本發(fā)明屬于生物發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種食藥用菌發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
食藥用菌是一類具有食用或藥用價(jià)值的大型真菌，近年來，由于其富含多種營(yíng)養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)，日益受到人們的青睞。
紅栓菌(trametescinnabarina(jacq.)fr.)是擔(dān)子菌門擔(dān)子菌綱多孔菌目生物，子實(shí)體無柄，菌蓋木栓質(zhì)，半圓形或扇形而基部狹小，有清熱除濕、消炎、解毒作用，多被作為中藥使用。目前，紅栓菌菌種的生物發(fā)酵產(chǎn)物中受關(guān)注較多的是其具有腫瘤抑制作用的多糖，對(duì)其他成分的研究未見報(bào)道。
現(xiàn)有山奈酚和/或芥子酸的獲得多采用從富含山奈酚和/或芥子酸的植物(例如富含山奈酚的鳳仙花，富含芥子酸的白芥等植物)中直接提取，需要大量的植物原料來維持產(chǎn)量，成本普遍偏高，也不夠綠色環(huán)保。
膜聯(lián)蛋白(annexins)是一類同源的水溶性多功能蛋白，可以在依賴和不依賴ca2+的環(huán)境下與內(nèi)膜和質(zhì)膜結(jié)合或形成跨膜結(jié)構(gòu)，存在于部分原核生物以及全部的真核生物中，在大多數(shù)高等生物中以多基因家族形式存在。膜聯(lián)蛋白在細(xì)胞分泌調(diào)控和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著重要作用，它還對(duì)活化血小板及凋亡細(xì)胞有極高的親和力。
將膜聯(lián)蛋白用于食藥用菌紅栓菌的發(fā)酵生產(chǎn)，提高其發(fā)酵產(chǎn)物中山奈酚和芥子酸的含量，國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種食藥用菌發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法，其利用膜聯(lián)蛋白提高食藥用菌發(fā)酵產(chǎn)物中山奈酚和芥子酸的含量，為得到富含山奈酚和芥子酸的產(chǎn)物提供了新的途徑。
一種食藥用菌發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法，包括步驟：
(1)紅栓菌液體種子液的制備：將活化后的紅栓菌菌種接種于液體種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天-8天，得到紅栓菌液體種子液；
(2)固體發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟(1)中紅栓菌液體種子液按占固體培養(yǎng)基體積8％-20％的用量接入添加有省沽油種子的固體培養(yǎng)基中，在15℃-28℃培養(yǎng)3天-30天后，將培養(yǎng)產(chǎn)物真空冷凍干燥、粉碎后得省沽油種子固體發(fā)酵培養(yǎng)物；
(3)液體發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟(1)中紅栓菌液體種子液按占液體發(fā)酵培養(yǎng)基體積3％-20％的量接種于添加有省沽油種子固體發(fā)酵培養(yǎng)物的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1天-6天后，加入膜聯(lián)蛋白，然后繼續(xù)培養(yǎng)1天-8天，終止發(fā)酵，得到富含山奈酚和芥子酸的紅栓菌液體發(fā)酵產(chǎn)物；
(4)發(fā)酵產(chǎn)物萃取分離：將步驟(3)中紅栓菌液體發(fā)酵產(chǎn)物通過分離處理分別獲得富含山奈酚和芥子酸的紅栓菌發(fā)酵菌絲體和紅栓菌胞外液；
所述紅栓菌胞外液經(jīng)冷凍重結(jié)晶后調(diào)ph值為3-8，進(jìn)行高壓脈沖電場(chǎng)處理，電場(chǎng)強(qiáng)度15kv/cm-70kv/cm，脈沖時(shí)40μs-250μs，脈沖寬度1.0μs-5.0μs，脈沖頻率120hz-500hz，流速0.5ml/s-2.5ml/s；經(jīng)高壓脈沖電場(chǎng)處理后的溶液，再與十六烷基三甲基溴化銨(ctab)-正庚烷-異丙醇反膠束萃取劑混合，攪拌萃取，靜置分層，上層為反膠束層，下層為水相，將反膠束層與kcl水溶液混合，攪拌反萃取，靜置分層，合并下層水相經(jīng)旋蒸，除鹽，過濾，洗滌，取濾液旋干，干燥得富含山奈酚和芥子酸的發(fā)酵分離粗品。
本發(fā)明根據(jù)藥用真菌紅栓菌發(fā)酵產(chǎn)物山奈酚和芥子酸合成代謝途徑的特點(diǎn)，通過在固體發(fā)酵階段添加省沽油種子，并在特定的發(fā)酵階段添加膜聯(lián)蛋白，有效提高了紅栓菌液體發(fā)酵產(chǎn)物中山奈酚和芥子酸的含量。
所述紅栓菌菌種可采用任意一種紅栓菌菌種，可采用市售產(chǎn)品。例如紅栓菌(trametescinnabarina(jacq.)fr.)bio-31308菌種，來源于北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司。
