本發(fā)明屬于生物材料領(lǐng)域，具體涉及絲素納米銀/pva抗菌薄膜的制備方法，還涉及由該方法制得的產(chǎn)品及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

抗菌包裝的主要目標(biāo)是保護(hù)被包裝物質(zhì)免受細(xì)菌的侵染，提供安全環(huán)境。目前，抗菌包裝系統(tǒng)的應(yīng)用由于缺乏合適可用的抗菌物質(zhì)以及制備方式，易導(dǎo)致環(huán)境污染等原因受到局限。由于消費(fèi)者對(duì)產(chǎn)品微加工以及不含防腐劑的要求越來(lái)越高，抗菌包裝系統(tǒng)的發(fā)展有助于食品工業(yè)和包裝材料行業(yè)的發(fā)展。近來(lái)，人們對(duì)開(kāi)發(fā)具有成膜能力和抗菌特性材料的興趣與日俱增。

納米包裝是采用納米抗菌材料與包裝材料通過(guò)共混、表面涂抹等方式制備的抗菌薄膜，對(duì)產(chǎn)品起到防止細(xì)菌滋生的功效。通過(guò)對(duì)包裝材料進(jìn)行納米合成、添加、改性使其具備抗菌性是研究較多的領(lǐng)域。納米材料因其表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)在光學(xué)、電子學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。納米銀作為一種廣為人知的納米材料，對(duì)革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌、真菌和病毒均具有良好的抑制活性，在生物醫(yī)學(xué)如創(chuàng)傷修復(fù)等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。在抗菌包裝材料領(lǐng)域也有較多的報(bào)道。

納米銀抗菌包裝薄膜制備可分為兩大類(lèi)：一類(lèi)是通過(guò)在包裝膜表面涂膜或者吸附納米銀。這種方法一般步驟繁瑣，條件苛刻，且易引入有毒有害試劑。納米銀在空氣中也易于氧化和聚集，從而降低抗菌活性。這些缺點(diǎn)使得納米銀材料在實(shí)際運(yùn)用中受到一定的限制。利用有機(jī)或者無(wú)機(jī)材料制備納米銀復(fù)合材料，雖然可以增加納米銀的穩(wěn)定性，然而通常方法復(fù)雜，成本較高。另一類(lèi)為在成膜過(guò)程中，抑菌物質(zhì)直接合成在包裝材料中，而生物合成的方式是最積極環(huán)保的一種方法。通過(guò)綠色合成制備納米銀復(fù)合材料，以便用于抗菌包裝材料領(lǐng)域，越來(lái)越受到人們的關(guān)注。

絲素蛋白由蠶的前部絲腺細(xì)胞分泌，是組成繭絲的主要蛋白，約占繭絲的百分之七十左右。在紡織服裝產(chǎn)業(yè)中，由于需求美觀舒適的等原因，下等繭絲往往難以發(fā)揮其經(jīng)濟(jì)價(jià)值。絲素蛋白含有18種天然氨基酸，其中8種是人體必須的氨基酸，還有高含量的甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸以及酪氨酸。由于絲素蛋白良好的力學(xué)性能和生物相容性以及其具有獨(dú)特的光、電學(xué)的性能使之在生物醫(yī)藥、光電器件、納米材料、微流體和精細(xì)化工等領(lǐng)域也有著廣泛的應(yīng)用前景。但是絲素蛋白用于制備抗菌包裝材料未見(jiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供絲素納米銀/pva抗菌薄膜的制備方法；本發(fā)明利用本發(fā)明的目的之二在于提供由該方法制得的產(chǎn)品；本發(fā)明的目的之三在于提供絲素納米銀/pva抗菌薄膜的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

本發(fā)明利用絲素蛋白獨(dú)特結(jié)構(gòu)以及含有大量酪氨酸，具備原位合成納米銀的能力，制備過(guò)程中首先將繭絲脫膠，利用溴化鋰提取絲素蛋白，在光照條件下，室溫反應(yīng)得到絲素-納米銀溶液，將絲素-納米銀與pva溶液按照不同的比例共混得到絲素-納米銀/pva共混液，在反復(fù)凍融的條件下得到其凝膠，然后干燥得到絲素-納米銀/pva薄膜，具體方法如下：

絲素納米銀/pva抗菌薄膜的制備方法，包括如下步驟：將蠶絲脫膠后用溴化鋰溶液溶解，然后透析去除溴化鋰得絲素蛋白，然后向絲素蛋白中加入硝酸銀溶液原位合成納米銀，得到絲素-納米銀，最后將絲素-納米銀與聚乙烯醇混合，反復(fù)凍融，干燥，得絲素納米銀-pva抗菌薄膜。

本發(fā)明中，所述絲素-納米銀的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1～5％，所述聚乙烯醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1～5％。

