本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種檢測雞cds2基因3’-utr變異的方法。

背景技術(shù)：

cdp-甘油三酯合成酶(cdp-diacylglycerolsynthases，cds)是催化磷脂酸形成cdp-甘油三酯(cdp-dag)的關(guān)鍵酶。而磷脂酸和cdp-dag在細胞功能中都起著重要的作用。磷脂酸在一些信號傳導(dǎo)通徑中發(fā)揮作用，而且在結(jié)構(gòu)和生物合成中也發(fā)揮著作用。而cdp-dag是磷脂酰肌醇(pi)，磷脂酰甘油(pg)，和心磷脂(cl)等磷脂物質(zhì)的脂質(zhì)前體。目前兩種cds被鑒定cds1和cds2。cds2廣泛表達，被發(fā)現(xiàn)在幾乎所有組織顯示其對機體具有重要功能。cds2是一個蛋白編碼基因，其通路與代謝和甘油磷脂生物合成有關(guān)，go分析將這個基因與轉(zhuǎn)移酶活力、轉(zhuǎn)移含磷基團和磷酸二胞苷酰基轉(zhuǎn)移酶等功能聯(lián)系起來。顯示該基因在能量代謝等方面的功能。在斑馬魚，干擾了cds2導(dǎo)致減少了血管生長因子(vegfa)信號的水平和血管再生，主要通過降低pip2的再生水平。目前關(guān)于雞cds2的研究尚未見報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明為解決揭示通過雞cds2基因的基因型選擇提高雞的體重的技術(shù)問題，公開了一種檢測雞cds2基因3’-utr變異的方法。

為解決上述技術(shù)問題，采用以下技術(shù)方案：

一種檢測雞cds2基因3’-utr變異的方法，步驟如下：

(1)資源群體樣品的準備；

(2)樣品基因組dna的提??；

(3)dna混合池的構(gòu)建；

(4)引物的設(shè)計；

(5)3’-utr變異的檢測；

(6)統(tǒng)計檢測結(jié)果并進行基因型判型。

所述步驟(1)的操作為，采用正交試驗法，正交系4個、反交系3個，f0代是從蛋肉兼用型固始雞和肉用型安卡紅雞純系中分別選取種雞，f0代固始雞和安卡紅雞是兩種生長速度不同的種雞，按公母雞1∶6比例配組而成；從每個家系f1后代中選留1只公雞，每只公雞分別按公母雞1∶9比例與選留公雞不同的f1代家系的f1代母雞交配，產(chǎn)生f2代，以f2代個體為樣品。

所述步驟(2)的操作為，采用酚氯仿抽提法從f2代個體樣品的血液中提取基因組dna。

所述步驟(3)的操作為，選取100個不同個體的f2代樣品的dna，每個樣品的dna取2μl，充分混勻即可完成dna混合池的制備。

所述步驟(4)中，引物為檢測變異位點的引物對lp5-f和lp5-r，lp5-f序列如seqidno：1所示，lp5-r序列如seqidno：2所示。

所述步驟(5)中，3’-utr變異的檢測包括pcr產(chǎn)物檢測和酶切片段檢測。

所述酶切片段檢測采用的酶切引物對為lp6-f和lp6-r，其中l(wèi)p6-f序列如seqidno：3所示，lp5-r序列如seqidno：4所示。

檢測雞cds2基因3’-utr變異的方法，作為雞的育種中利用基因型進行雞的體重選擇的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明揭示了cds2基因在雞的生長發(fā)育方面存在著重要的效應(yīng)。公開了育種中通過選擇淘汰cds2基因g4971a位點的ag雜合子，有利于提高群體的6周齡體重和腿肌重。

