本發(fā)明屬于生物材料領(lǐng)域，涉及多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠的制備方法，還涉及由該方法制得的產(chǎn)品和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

感染是創(chuàng)傷護(hù)理領(lǐng)域最為普遍的并發(fā)癥之一，嚴(yán)重開放性創(chuàng)傷患者發(fā)生感染的幾率高達(dá)百分之十以上，如何有效地降低開放性創(chuàng)傷感染發(fā)生的風(fēng)險，已經(jīng)成為創(chuàng)傷修復(fù)領(lǐng)域亟待解決的熱點及難點問題。新型抗菌材料的應(yīng)用有望解決這一問題，使用適宜的局部抗菌敷料可以充分降低傷口的感染，同時全面促進(jìn)傷口痊愈。

近幾年，隨著材料學(xué)和組織工程學(xué)的飛速發(fā)展，許多新型醫(yī)用敷料應(yīng)運而生。理想的敷料應(yīng)該具有可吸收傷口滲出液、保持傷口接觸面的溫度及濕度、良好的透氣性、抗菌消炎等優(yōu)點。水凝膠敷料較為接近理想敷料的要求具有高吸收、保濕、易更換等優(yōu)點。因為水凝膠是由親水性高分子化合物通過共價鍵、離子鍵或氫鍵等交聯(lián)得到的一種含有大量水分、具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的溶脹體，具備一定的抗壓強度，且能夠為傷口提供濕潤的環(huán)境，與生物組織有較好的相容性。正是因為如此高的含水量，使水凝膠可以隨意塑形，適合于任何部位的創(chuàng)面，為傷口的愈合提供必要條件，其生物相容性也更優(yōu)于纖維、薄膜類敷料。因而創(chuàng)傷敷料等生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域受到極大的關(guān)注，有著極為良好的應(yīng)用前景。

然而傳統(tǒng)的高分子水凝膠的原料多為工業(yè)合成，制備成本較高且制備環(huán)節(jié)繁瑣復(fù)雜，制備過程中易帶來環(huán)境污染等原因，運用天然高分子制備高吸水凝膠越來越受到大家的青睞。絲膠是包裹在絲素纖維表層的一種天然大分子粘性蛋白，對絲素起到保護(hù)和黏連的作用，是構(gòu)成蠶繭的兩種主要的蛋白之一，約占蠶繭的25％。在組成絲膠的18種氨基酸中有8種是人體必須的氨基酸，含有高含量的甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸以及酪氨酸，具許多藥理作用、保健功能和很高的營養(yǎng)價值。此外，絲膠蛋白具有良好的生物活性，如抗氧化性、抗菌、抗交聯(lián)、促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化等功能，而且絲膠蛋白具有生物降解性、親水性、并且擁有豐富的極性基團(tuán)，因此受到越來越多的關(guān)注并運用于再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。但純凈的絲膠水凝膠性質(zhì)脆弱，且在潮濕的環(huán)境中易成為細(xì)菌滋生的溫床。因此研發(fā)具有良好的生物相容性、良好的力學(xué)性能和穩(wěn)定性的絲膠抗菌材料，充分發(fā)揮絲膠蛋白的優(yōu)勢，具有重要的經(jīng)濟(jì)效益和社會意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠的制備方法；本發(fā)明的目的之二在于提供由上述方法制得的產(chǎn)品；本發(fā)明的目的之三在于提供利用所述多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠制備負(fù)載藥物的多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠；本發(fā)明的目的之四在于提供負(fù)載藥物的多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠的制備方法；本發(fā)明的目的之五在于提供所述負(fù)載藥物的多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠在制備抗菌敷料中的應(yīng)用。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

1、多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠的制備方法，包括如下步驟：將絲膠溶液與聚乙烯醇溶液混合后加入模具中，靜置后在低于0℃和高于0℃下反復(fù)凍融至孔徑形成，然后進(jìn)行冷凍干燥，得多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠。

本發(fā)明操作簡單，條件溫和，綠色環(huán)保，制備多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠有良好的力學(xué)性能、吸濕性能。

本發(fā)明中，所述絲膠溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1～5％；所述聚乙烯醇溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1～5％。

優(yōu)選的，所述絲膠溶液與聚乙烯醇溶液的體積比為1：1～4：1。

更優(yōu)選的，所述反復(fù)凍融為在-20℃和18～25℃下交替進(jìn)行；或在-80℃和18～25℃下交替進(jìn)行；或在-196℃和18～25℃下交替進(jìn)行。不同的溫度獲得不同孔隙大小和孔隙率的凝膠，因此可以通過調(diào)控溫度獲得可控的孔隙大小和孔隙率。