本發(fā)明中，所述絲素-納米銀與聚乙烯醇的體積比為1:1～4:1。

本發(fā)明中，所述反復(fù)凍融的次數(shù)為3～4次。

本發(fā)明中，所述蠶絲脫膠的方法為將蠶繭剪碎后置于na2co3溶液中，沸水煮浴至繭絲表面絲膠脫落，干燥得脫膠蠶絲。

本發(fā)明中，所述na2co3溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5％。

本發(fā)明中，所述溴化鋰的濃度為9.3mol/l，所述硝酸銀加入量按加入后硝酸銀終濃度為4mg/ml。

本發(fā)明中，所述原位合成納米銀的條件為在光照下反應(yīng)24h。

本發(fā)明中，所述干燥為在37～65℃下干燥12小時(shí)或自然干燥至絲素-納米銀/pva薄膜形成。

2、由所述制備方法制得的絲素納米銀/pva抗菌薄膜。

3、所述絲素納米銀/pva抗菌薄膜在制備抗菌包裝材料中的應(yīng)用。

有益效果在于：本發(fā)明提供了絲素納米銀/pva抗菌薄膜的制備方法，制備方法簡(jiǎn)單，綠色環(huán)保，制得的絲素-納米銀/pva具有較好的力學(xué)性能和疏水性能、良好的抗菌性和穩(wěn)定性，有望用于抗菌包裝材料等相關(guān)抗菌材料領(lǐng)域。

附圖說(shuō)明

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖進(jìn)行說(shuō)明：

圖1檢測(cè)絲素蛋白的提取情況：a為uv-vis檢測(cè)絲素蛋白中肽鍵和芳香族氨基酸的吸收；b為熒光檢測(cè)絲素蛋白中酪氨酸內(nèi)源熒光吸收；

圖2納米穩(wěn)定性檢測(cè)：a為絲素-納米銀的酸堿穩(wěn)定性檢測(cè)；b為絲素-納米銀的高溫穩(wěn)定性檢測(cè)；c為絲素-納米銀的熱穩(wěn)定性檢測(cè)；d為絲素-納米銀的冷凍穩(wěn)定性檢測(cè)；

圖3絲素-納米銀和絲素-納米銀/pva檢測(cè)，a絲素-納米銀uv-vis檢測(cè)、b絲素納米銀/pva的frsem檢測(cè)、c絲素納米銀/pva檢測(cè)，d絲素-納米銀/pva的eds檢測(cè)。

圖4絲素-納米銀/pva薄膜檢測(cè)；a為絲素-納米銀/pva薄膜tga檢測(cè)，b為絲素-納米銀/pva薄膜ft-ir檢測(cè)。

圖5絲素-納米銀/pva薄膜力學(xué)性能檢測(cè)；a為絲素納米銀/pva薄膜的拉伸強(qiáng)度；b為絲素納米銀/pva薄膜的伸長(zhǎng)率；

圖6為絲素納米銀/pva薄膜接觸角檢測(cè)。

圖7絲素納米銀/pva薄膜的抑菌曲線測(cè)試：a為抑制大腸桿菌，b為抑制金黃色葡萄球菌。

圖8絲素納米銀/pva薄膜的抑菌圈測(cè)試：a為抑制大腸桿菌、b為抑制金黃色葡萄球菌。

圖9絲素-納米銀/pva薄膜在不同酸堿環(huán)境下的穩(wěn)定性：a為酸性環(huán)境下的穩(wěn)定性(ph＝4)，b為中性環(huán)境下的穩(wěn)定性(ph＝7.4)，c為堿性環(huán)境下的穩(wěn)定性(ph＝10)。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。

實(shí)施例1

絲素納米銀/pva抗菌薄膜的制備方法，包括如下步驟：

(1)蠶絲脫膠：取10g蠶繭剪成小碎片，按浴比為1:30置于na2co3(0.5％)溶液中，沸水煮浴30min使繭絲表面的絲膠脫落，將脫膠后的繭絲自然干燥得到脫膠蠶絲；

(2)絲素溶液制備：將步驟(1)制得的脫膠蠶絲加入溴化鋰溶液(9.3mol/l)中使絲素完全溶解，然后將溶解的絲素溶液倒入透析袋中，透析48h除去溴化鋰，得到的絲素蛋白；

(3)絲素-納米銀溶液的制備：將步驟(2)制得的絲素蛋白配制成濃度為2％(wt)的溶液，然后加入硝酸銀溶液至硝酸銀濃度為4mg/ml，在光照下反應(yīng)24h，得到絲素-納米銀溶液；