附圖說明

圖1為用lp5引物對擴增產(chǎn)物電泳檢測圖。

圖2為測序檢測到的g4971a變異位點。

圖3為cds2基因hinfi酶切產(chǎn)物電泳圖。

具體實施方式

一種檢測雞cds2基因3’-utr變異的方法，步驟如下：

(1)資源群體樣品的準備；

(2)樣品基因組dna的提??；

(3)dna混合池的構(gòu)建；

(4)引物的設(shè)計；

(5)3’-utr變異的檢測；

(6)統(tǒng)計檢測結(jié)果并進行基因型判型。

所述步驟(1)的操作為，采用正交試驗法，正交系4個、反交系3個，f0代是從蛋肉兼用型固始雞和肉用型安卡紅雞純系中分別選取種雞，f0代固始雞和安卡紅雞是兩種生長速度不同的種雞，按公母雞1∶6比例配組而成；從每個家系f1后代中選留1只公雞，每只公雞分別按公母雞1∶9比例與選留公雞不同的f1代家系的f1代母雞交配，產(chǎn)生f2代，以f2代個體為樣品。

所述步驟(2)的操作為，采用酚氯仿抽提法從f2代個體樣品的血液中提取基因組dna。

所述步驟(3)的操作為，選取100個不同個體的f2代樣品的dna，每個樣品的dna取2μl，充分混勻即可完成dna混合池的制備。

所述步驟(4)中，引物為檢測變異位點的引物對lp5-f和lp5-r，lp5-f序列如seqidno：1所示，lp5-r序列如seqidno：2所示。

所述步驟(5)中，3’-utr變異的檢測包括pcr產(chǎn)物檢測和酶切片段檢測。

所述酶切片段檢測采用的酶切引物對為lp6-f和lp6-r，其中l(wèi)p6-f序列如seqidno：3所示，lp5-r序列如seqidno：4所示。

檢測雞cds2基因3’-utr變異的方法，作為雞的育種中利用基因型進行雞的體重選擇的應(yīng)用。

下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明進行進一步的解釋說明：

1.試驗材料

1.1試驗樣品

以固始雞-安卡雞f2代資源群混合dna為實驗材料篩選位于cds2基因的3’-utr的變異位點，并分別檢測變異位點在群體中的分布并進行關(guān)聯(lián)分析。

河南家禽種質(zhì)資源創(chuàng)新工程中心的固始雞資源群按f2代設(shè)計方案組建，試驗建立了7個家系，共806只雞。其中正交系4個，反交系3個。f0代是從蛋肉兼用型固始雞和肉用型安卡雞純系中分別選取種雞，按公母雞1∶6比例配組而成，要求所選公母雞具有本品種特征，產(chǎn)蛋量高，體重中等，血統(tǒng)純正，以保證f1代個體在各個位點的雜合。從每個家系的f1后代中選留1只公雞，按公母1∶9比例與其他家系母雞交配產(chǎn)生f2代，要求與配公母雞之間沒有親緣關(guān)系，f1代的種用母雞也盡量散布在各個家系中，選種時盡量選擇外貌表現(xiàn)豐富、呈現(xiàn)雜合的個體，保證f2代性狀產(chǎn)生較大分離。測定了f2代個體的生長發(fā)育性狀、屠體性狀、血液生化指標、肌纖維特性和肉質(zhì)指標等。

1.2血樣采集

以資源群體為試驗素材，12周齡時頸靜脈采血，edta抗凝，-20℃保存。

1.3試驗主要試劑

普通試劑：三羥甲基氨基甲烷(tris·cl)，乙二胺四乙酸二鈉(edta)，nacl，naoh，kcl，na2hpo4，氯仿、異戊醇、無水乙酸(分析純，北京化工廠)，醋酸鈉，十二烷硫酸鈉(sds)，溴化乙錠(eb)，硼酸，瓊脂糖。

分子生物學(xué)試劑：taqdna聚合酶；taqmix；蛋白酶k(德國默克公司)；dntps(廣東東盛生物科技有限公司)；限制性內(nèi)切酶(takara公司，mbi公司)；dnamarker1、dl2000(天根生物科技有限公司)；瓊脂糖(寶生物工程(大連)有限公司)；tris平衡酚(鄭州寶賽生物技術(shù)公司)。