為了達(dá)到更好的發(fā)明效果，進(jìn)行以下優(yōu)選：
步驟(1)中，所述活化后的紅栓菌菌種在液體種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)的溫度為自然環(huán)境溫度，優(yōu)選為20℃-30℃。一般1l液體種子培養(yǎng)基中接入1cm2-4cm2大小活化后的紅栓菌菌種菌塊。
紅栓菌菌種的活化方法為本領(lǐng)域常規(guī)的菌種活化方法，一般包括：將斜面保藏的紅栓菌菌種接種到pda平板培養(yǎng)基上，在22℃-30℃活化培養(yǎng)3天-10天，得到活化后的紅栓菌菌種。
所述pda平板培養(yǎng)基和液體種子培養(yǎng)基均采用本領(lǐng)域種子培養(yǎng)常用的培養(yǎng)基，可采用市售產(chǎn)品。進(jìn)一步優(yōu)選，所述的pda平板培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g和瓊脂15g-20g，用水定容至1000ml。進(jìn)一步優(yōu)選，所述的液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖5g-20g、酵母粉4g、蛋白胨3g、kh2po41g和mgso40.5g，用水定容至1000ml。
步驟(2)中，每升固體培養(yǎng)基中省沽油種子的添加量為0.5g-8g。
所述固體培養(yǎng)基可采用本領(lǐng)域固體發(fā)酵培養(yǎng)常用的培養(yǎng)基，優(yōu)選由以下質(zhì)量百分比的組分組成：k2hpo40.1％-0.2％、mgso40.05％-0.1％和余量的水。
步驟(3)中，每升液體發(fā)酵培養(yǎng)基中省沽油種子固體發(fā)酵培養(yǎng)物的添加量為0.2g-5g。
優(yōu)選，每毫升液體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加膜聯(lián)蛋白0.1mg-2.0mg；進(jìn)一步優(yōu)選每毫升液體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加膜聯(lián)蛋白0.3mg-1.6mg；最優(yōu)選的，每毫升液體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加膜聯(lián)蛋白1.2mg。
所述的膜聯(lián)蛋白采用從大多數(shù)動(dòng)物或植物等原料中提取的膜聯(lián)蛋白，可以選用市售產(chǎn)品，也可以采用現(xiàn)有方法制備，如從瘤背石磺提取的膜聯(lián)蛋白，可采用以下制備方法制備，包括：將瘤背石磺在液氮中冷凍后取出破碎，將破碎后的組織置于含乙二胺四乙酸(edta)的三羥甲基氨基甲烷(tris)-hcl緩沖液中勻漿，含edta的tris-hcl緩沖液中edta的濃度為5mmol/l，tris-hcl緩沖液的濃度為10mmol/l，ph為7.4，再將勻漿物在3℃-5℃(優(yōu)選4℃)離心，棄沉淀，上清液經(jīng)真空冷凍干燥成凍干粉；將凍干粉溶解于0.05mol/ltris-hcl緩沖液中，置于分子量排阻值為6kda的透析袋內(nèi)，對(duì)0.05mol/ltris-hcl緩沖液3℃-5℃(優(yōu)選4℃)透析過夜；將透析好的樣品經(jīng)離心去沉淀后，上平衡好的二乙氨乙基纖維素(例如deaecellulosede-52)陰離子交換柱，用0.05mol/ltris-hcl緩沖液過柱，流速0.4ml/min，每管6ml自動(dòng)收集，并于紫外280nm檢測(cè)并收集相應(yīng)樣品組分(收集280nm有吸收的樣品組分)，洗脫完全后，將收集的樣品組分真空凍干后溶解于3ml0.01mol/lna2hpo4-nah2po4的緩沖液中，上樣于葡聚糖凝膠過濾柱(例如sephadexg-150凝膠過濾柱)，用0.01mol/lna2hpo4-nah2po4的緩沖液洗脫，流速0.3ml/min，每管2ml自動(dòng)收集，280nm檢測(cè)并收集相應(yīng)的組分(收集280nm有吸收的組分)，得到膜聯(lián)蛋白。
所述液體發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為自然環(huán)境溫度，一般為20℃-30℃，優(yōu)選為25℃-30℃。
所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基可采用本領(lǐng)域液體發(fā)酵培養(yǎng)常用的培養(yǎng)基，優(yōu)選液體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：以1l液體發(fā)酵培養(yǎng)基計(jì)，葡萄糖25g、蛋白胨6g、酵母粉5g、kh2po41.0g、mgso40.5g和余量的水。
步驟(4)中，所述分離處理可采用本領(lǐng)域現(xiàn)有的分離技術(shù)，例如離心分離、過濾分離等技術(shù)均可將紅栓菌發(fā)酵菌絲體和紅栓菌胞外液分離。