(4)絲膠納米銀/pva薄膜的制備：將制備好的絲素-納米銀溶液(2％)與pva溶液(2％)按體積比為4：1均勻混合得到混合溶液，將混合溶液反復(fù)凍融2次后得到絲素-納米銀/pva凝膠，最后在65℃烘箱中放置12h后得到絲素-納米銀/pva薄膜。

實(shí)施例2

絲素納米銀/pva抗菌薄膜的制備方法，包括如下步驟：

(1)蠶絲脫膠的制備：取10g蠶繭剪成小碎片，按浴比為1:30置于na2co3(0.5％)溶液中，沸水煮浴30min使繭絲表面的絲膠脫落，將脫膠后的繭絲自然干燥得到脫膠蠶絲；

(2)絲素溶液制備：將步驟(1)制得的脫膠蠶絲加入溴化鋰溶液(9.3mol/l)中使絲素完全溶解，然后將溶解的絲素溶液倒入透析袋中，透析48h除去溴化鋰，得到的絲素蛋白；

(3)絲素-納米銀溶液的制備：將步驟(2)制得的絲素蛋白配制成濃度為2％(wt)的溶液，然后加入硝酸銀溶液至硝酸銀濃度為4mg/ml，在光照下反應(yīng)24h，得到絲素-納米銀溶液；

(4)絲膠納米銀/pva薄膜的制備：將制備好的絲素-納米銀溶液(2％)與pva溶液(2％)按體積比為4:2均勻混合得到混合溶液，將混合溶液反復(fù)凍融4次后得到絲素-納米銀/pva凝膠，最后在37℃烘箱中放置12h后得到絲素-納米銀/pva薄膜。

實(shí)施例3

絲素納米銀/pva抗菌薄膜的制備方法，包括如下步驟：

(1)蠶絲脫膠的制備：取10g蠶繭剪成小碎片，按浴比為1:30置于na2co3(0.5％)溶液中，沸水煮浴30min使繭絲表面的絲膠脫落，將脫膠后的繭絲自然干燥得到脫膠蠶絲；

(2)絲素溶液制備：將步驟(1)制得的脫膠蠶絲加入溴化鋰溶液(9.3mol/l)中使絲素完全溶解，然后將溶解的絲素溶液倒入透析袋中，透析48h除去溴化鋰，得到的絲素蛋白；

(3)絲素-納米銀溶液的制備：將步驟(2)制得的絲素蛋白配制成濃度為2％(wt)的溶液，然后加入硝酸銀溶液至硝酸銀濃度為4mg/ml，在光照下反應(yīng)24h，得到絲素-納米銀溶液；

(4)絲膠納米銀/pva薄膜的制備：將制備好的絲素-納米銀溶液(2％)與pva溶液(2％)按體積比為4：4均勻混合得到混合溶液，將混合溶液反復(fù)凍融4次后得到絲素-納米銀/pva凝膠，最后室溫中放置干燥至得到絲素-納米銀/pva薄膜。

上述實(shí)施例中，絲素-納米銀和聚乙烯醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在1～5％范圍內(nèi)均可實(shí)現(xiàn)發(fā)明目的。

圖1為檢測(cè)絲素蛋白的提取情況，a為uv-vis檢測(cè)絲素蛋白中肽鍵和芳香族氨基酸的吸收；b為熒光檢測(cè)絲素蛋白中酪氨酸內(nèi)源熒光吸收，結(jié)果表明絲素蛋白提取成功。

圖2為納米穩(wěn)定性檢測(cè)，a為絲素-納米銀分別在ph5.0、ph7.4和ph10.0條件下的穩(wěn)定性，結(jié)果表明絲素-納米銀在酸性和堿性條件下均穩(wěn)定；b為絲素-納米銀在50℃、75℃和100℃高溫條件下的穩(wěn)定性，結(jié)果表明絲素-納米銀在高溫中穩(wěn)定性好；c為絲素-納米銀在37℃、50℃和65℃的長(zhǎng)達(dá)到15天的穩(wěn)定性，結(jié)果表明絲素-納米銀具有長(zhǎng)時(shí)間的熱穩(wěn)定性，d為絲素-納米銀在-196℃、-80℃和-20℃冷凍下的穩(wěn)定性，結(jié)果表明絲素-納米銀冷凍穩(wěn)定性好。

圖3為絲素-納米銀檢測(cè)結(jié)果，a為絲素-納米銀uv-vis檢測(cè)結(jié)果，b為絲素-納米銀/pva的frsem檢測(cè)，c為絲素-納米銀/pva檢測(cè)，d為絲素-納米銀/pva的eds檢測(cè)，結(jié)果表明納米銀成功在絲素蛋白表面合成。

圖4為絲素-納米銀/pva檢測(cè)結(jié)果，a為絲素納米銀/pva薄膜tga檢測(cè)結(jié)果表明納米銀的生成以及合成納米銀絲素/pva薄膜的熱穩(wěn)定性有所提高，b為絲素納米銀/pva薄膜ft-ir檢測(cè)。結(jié)果表明pva與絲素納米銀混合均勻。