1.4主要溶液配制和儀器

主要配制溶液：te緩沖液、10×tbe、1mtis·cl、0.5medta、10％sds。所有溶液和緩沖液均采用去離子高壓滅菌超純水配制。

試驗所用儀器如下所示：

表1試驗所用儀器

2.試驗方法

2.1基因組dna的提取

dna提取采用酚氯仿抽提法從血液樣本中提取基因組dna，溶于te中，4℃保存。

2.2瓊脂糖凝膠電泳檢測dna

(1)將制膠器清洗干凈，用膠帶紙將兩端封住，插上梳子。

(2)稱取0.4g瓊脂糖，轉(zhuǎn)入錐形瓶中，加入1×tbe緩沖液50ml使其懸浮，微波爐中火加熱，使瓊脂糖溶液中無氣泡。

(3)迅速向錐形瓶中加入eb溶液至終濃度為0.5μg/ml，輕微搖動混勻，防止出現(xiàn)氣泡。

(4)混勻后(約60℃)，倒入制膠器槽內(nèi)。如出現(xiàn)氣泡，立即用移液器移出。

(5)待冷卻凝固后，拔掉梳子，去掉兩端的膠帶紙，將凝膠移入電泳槽中。

(6)向電泳槽加入1×tbe緩沖液，使液面高出膠面2～5mm。

(7)取dna樣品2～4μl，加入2μl上樣緩沖液后混勻，統(tǒng)一上樣。

(8)120v電壓電泳30min。

(9)如果有rna則需要純化，如果有明顯的降解需重新提取相應(yīng)樣本的dna。

(10)引物稀釋將引物管瞬時離心，加入滅菌雙蒸水，充分混勻，4℃過夜，保存。

2.3dna混池的構(gòu)建

dna池(dnapool)是由多個不同個體的dna樣品混合得到的混合dna。具體制作如下：從本申請資源群f2代中取100個不同個體的dna樣品中各取2μl，充分混勻而成。

2.4引物的設(shè)計和合成

本發(fā)明使用的引物參照cds2的基因序列。利用oligo6.0軟件自行設(shè)計，設(shè)計的酶切引物。引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物信息見表

表2本發(fā)明所用引物

參考序列為xm_417669.5，為創(chuàng)造酶切位點hinfi，lp6下游引物中將3’端“gg”改為“ag”。

2.5引物稀釋

將引物管瞬時離心，加入滅菌雙蒸水，充分混勻，4℃過夜，保存。

滅菌雙蒸水的加入量：

v＝(od×33)/(m×mw)

其中v:加入雙蒸水的體積；m:引物的濃度；mw:引物的分子量。

2.6pcr擴增

(1)pcr擴增體系：

25.0μl的pcr體系：12.5μl2×pcrmix，0.5μl(10pmol/μl)上、下游引物，dna模板1.0μl，10.5μl滅菌超純水。

(2)擴增程序：

擴增程序如表3所示。

2.7pcr產(chǎn)物的檢測

將pcr產(chǎn)物3μl加入2μl1×loadingbuffer共5μl點入含eb的1.2％的瓊脂糖凝膠的點樣孔中，120v電壓，電泳35min，凝膠成像儀紫外條件拍照。

2.8酶切反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

酶切混合液的配制：內(nèi)切酶0.3μl，buffer2μl，雙蒸水7.7μl，總體積為10μl。將lp6擴增產(chǎn)物與酶切混合液1：5比例混合后，混勻后37℃過夜酶切12～16h。

表3pcr擴增程序

2.9酶切片段的檢測

用7μl酶切產(chǎn)物經(jīng)3％瓊脂糖電泳檢測。120v電壓，電泳30min，凝膠成像儀紫外條件拍照。

2.10測序驗證

將不同酶切帶型的樣品的pcr產(chǎn)物送至上海生工測序。以驗證酶切基因型與測序基因型的吻合度。

2.11統(tǒng)計分析

統(tǒng)計各個樣本的酶切結(jié)果并進行基因型判型，采用sas6.0軟進行基因型與固始雞資源群的表觀性狀的關(guān)聯(lián)分析。

二、發(fā)明內(nèi)容

1、變異位點的檢測

根據(jù)雞cds2序列xm_417669.5，以固始雞f2資源群的混合dna為模板，設(shè)計引物lp5檢測cds2基因3‘-utr序列的變異位點，引物擴增長度為368bp。pcr擴增結(jié)果檢測結(jié)果如圖1所示，目的條帶清晰，可用于直接的pcr測序。測序結(jié)果顯示lp5引物檢測到g4971a(如圖2所示)、g5149a、g5168a變異位點。