所述反膠束萃取劑中ctab的濃度為50mmol/l，正庚烷的體積百分濃度為40％，異丙醇的體積百分濃度為20％。
所述kcl水溶液的濃度為0.4mol/l。
本發(fā)明所用的培養(yǎng)基均需滅菌、冷卻后使用，滅菌的條件采用本領(lǐng)域的常規(guī)條件，例如可在120℃-125℃下滅菌20min-30min。
所述紅栓菌發(fā)酵產(chǎn)物，由紅栓菌發(fā)酵菌絲體和發(fā)酵分離粗品組成。該紅栓菌發(fā)酵產(chǎn)物中富含山奈酚和芥子酸，山奈酚和芥子酸均具有良好的抗氧化性，主要可應(yīng)用于保健食品或動(dòng)物飼料等中，其可以直接作為保健食品或動(dòng)物飼料等，也可作為主要營(yíng)養(yǎng)成分用于制備保健食品或制備動(dòng)物飼料等。
所述紅栓菌發(fā)酵產(chǎn)物具有抗氧化、增強(qiáng)免疫力等功效，可用于制備具有抗氧化和/或增強(qiáng)免疫力功效的保健食品，可將紅栓菌發(fā)酵菌絲體和發(fā)酵分離粗品與保健食品領(lǐng)域常用的營(yíng)養(yǎng)組分混合制備得到具有抗氧化和/或增強(qiáng)免疫力功效的保健食品，如所述的保健食品由以下重量份的原料組成：
紅栓菌發(fā)酵菌絲體粉30重量份-40重量份、發(fā)酵分離粗品20重量份-40重量份和多花黃精10重量份-20重量份。
所述紅栓菌發(fā)酵產(chǎn)物可有效提高斷奶仔豬的成活率，可用于制備提高斷奶仔豬成活率的動(dòng)物飼料，可將紅栓菌發(fā)酵菌絲體和發(fā)酵分離粗品與飼料領(lǐng)域常用的基礎(chǔ)飼料混合制備得到提高斷奶仔豬成活率的動(dòng)物飼料，如所述的動(dòng)物飼料由以下重量份的原料組成：紅栓菌發(fā)酵菌絲體粉20重量份-30重量份、發(fā)酵分離粗品15重量份-25重量份和構(gòu)樹葉30重量份-40重量份。
所述紅栓菌發(fā)酵菌絲體粉是由紅栓菌發(fā)酵菌絲體經(jīng)干燥粉碎而成的粉末。
省沽油(staphyleabumalda)屬于省沽油科省沽油屬,多年生落葉灌木或小喬木，別名水條，是我國(guó)稀有的木本油料、可食用灌木和優(yōu)良的園林綠化樹種。省沽油多分布于北半球溫帶、亞熱帶和熱帶地區(qū)，我國(guó)主要分布于東北、黃河流域和長(zhǎng)江流域的黑龍江、河南、山西、陜西、湖北、安徽等地，生于路旁、山地或叢林中。省沽油可清熱解毒、消腫、散結(jié)，長(zhǎng)期食用對(duì)無名腫毒、痔瘡、皮炎、跌打骨損、動(dòng)脈硬化、腸炎等病癥具有一定的療效。省沽油果為膨大膜質(zhì)蒴果，膀胱狀，2裂，種子黃色，光亮，有臘質(zhì)層，果微黃時(shí)采摘，摘后置于陰涼處晾干，待果莢80％左右開裂時(shí)揉搓，風(fēng)選出種子。本發(fā)明選用省沽油種子。
多花黃精(polygonatumcyrtonemahua)是百合科黃精屬的多年生草本植物，根狀莖肥厚，少有近圓柱形，莖高可達(dá)100厘米，葉互生，橢圓形、卵狀披針形至矩圓狀披針形，傘形花序，花被黃綠色，漿果黑色，5-6月開花，8-10月結(jié)果。分布于中國(guó)四川、貴州、湖南、湖北、河南、江西、安徽、江蘇、浙江、福建、廣東、廣西。生林下、灌叢或山坡陰處。中國(guó)南方用該種做藥用植物黃精使用。黃精醫(yī)藥部位根狀莖，味甘，平，補(bǔ)氣養(yǎng)陰，健脾，潤(rùn)肺，益腎，用于脾虛胃弱，體倦乏力，口干食少，肺虛燥咳，精血不足，內(nèi)熱消渴。本發(fā)明選用多花黃精的根狀莖。
構(gòu)樹(broussonetiapapyrifera)別名褚桃等，為落葉喬木，高10-20m；樹皮暗灰色；小枝密生柔毛。樹冠張開，卵形至廣卵形；樹皮平滑，淺灰色或灰褐色，不易裂，全株含乳汁。為強(qiáng)陽(yáng)性樹種，適應(yīng)性特強(qiáng)，抗逆性強(qiáng)，其葉是很好的豬飼料，其韌皮纖維是造紙的高級(jí)原料，材質(zhì)潔白，其根和種子均可入藥，樹液可治皮膚病，經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高。本發(fā)明選用構(gòu)樹葉。
本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比有如下優(yōu)點(diǎn)：
1、本發(fā)明將膜聯(lián)蛋白用于紅栓菌中山奈酚和芥子酸類成分的發(fā)酵生產(chǎn)，且優(yōu)化了發(fā)酵方法，大幅度提高了紅栓菌發(fā)酵產(chǎn)物中山奈酚和芥子酸含量，山奈酚可達(dá)到20.42μg/g-25.53μg/g，芥子酸可達(dá)到11.53μg/g-14.82μg/g，富含的山奈酚和芥子酸可用于食品、醫(yī)藥和飼料工業(yè)中。
2、針對(duì)傳統(tǒng)的紅栓菌等食藥用菌液體發(fā)酵產(chǎn)物發(fā)酵液由于粘度大、成分復(fù)雜、難以利用、造成資源的浪費(fèi)的情況。利用高壓脈沖電場(chǎng)技術(shù)，通過對(duì)兩電極間的流態(tài)食品反復(fù)施加高電壓的短脈沖作用，可以改變脂肪氧化酶的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，從而鈍化脂肪氧化酶的酶活。通過高壓脈沖電場(chǎng)-反膠束聯(lián)用萃取，可以高效萃取分離出紅栓菌液體發(fā)酵產(chǎn)物中的山奈酚和芥子酸等有效成分。
