(jìn)行電轉(zhuǎn)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染2h后換液，采用偶聯(lián)cd3/cd/28抗體的磁珠富集cd3陽(yáng)性t細(xì)胞；轉(zhuǎn)染5-6天后加入0.5μg/ml的puromycin，篩選并培養(yǎng)擴(kuò)增轉(zhuǎn)染后的t細(xì)胞，而獲得car-t細(xì)胞。

實(shí)施例3：

分泌il-12cd19-car-t細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果評(píng)估

分別培養(yǎng)k562細(xì)胞、raji細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞il-12cd19-car-t、cd19-car-t。

收集靶細(xì)胞(k562、raji)各4×10⁵cells和效應(yīng)細(xì)胞(cart細(xì)胞)各3×10⁶cells，300g，離心10min，慢升慢降，棄上清；用1mlpbs溶液分別重懸靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞，300g，離心10min，慢升慢降，棄上清；重復(fù)一次；用700μl培養(yǎng)基(aim-v培養(yǎng)基+10％fbs)重懸效應(yīng)細(xì)胞，用2ml培養(yǎng)基(1640培養(yǎng)基+10％fbs)重懸靶細(xì)胞。

設(shè)置效靶比為0.5:1、1:1、5:1、10:1的實(shí)驗(yàn)孔，將分泌il-12cd19car-t、cd19car-t以及未修飾的t細(xì)胞與靶細(xì)胞共培養(yǎng)，應(yīng)用ldh乳酸脫氫酶-細(xì)胞毒性檢測(cè)分析試劑盒(ldh-cytotoxicityassaykit,biovision)檢測(cè)遺傳修飾前后的t細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的體外殺傷能力，方法如下：靶細(xì)胞鋪96孔板((5×10³/孔)，設(shè)培養(yǎng)基背景、體積校正、靶細(xì)胞自發(fā)ldh釋放、靶細(xì)胞最大ldh釋放、效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)ldh釋放對(duì)照孔，實(shí)驗(yàn)組孔，每組重復(fù)3孔，每個(gè)孔的終體積相同且不少于100μl。250g離心4min，在37℃，5％co2孵育至少4h。在離心前45min，向靶細(xì)胞最大釋放孔加入10×裂解液，體積校正孔加入等量的裂解液。再次離心，從每孔轉(zhuǎn)移50μl上清至新的96孔板中，再加入50μl底物溶液，室溫避光孵育30min。每孔加入50μl終止液，1h內(nèi)測(cè)定d490。細(xì)胞毒性(％)＝[(d實(shí)驗(yàn)孔―d培養(yǎng)基背景孔)―(d效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)ldh釋放孔―d培養(yǎng)基背景孔)―(d靶細(xì)胞自發(fā)ldh釋放孔―d培養(yǎng)基背景孔)]/[(d靶細(xì)胞最大ldh釋放孔―d體積校正孔)―(d靶細(xì)胞自發(fā)ldh釋放孔―d培養(yǎng)基背景孔)]×100％。結(jié)果如圖3所示，分泌il-12cd19-car-t細(xì)胞在raji靶細(xì)胞中不同效靶比條件下殺傷效率明顯高于普通的cd19-car-t細(xì)胞。

實(shí)施例4：

elisa檢測(cè)共培養(yǎng)條件下分泌il-12cd19-car-t細(xì)胞il-12的分泌

包被：將5×的包被緩沖液用雙蒸水稀釋成1×，按il-12elisa試劑盒說(shuō)明書(shū)將capture抗體稀釋于1×的包被緩沖液中，在試劑盒中提供的96孔板中各反應(yīng)孔加入100μl，用塑料貼紙覆蓋96孔板，4℃過(guò)夜。

封閉：次日，用自動(dòng)elisa洗板機(jī)洗滌4次后，拋干，用1×分析緩沖液200μl進(jìn)行封閉1小時(shí)。

加樣：洗滌4次后，拋干，各反應(yīng)孔加入待檢測(cè)ca19cart細(xì)胞與靶細(xì)胞(k562、raji)共培養(yǎng)的上清100μl或相應(yīng)倍數(shù)的稀釋上清及il-12標(biāo)準(zhǔn)品(1000pg/ml，倍比稀釋至15.6pg/ml)，室溫孵育2小時(shí)。

加檢測(cè)抗體：洗滌4次后，拋干，按說(shuō)明書(shū)指定將detection抗體用1×分析緩沖液稀釋?zhuān)?00μl加入各反應(yīng)孔中，室溫孵育1小時(shí)。

加hrp標(biāo)記的二抗：洗滌4次后，拋干，按說(shuō)明書(shū)指定將hrp標(biāo)記的抗體用1×分析緩沖液稀釋?zhuān)?00μl加入各反應(yīng)孔中，室溫孵育0.5小時(shí)。

加底物反應(yīng)液：洗滌4次后，拋干，于各反應(yīng)孔中加入新鮮配制的tmb底物溶液100μl，避光孵育15分鐘。

終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入1m硫酸100μl。

結(jié)果判斷：在elisa檢測(cè)儀上，空白孔調(diào)零，于450nm處測(cè)各孔吸光值(od值)，計(jì)算il-12濃度值。

從檢測(cè)結(jié)果圖4可以看出，當(dāng)k562、raji細(xì)胞與il-12ca19car-t細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，可以檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)大量分泌il-2細(xì)胞因子，而與ca19car-t細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)液上清中只能檢測(cè)到少量的il-2，但相比之下與對(duì)照組t細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)液上清中只能檢測(cè)到微量的il-2分泌，表明分泌il-12ca19car-t細(xì)胞中il-12的分泌量要高于普通ca19car-t細(xì)胞。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>尚小云

<120>一種制備分泌il-12cd19car-t細(xì)胞的方法

<130>2017

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>7704

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

actcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggata60

catatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaa120

agtgccacctaaattgtaagcgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaa180

atcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaa240

tagaccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaac300

gtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaa360

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