2.酶切基因型的檢測和基因分型

采用創(chuàng)造性酶切位點技術(shù)設(shè)計引物lp6檢測g4971a變異，lp6擴增產(chǎn)物中含有一個hinfi酶切位點(g/antc)，4971g可以被酶切，而4971a不能被酶切，從而進行g(shù)4971a變異檢測測結(jié)果如圖3所示，各帶型條帶清晰，容易分型。其中僅有一條大小為189bp的為純合野生型gg個體(另一條25bp片段太小，不能檢測到)，僅有一條條帶大小為214bp的為純合突變型aa個體，,有兩條帶為雜合型ag型個體，條帶大小自上而下為214bp和189bp，測序結(jié)果也驗證了酶切基因型的準確性(圖3)。

3.cds2基因型與資源群經(jīng)部分濟性狀關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

對f2代的所有個體的血液dna樣本分別采用lp6引物和hinfi檢測cds2基因的g4971a變異，并通過對cds2基因g4971a位點變異的不同基因型與資源群屠體性狀、生長發(fā)育性狀、肌纖維特性、部分肉質(zhì)性狀和血液生化指標進行分析后發(fā)現(xiàn)：該位點與4周體重、6周體重、腿肌重性狀相關(guān)(表4)。其中與6周體重達到極顯著相關(guān)(p<0.01)。4周基因型aa>gg>ag,6周體重基因型gg>aa>ag，并且gg型4周體重和6周體重顯著大于ag型，兩者與aa型差異不顯著。腿肌重基因型呈現(xiàn)aa>gg>ag，并且基因型aa顯著大于ag型，兩者與gg型差異不顯著。

表4雞cds2基因g4971a位點不同基因型與f2代資源群家系性狀的關(guān)聯(lián)分析

4.討論與結(jié)論

本申請在固始雞-安卡雞f2代資源群檢測到g4971a變異位點。所以針對g4971a變異位點，在家系里進行了性狀的關(guān)聯(lián)分析。通過對cds2基因位點單核苷酸多態(tài)性與資源群屠體性狀、生長發(fā)育性狀、肌纖維特性、部分肉質(zhì)性狀和血液生化指標進行分析后發(fā)現(xiàn)：該位點與4周體重、6周體重、腿肌重性狀相關(guān)。其中與6周體重達到極顯著相關(guān)(p<0.01)。4周基因型aa>gg>ag，6周體重基因型gg>aa>ag，并且gg型4周體重和6周體重顯著大于ag型，兩者與aa型差異不顯著。

g4971a變異位點與6周體重達到了極顯著的水平，揭示了cds2基因在雞的生長發(fā)育方面存在著重要的效應(yīng)，在育種中通過淘汰g4971位點的ag雜合子，有望提高肉雞群體的6周齡體重和腿肌重。但關(guān)于cds2基因的生物學(xué)功能則需要后續(xù)實驗進行進一步的研究。

<110>河南農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>一種檢測雞cds2基因3’-utr變異的方法

<160>5

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

gcattgatgggctgtgtgg19

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

aggaaggaggagggatgg18

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

tgggcagcaaagcagcaagtgt22

<210>4

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

taggtgtcaatatttcactgcgag24

<210>5

<212>dna

<213>原雞屬(gallusdomestiaus)

<220>

<221>mutation

<222>(110、288、307)

<400>5

gcattgatgggctgtgtggttgagcactgggtgagttcgggtgggaatttgcttctctga60

gcctggctgtaggctgaatgagtttgcagcttggctgcattctcagtgtaacccgcagtg120

aaatattgacacctagttgtggtgtgaggtgttatatcctgtacccacctctgtgtgcta180

tttaggtcttagaggtgatgggctcaggggcttgctgacgctgacctggaggggtcttta240

tgtggctcacaaagctgcaaatcccacagcatcagccagcacttggtaccaggttgggga300

ctgcccatgtcagagatgtccaggtgctttctgatggcgatgcatgtcccccatccctcc360

tccttcctcct371