3、本發(fā)明采用的膜聯(lián)蛋白可從大多數(shù)動(dòng)物及植物等原料中提取，來源廣泛，成本較低，制備方法也相對(duì)簡(jiǎn)單，可規(guī)模提取生產(chǎn)，對(duì)紅栓菌山奈酚和芥子酸活性物質(zhì)的發(fā)酵生產(chǎn)具有很好的促進(jìn)效果。
4、本發(fā)明所采用的紅栓菌菌絲體發(fā)酵方法簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，發(fā)酵周期短，效率高，同時(shí)利用天然產(chǎn)物作為生產(chǎn)原料且需求量較小，環(huán)保無毒，成本低。整個(gè)發(fā)酵過程可控，不受外部環(huán)境條件限制，非常適合工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用推廣。本發(fā)明方法同樣適用于發(fā)酵罐規(guī)?；a(chǎn)，具有很好的工業(yè)化應(yīng)用前景。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合部分具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明內(nèi)容進(jìn)行進(jìn)一步闡明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不僅限于下面的實(shí)施例。
紅栓菌(trametescinnabarina(jacq.)fr.)bio-31308菌種，來源于北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司。
膜聯(lián)蛋白的制備：
將瘤背石磺投入液氮中，10min-15min后取出進(jìn)行破碎，將破碎后的組織置于含5mmol/ledta的tris-hcl緩沖液(tris-hcl緩沖液ph7.4，濃度10mmol/l)中，勻漿3min，再將勻漿物在4℃、8000rmp離心20min，棄沉淀，上清液經(jīng)真空冷凍干燥成凍干粉；將凍干粉溶解于0.05mol/ltris-hcl緩沖液中，置于分子量排阻值為6kda的透析袋內(nèi)，對(duì)0.05mol/ltris-hcl緩沖液4℃透析過夜；將透析好的樣品經(jīng)離心去沉淀后，上平衡好的deaecellulosede-52陰離子交換柱，用0.05mol/ltris-hcl緩沖液過柱，流速0.4ml/min，每管6ml自動(dòng)收集，并于紫外280nm檢測(cè)并收集相應(yīng)樣品組分，洗脫完全后，將收集的樣品組分真空凍干后溶解于3ml0.01mol/lna2hpo4-nah2po4的緩沖液中，上樣于sephadexg-150凝膠過濾柱，用0.01mol/lna2hpo4-nah2po4的緩沖液洗脫，流速0.3ml/min，每管2ml自動(dòng)收集，280nm檢測(cè)并收集相應(yīng)的組分，得到膜聯(lián)蛋白。
實(shí)施例1
一、材料準(zhǔn)備
pda平板培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g和瓊脂15g，用水定容至1000ml，自然ph，在121℃下滅菌20min。
將斜面保藏的紅栓菌菌種接種到pda平板培養(yǎng)基上在22℃活化培養(yǎng)10天，得到活化后的紅栓菌菌種。
液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖12g、酵母粉4g、蛋白胨3g、kh2po41g和mgso40.5g，用水定容至1000ml，ph自然，在121℃下滅菌20min。
固體培養(yǎng)基由以下質(zhì)量百分比的組分組成：k2hpo40.1％、mgso40.1％和余量的水，ph自然，在121℃下滅菌20min。
液體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：以1l液體發(fā)酵培養(yǎng)基計(jì)，葡萄糖25g、蛋白胨6g、酵母粉5g、kh2po41.0g、mgso40.5g和余量的水，ph自然，在121℃下滅菌20min。
二、藥用菌發(fā)酵產(chǎn)物的制備：
(1)紅栓菌液體種子液的制備：將2cm2大小活化后的紅栓菌菌種菌塊接種于1l液體種子培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)5天，得到紅栓菌液體種子液；
(2)固體發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟(1)中紅栓菌液體種子液按占固體培養(yǎng)基體積10％的用量接入添加有省沽油種子的固體培養(yǎng)基中，在20℃培養(yǎng)15天后，將培養(yǎng)產(chǎn)物真空冷凍干燥、粉碎后得省沽油種子固體發(fā)酵培養(yǎng)物；
其中，每升固體培養(yǎng)基中省沽油種子的添加量為5g；