圖5為絲素-納米銀/pva薄膜力學(xué)性能檢測(cè)，a為絲素納米銀/pva薄膜的拉伸強(qiáng)度、b為絲素-納米銀/pva薄膜的伸長(zhǎng)率；結(jié)果表明pva加入絲素納米銀能提高絲素納米銀的拉伸強(qiáng)度和伸長(zhǎng)率，并且隨著pva添加量增加，拉伸強(qiáng)度和伸長(zhǎng)率增加。

圖6為絲素納米銀/pva薄膜接觸角檢測(cè)；結(jié)果表明，pva與絲素納米銀共混后水觸角增加，表明絲素納米銀/pva薄膜具有較好的疏水性性。

絲素納米銀/pva薄膜抗菌檢測(cè)實(shí)驗(yàn)：

1.生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)

本發(fā)明通過(guò)對(duì)自然生長(zhǎng)的細(xì)菌和加入絲素/pva薄膜、絲素納米銀/pva薄膜的細(xì)菌生長(zhǎng)曲線進(jìn)行對(duì)比，從而確定絲素納米銀/pva薄膜的抗菌效果，具體方法為：

(1)分別取大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的單菌落接種于滅菌的100mllb液體培養(yǎng)基(ph7.4)中，在轉(zhuǎn)速為220rpm、溫度為37℃條件下培養(yǎng)12小時(shí)；

(2)分別取步驟(1)活化的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌懸液100μl加入到8mllb培養(yǎng)基中，每種菌液準(zhǔn)備5組，其中一組為空白組，其余4組分別加入絲素/pva薄膜、絲素納米銀/pva薄膜(4：1)、絲素納米銀/pva薄膜(4：2)、絲素納米銀/pva薄膜(4：4)，然后在溫度為37℃條件下培養(yǎng)，并在0h、2h、4h、6h、8h、12h、18h、24h時(shí)取菌懸液0.5ml，于4℃冰箱保藏；

(3)待培養(yǎng)24小時(shí)的菌懸液取樣后將不同時(shí)間取出的菌懸液從4℃冰箱中取出，室溫(18-25℃)下放置20-40min后利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其在600nm處的光吸收值，根據(jù)測(cè)得的吸收值分別繪制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果如圖7所示。分析絲素/pva薄膜、絲素納米銀/pva薄膜對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響，結(jié)果顯示，添加絲素納米銀/pva薄膜的絲膠薄膜后，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)均受到了明顯抑制，表明本發(fā)明制備的絲素納米銀/pva薄膜具有優(yōu)異的抗菌性能。

1.抑菌圈實(shí)驗(yàn)

為進(jìn)一步確定絲素納米銀/pva薄膜的抗菌作用，利用抑菌圈的方法測(cè)試了絲素-納米銀/pva薄膜對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果。具體方法如下：

(1)分別取大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的單菌落接種于滅菌的100mllb液體培養(yǎng)基(ph7.4)中，在轉(zhuǎn)速為220rpm、溫度為37℃條件下培養(yǎng)10小時(shí)；

將步驟(1)活化的菌懸液稀釋100倍后取200-300μl加入lb固體培養(yǎng)基表面，并在轉(zhuǎn)速為220rpm的搖床中培養(yǎng)1-2小時(shí)，使稀釋液均勻分布在瓊脂培養(yǎng)基表面；

(2)取直徑為1cm的絲膠凝膠、絲素納米銀/pva薄膜，平鋪在稀釋液分布均勻的lb培養(yǎng)基表面；然后在37℃條件下培養(yǎng)12h，結(jié)果如圖8所示。結(jié)果顯示，在放置有絲膠凝膠的lb培養(yǎng)基中，接種大腸桿菌的培養(yǎng)基和接種金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)基上沒(méi)有形成明顯的抑菌圈，表明絲膠/pva薄膜本身對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)沒(méi)有抑制作用，而在包含絲素納米銀/pva薄膜lb培養(yǎng)基中，都觀察到形成了一定的抑菌圈，表明絲素納米銀/pva薄膜具有抑菌能力。

圖9為絲素納米銀/pva薄膜在不同酸堿環(huán)境下的穩(wěn)定性：(a)為酸性環(huán)境下的穩(wěn)定性(ph＝4)、(b)為中性環(huán)境下的穩(wěn)定性(ph＝7.4)、(c)為堿性環(huán)境下的穩(wěn)定性(ph＝10)。結(jié)果表明，絲素納米銀/pva薄膜在不同酸堿環(huán)境下穩(wěn)定性好。

最后說(shuō)明的是，以上優(yōu)選實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過(guò)上述優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。