(3)液體發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟(1)中紅栓菌液體種子液按占液體發(fā)酵培養(yǎng)基體積10％的量接種于添加有省沽油種子固體發(fā)酵培養(yǎng)物的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在25℃培養(yǎng)3天后，加入膜聯(lián)蛋白，然后繼續(xù)在25℃培養(yǎng)4天，終止發(fā)酵后，得到富含山奈酚和芥子酸的紅栓菌液體發(fā)酵產(chǎn)物；
其中，每升液體發(fā)酵培養(yǎng)基中省沽油種子固體發(fā)酵培養(yǎng)物的添加量為2g；每毫升液體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加膜聯(lián)蛋白0.3mg；
(4)發(fā)酵產(chǎn)物萃取分離：將步驟(3)中紅栓菌液體發(fā)酵產(chǎn)物通過離心分離分別獲得富含山奈酚和芥子酸的紅栓菌發(fā)酵菌絲體和紅栓菌胞外液；
紅栓菌胞外液經(jīng)冷凍重結(jié)晶后調(diào)ph值為5，進(jìn)行高壓脈沖電場(chǎng)處理，電場(chǎng)強(qiáng)度45kv/cm，脈沖時(shí)150μs，脈沖寬度3.0μs，脈沖頻率300hz，流速1.5ml/s；經(jīng)高壓脈沖電場(chǎng)處理后的溶液，再與ctab-正庚烷-異丙醇反膠束萃取劑混合(其中，反膠束萃取劑中ctab的濃度為50mmol/l，正庚烷的體積百分濃度為40％，異丙醇的體積百分濃度為20％)，攪拌萃取，靜置分層，上層為反膠束層，下層為水相，將反膠束層與0.4mol/lkcl水溶液混合，攪拌反萃取，靜置分層，合并下層水相經(jīng)旋蒸，除鹽，過濾，洗滌，取濾液旋干，干燥得富含山奈酚和芥子酸的發(fā)酵分離粗品。
三、測(cè)定
紅栓菌發(fā)酵菌絲體冷凍干燥后，測(cè)定其中的芥子酸和山奈酚含量。
發(fā)酵分離粗品，測(cè)定其中的芥子酸和山奈酚含量。
山奈酚含量的測(cè)定：
(a)精密稱取過60目篩干燥的樣品1g于50ml量瓶中，加甲醇-鹽酸(甲醇與鹽酸的體積比為4:l，鹽酸為質(zhì)量百分濃度25％的鹽酸水溶液)混合液45ml，搖勻，放置一夜，于60℃時(shí)超聲30min，5000rpm離心分離5min，上清液轉(zhuǎn)入另一50ml量瓶中，用質(zhì)量百分濃度10％的氫氧化鈉水溶液調(diào)ph2-3，用甲醇稀釋至刻線，搖勻，過0.45μm濾膜，即得供試品溶液。
(b)色譜柱shim-ods(150mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相為甲醇-磷酸水溶液(甲醇與磷酸水溶液的體積比為70:30，磷酸水溶液的質(zhì)量百分濃度為0.4％)；流速為1ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為368nm。
芥子酸含量的測(cè)定：
稱取20ml2mol/lnaoh水溶液于100ml三角瓶中，稱取1g樣品于naoh水溶液中，使其均勻分布，于氮?dú)鈼l件下震蕩水解2h(280r/min，25℃)，水解后用低溫保存的6mol/l稀鹽酸調(diào)節(jié)ph至1.5-2.0，再用35ml乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，35℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，加入2ml質(zhì)量百分濃度50％甲醇水溶液，溶解蒸干后的物質(zhì)保存于-40℃冰箱待分析，測(cè)定樣品前經(jīng)0.22μm有機(jī)相濾膜過濾。
色譜柱：agilentzorbaxeclipseplusc18rapidresolutionhd(2.1mm×50mm，1.8μm-micron)；流動(dòng)相a：超純水(含0.1％乙酸，質(zhì)量百分濃度)；流動(dòng)相b：乙腈；進(jìn)樣體積：1.5μl；流速：0.5ml·min-1；柱溫：30℃；dad掃描波長(zhǎng)范圍：100-360nm；檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm和325nm。
梯度洗脫程序?yàn)椋?-1min，8％-10％b；1-2.5min，10％-13％b；2.5-5.5min，13％b；5.5-6min，13％-21％b；6-6.5min，21％-27％b；6.5-7.5min，27％-50％b；7.5-9min，50％-100％b；9-12min，100％b；12-12.5min，100％-8％b；后運(yùn)行2.5min，體積百分比。
質(zhì)譜條件：離子源：esi電離源(negativemode)；掃描范圍：100-2000da；毛細(xì)管電壓：2800v；錐孔電壓35v；碰撞電壓：5v；源溫度110℃；脫溶劑溫度：250℃；脫溶劑氣流500l·h-1；錐孔氣流：50l·h-1。
檢測(cè)結(jié)果見表1。
實(shí)施例2
一、材料準(zhǔn)備
pda平板培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g和瓊脂20g，用水定容至1000ml，自然ph，在121℃下滅菌20min。
將斜面保藏的紅栓菌菌種接種到pda平板培養(yǎng)基上在30℃活化培養(yǎng)3天，得到活化后的紅栓菌菌種。
液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖5g、酵母粉4g、蛋白胨3g、kh2po41g和mgso40.5g，用水定容至1000ml，ph自然，在121℃下滅菌20min。
固體培養(yǎng)基由以下質(zhì)量百分比的組分組成：k2hpo40.2％、mgso40.05％和余量的水，ph自然，在121℃下滅菌20min。
液體發(fā)酵培養(yǎng)基同實(shí)施例1。
二、藥用菌發(fā)酵產(chǎn)物的制備：
(1)紅栓菌液體種子液的制備：將1cm2大小活化后的紅栓菌菌種菌塊接種于1l液體種子培養(yǎng)基中，20℃培養(yǎng)8天，得到紅栓菌液體種子液；
(2)固體發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟(1)中紅栓菌液體種子液按占固體培養(yǎng)基體積20％的用量接入添加有省沽油種子的固體培養(yǎng)基中，在28℃培養(yǎng)3天后，將培養(yǎng)產(chǎn)物真空冷凍干燥、粉碎后得省沽油種子固體發(fā)酵培養(yǎng)物；
其中，每升固體培養(yǎng)基中省沽油種子的添加量為8g；
(3)液體發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟(1)中紅栓菌液體種子液按占液體發(fā)酵培養(yǎng)基體積20％的量接種于添加有省沽油種子固體發(fā)酵培養(yǎng)物的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30℃培養(yǎng)6天后，加入膜聯(lián)蛋白，然后繼續(xù)在30℃培養(yǎng)1天，終止發(fā)酵后，得到富含山奈酚和芥子酸的紅栓菌液體發(fā)酵產(chǎn)物；
其中，每升液體發(fā)酵培養(yǎng)基中省沽油種子固體發(fā)酵培養(yǎng)物的添加量為5g；每毫升液體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加膜聯(lián)蛋白0.1mg；
(4)發(fā)酵產(chǎn)物萃取分離：將步驟(3)中紅栓菌液體發(fā)酵產(chǎn)物通過離心分離分別獲得富含山奈酚和芥子酸的紅栓菌發(fā)酵菌絲體和紅栓菌胞外液；
紅栓菌胞外液經(jīng)冷凍重結(jié)晶后調(diào)ph值為8，進(jìn)行高壓脈沖電場(chǎng)處理，電場(chǎng)強(qiáng)度70kv/cm，脈沖時(shí)250μs，脈沖寬度5.0μs，脈沖頻率500hz，流速2.5ml/s；經(jīng)高壓脈沖電場(chǎng)處理后的溶液，再與ctab-正庚烷-異丙醇反膠束萃取劑混合(其中，反膠束萃取劑中ctab的濃度為50mmol/l，正庚烷的體積百分濃度為40％，異丙醇的體積百分濃度為20％)，攪拌萃取，靜置分層，上層為反膠束層，下層為水相，將反膠束層與0.4mol/lkcl水溶液混合，攪拌反萃取，靜置分層，合并下層水相經(jīng)旋蒸，除鹽，過濾，洗滌，取濾液旋干，干燥得富含山奈酚和芥子酸的發(fā)酵分離粗品。
三、測(cè)定
紅栓菌發(fā)酵菌絲體冷凍干燥后，測(cè)定其中的芥子酸和山奈酚含量。
發(fā)酵分離粗品，測(cè)定其中的芥子酸和山奈酚含量。
芥子酸和山奈酚含量測(cè)定同實(shí)施例1。
檢測(cè)結(jié)果見表1。
實(shí)施例3
一、材料準(zhǔn)備
pda平板培養(yǎng)基同實(shí)施例1。
將斜面保藏的紅栓菌菌種接種到pda平板培養(yǎng)基上在26℃活化培養(yǎng)6天，得到活化后的紅栓菌菌種。
液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖20g、酵母粉4g、蛋白胨3g、kh2po41g和mgso40.5g，用水定容至1000ml，ph自然，在121℃下滅菌20min。
固體培養(yǎng)基由以下質(zhì)量百分比的組分組成：k2hpo40.15％、mgso40.05％和余量的水，ph自然，在121℃下滅菌20min。
液體發(fā)酵培養(yǎng)基同實(shí)施例1。
二、藥用菌發(fā)酵產(chǎn)物的制備：
(1)紅栓菌液體種子液的制備：將4cm2大小活化后的紅栓菌菌種菌塊接種于1l液體種子培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)3天，得到紅栓菌液體種子液；
(2)固體發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟(1)中紅栓菌液體種子液按占固體培養(yǎng)基體積8％的用量接入添加有省沽油種子的固體培養(yǎng)基中，在15℃培養(yǎng)30天后，將培養(yǎng)產(chǎn)物真空冷凍干燥、粉碎后得省沽油種子固體發(fā)酵培養(yǎng)物；
其中，每升固體培養(yǎng)基中省沽油種子的添加量為0.5g；
(3)液體發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟(1)中紅栓菌液體種子液按占液體發(fā)酵培養(yǎng)基體積3％的量接種于添加有省沽油種子固體發(fā)酵培養(yǎng)物的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30℃培養(yǎng)1天后，加入膜聯(lián)蛋白，然后繼續(xù)在30℃培養(yǎng)8天，終止發(fā)酵后，得到富含山奈酚和芥子酸的紅栓菌液體發(fā)酵產(chǎn)物；
其中，每升液體發(fā)酵培養(yǎng)基中省沽油種子固體發(fā)酵培養(yǎng)物的添加量為0.2g；每毫升液體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加膜聯(lián)蛋白1.6mg；
(4)發(fā)酵產(chǎn)物萃取分離：將步驟(3)中紅栓菌液體發(fā)酵產(chǎn)物通過離心分離分別獲得富含山奈酚和芥子酸的紅栓菌發(fā)酵菌絲體和紅栓菌胞外液；
紅栓菌胞外液經(jīng)冷凍重結(jié)晶后調(diào)ph值為3，進(jìn)行高壓脈沖電場(chǎng)處理，電場(chǎng)強(qiáng)度15kv/cm，脈沖時(shí)40μs，脈沖寬度1.0μs，脈沖頻率120hz，流速0.5ml/s；經(jīng)高壓脈沖電場(chǎng)處理后的溶液，再與ctab-正庚烷-異丙醇反膠束萃取劑混合(其中，反膠束萃取劑中ctab的濃度為50mmol/l，正庚烷的體積百分濃度為40％，異丙醇的體積百分濃度為20％)，攪拌萃取，靜置分層，上層為反膠束層，下層為水相，將反膠束層與0.4mol/lkcl水溶液混合，攪拌反萃取，靜置分層，合并下層水相經(jīng)旋蒸，除鹽，過濾，洗滌，取濾液旋干，干燥得富含山奈酚和芥子酸的發(fā)酵分離粗品。
三、測(cè)定
紅栓菌發(fā)酵菌絲體冷凍干燥后，測(cè)定其中的芥子酸和山奈酚含量。
發(fā)酵分離粗品，測(cè)定其中的芥子酸和山奈酚含量。
芥子酸和山奈酚含量測(cè)定同實(shí)施例1。
檢測(cè)結(jié)果見表1。
實(shí)施例4
除了“步驟(3)中每毫升液體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加膜聯(lián)蛋白2mg”之外其余操作同實(shí)施例1，得到富含山奈酚和芥子酸的紅栓菌發(fā)酵菌絲體和發(fā)酵分離粗品。
芥子酸和山奈酚含量測(cè)定同實(shí)施例1。檢測(cè)結(jié)果見表1。
實(shí)施例5
除了“步驟(3)中每毫升液體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加膜聯(lián)蛋白1.2mg”之外其余操作同實(shí)施例1，得到富含山奈酚和芥子酸的紅栓菌發(fā)酵菌絲體和發(fā)酵分離粗品。
芥子酸和山奈酚含量測(cè)定同實(shí)施例1。檢測(cè)結(jié)果見表1。
對(duì)比例1
(1)搖瓶種子培養(yǎng)
液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖12g、酵母粉4g、蛋白胨3g、kh2po41g和mgso40.5g，用水定容至1000ml；ph自然，在121℃下滅菌20min。
培養(yǎng)方法：取2cm2大小實(shí)施例1中活化后的紅栓菌菌種菌塊接入滅菌冷卻后1l液體種子培養(yǎng)基中，25℃，120r/min下?lián)u床培養(yǎng)3天，得到培養(yǎng)好的種子液。
(2)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)
液體發(fā)酵培養(yǎng)基同實(shí)施例1。
培養(yǎng)方法：將培養(yǎng)好的種子液按占液體發(fā)酵培養(yǎng)基體積10％的接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在25℃，120r/min搖床中培養(yǎng)12天，得到發(fā)酵產(chǎn)物。每個(gè)試驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行。
檢測(cè)結(jié)果見表1。
對(duì)比例2不添加膜聯(lián)蛋白
除了“(3)液體發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟(1)中紅栓菌液體種子液按占液體發(fā)酵培養(yǎng)基體積10％的量接種于添加有省沽油種子固體發(fā)酵培養(yǎng)物的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在25℃培養(yǎng)6天，終止發(fā)酵，得到紅栓菌液體發(fā)酵產(chǎn)物；其中，每升液體發(fā)酵培養(yǎng)基中省沽油種子固體發(fā)酵培養(yǎng)物的添加量為2g”之外其余操作同實(shí)施例1，得到紅栓菌發(fā)酵菌絲體和發(fā)酵分離粗品。
芥子酸和山奈酚含量測(cè)定同實(shí)施例1。檢測(cè)結(jié)果見表1。
應(yīng)用例1
將實(shí)施例1中的紅栓菌發(fā)酵菌絲體經(jīng)干燥粉碎，得到紅栓菌發(fā)酵菌絲體粉。多花黃精根狀莖干燥后粉碎備用。
將紅栓菌發(fā)酵菌絲體粉30重量份、實(shí)施例1中的發(fā)酵分離粗品20重量份和多花黃精10重量份混合均勻，得到保健食品。
應(yīng)用例2
將實(shí)施例2中的紅栓菌發(fā)酵菌絲體經(jīng)干燥粉碎，得到紅栓菌發(fā)酵菌絲體粉。多花黃精根狀莖干燥后粉碎備用。
將紅栓菌發(fā)酵菌絲體粉40重量份、實(shí)施例2中的發(fā)酵分離粗品40重量份和多花黃精20重量份混合均勻，得到保健食品。
應(yīng)用例3
將實(shí)施例3中的紅栓菌發(fā)酵菌絲體經(jīng)干燥粉碎，得到紅栓菌發(fā)酵菌絲體粉。多花黃精根狀莖干燥后粉碎備用。
將紅栓菌發(fā)酵菌絲體粉35重量份、實(shí)施例3中的發(fā)酵分離粗品30重量份和多花黃精15重量份混合均勻，得到保健食品。
應(yīng)用例4
將實(shí)施例1中的紅栓菌發(fā)酵菌絲體經(jīng)干燥粉碎，得到紅栓菌發(fā)酵菌絲體粉。構(gòu)樹葉粉碎備用。
將紅栓菌發(fā)酵菌絲體粉20重量份、實(shí)施例1中的發(fā)酵分離粗品15重量份和構(gòu)樹葉30重量份混合均勻，得到動(dòng)物飼料。
應(yīng)用例5
將實(shí)施例2中的紅栓菌發(fā)酵菌絲體經(jīng)干燥粉碎，得到紅栓菌發(fā)酵菌絲體粉。構(gòu)樹葉粉碎備用。
將紅栓菌發(fā)酵菌絲體粉30重量份、實(shí)施例2中的發(fā)酵分離粗品25重量份和構(gòu)樹葉40重量份混合均勻，得到動(dòng)物飼料。
應(yīng)用例6
將實(shí)施例3中的紅栓菌發(fā)酵菌絲體經(jīng)干燥粉碎，得到紅栓菌發(fā)酵菌絲體粉。構(gòu)樹葉粉碎備用。
將紅栓菌發(fā)酵菌絲體粉25重量份、實(shí)施例3中的發(fā)酵分離粗品20重量份和構(gòu)樹葉35重量份混合均勻，得到動(dòng)物飼料。
表1紅栓菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物含量檢測(cè)結(jié)果
注：與對(duì)比例1比較，δ：p<0.05；δδ：p<0.01；表明差異具有顯著性；
與對(duì)比例2比較，*：p<0.05；**：p<0.01；表明差異具有顯著性；
表1中山奈酚含量代表紅栓菌發(fā)酵菌絲體和發(fā)酵分離粗品中山奈酚的總含量，芥子酸含量代表紅栓菌發(fā)酵菌絲體和發(fā)酵分離粗品中芥子酸的總含量。
表1數(shù)據(jù)顯示，與對(duì)比例1相比，采用本發(fā)明方法液體發(fā)酵培養(yǎng)的紅栓菌代謝產(chǎn)物菌絲體中山奈酚含量提高了63.0％-103.8％，芥子酸含量提高了71.6％-120.5％。與對(duì)比例2相比，采用本發(fā)明方法液體發(fā)酵培養(yǎng)的紅栓菌代謝產(chǎn)物菌絲體中山奈酚含量提高了30.6％-63.3％，芥子酸含量提高了38.6％-78.1％。表明本發(fā)明結(jié)合紅栓菌發(fā)酵產(chǎn)物山奈酚和芥子酸合成代謝途徑的特點(diǎn)，通過在固體發(fā)酵階段添加省沽油種子，并在特定的發(fā)酵階段添加膜聯(lián)蛋白，顯著提高了紅栓菌液體發(fā)酵產(chǎn)物中山奈酚和芥子酸的含量。
檢測(cè)實(shí)施例1-5中紅栓菌發(fā)酵菌絲體和發(fā)酵分離粗品、對(duì)比例1中發(fā)酵產(chǎn)物、對(duì)比例2中紅栓菌發(fā)酵菌絲體和發(fā)酵分離粗品和vc(維生素c)的抗氧化活性，檢測(cè)結(jié)果見表2：
表2抗氧化檢測(cè)結(jié)果
注：與空白對(duì)照組對(duì)比例1比較，δ：p<0.05；δδ：p<0.01；表明差異具有顯著性；
與對(duì)比例2比較，*：p<0.05；**：p<0.01；表明差異具有顯著性。
表2數(shù)據(jù)顯示，本發(fā)明紅栓菌發(fā)酵菌絲體和發(fā)酵分離粗品具有優(yōu)異的抗氧化性能。
分別用應(yīng)用例4-6中的動(dòng)物飼料飼養(yǎng)20頭剛斷奶的仔豬，用由構(gòu)樹葉30重量份和玉米粉35重量份混合均勻組成的對(duì)照飼料飼養(yǎng)相同環(huán)境下的另20頭剛斷奶的仔豬，斷奶后5-6天內(nèi)需控制采食量，以喂8成飽為宜，實(shí)行少喂多餐(6-8次/天)，逐漸過渡到自由采食，一個(gè)月后用應(yīng)用例4-6中的動(dòng)物飼料飼養(yǎng)的仔豬全部成活，對(duì)照飼料飼養(yǎng)的仔豬成活率在75％。對(duì)比顯示，本發(fā)明動(dòng)物飼料能夠有效提高斷奶仔豬的成活率。
在本發(fā)明制備方法限定的范圍內(nèi)各參數(shù)的變化并不影響紅栓菌液體發(fā)酵代謝產(chǎn)物中山奈酚和芥子酸含量的提高，因此本發(fā)明制備方法中任意參數(shù)的組合均可實(shí)現(xiàn)紅栓菌液體發(fā)酵代謝產(chǎn)物山奈酚和芥子酸含量的提高。在此不再贅述。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)，這些改進(jìn)也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。