本發(fā)明通過高溫高壓和冷凍干燥法制備絲膠粉末，具體為：將蠶繭剪成小碎片，于120℃、0.1mpa條件下處理，然后用紗布過濾，除去不溶性物質(zhì)，冷凍干燥，得到絲膠粉末；然后重溶制得絲膠溶液。

2、由所述制備方法制得的多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠。

3、利用所述多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠制備負(fù)載藥物的多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠。

本發(fā)明中，所述藥物為慶大霉素和阿司匹林，慶大霉素和阿司匹林濃度分別為0.3～0.5mg/ml和2～5mg/ml。

4、所述負(fù)載藥物的多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠的制備方法，將所述多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠浸潤于含有藥物的溶液中，得負(fù)載藥物的多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠。

5、所述負(fù)載藥物的多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠在制備抗菌敷料中的應(yīng)用。

本發(fā)明通過高溫高壓和冷凍干燥法制備絲膠粉末，將絲膠蛋白溶液與pva共混溶液經(jīng)過反復(fù)凍融的方法制備出具有較好力學(xué)性能的絲膠/聚乙烯醇凝膠。經(jīng)過冷凍干燥后的絲膠/聚乙烯醇凝膠具有可控的孔隙大小和孔隙率。在多孔凝膠上裝載上藥物(慶大霉素和阿司匹林)

使其具有良好的抗菌性能和消炎鎮(zhèn)痛的功效。本發(fā)明操作簡單，條件溫和，綠色環(huán)保，制備的藥物裝載的絲膠/聚乙烯醇凝膠有良好的力學(xué)性能、吸濕性能和抗菌的消炎功效有望用于抗菌敷料等相關(guān)生物醫(yī)療材料領(lǐng)域。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明通過將絲膠蛋白溶液，與pva溶液共混后經(jīng)過反復(fù)凍融的方法制備出具有較好力學(xué)性能的的絲膠/聚乙烯醇凝膠。經(jīng)過冷凍干燥后的絲膠/聚乙烯醇凝膠具有可控的孔隙大小和孔隙率。在多孔凝膠上裝載上藥物(慶大霉素和阿司匹林)使其具有良好的抗菌性能和消炎鎮(zhèn)痛的功效。sem測試結(jié)果顯示絲膠/聚乙烯醇凝膠具有可控的大孔小隙；ft-ir、xrd、tga以及熒光測試表明絲膠和pva混合均勻且不引起絲膠結(jié)構(gòu)的改變；接觸角測試表明絲膠/聚乙烯醇凝膠具有很好的吸濕性能；抗菌測試表明裝載藥物的絲膠/pva具有很好的抗菌性能；細(xì)胞毒性實驗結(jié)果顯示絲膠/聚乙烯醇凝膠以及裝載藥物的絲膠/聚乙烯醇凝膠沒有細(xì)胞毒性；模擬傷口感染模型測試表明藥物裝載的絲膠/聚乙烯醇凝膠能夠保護(hù)傷口防止細(xì)菌對創(chuàng)傷部位的侵染。本發(fā)明操作簡單，條件溫和，綠色環(huán)保，制備的藥物裝載的絲膠/聚乙烯醇凝膠有望用于抗菌敷料等相關(guān)生物醫(yī)療材料領(lǐng)域。

附圖說明

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖進(jìn)行說明：

圖1檢測不同冷凍條件下制備的不同比例放的絲膠/聚乙烯醇凝膠的孔隙情況：(a)sem觀察不同冷凍條件下制備的絲膠/聚乙烯醇凝膠的孔隙；(b)不同冷凍條件下制備的不同比例絲膠/聚乙烯醇凝膠的孔隙大小統(tǒng)計；(c)-80℃冷凍條件下制備的絲膠/聚乙烯醇凝膠(4/1-4/2-4/4)的孔隙率；

圖2絲膠/聚乙烯醇凝膠的表征；(a)ft-ir檢測表明絲膠與pva混合均勻；(b)力學(xué)性能檢測加入pva顯著提高絲膠的力學(xué)性能；(c)xrd檢測加入pva不影響絲膠的晶型結(jié)構(gòu)；(d)tga檢測表明pva能提高穩(wěn)定性；

圖3絲膠/聚乙烯醇凝膠吸水性測試；(a)絲膠/pva接觸角表示快速吸收；(b)絲膠/pva溶脹平衡時間表明絲膠是快速吸水的主要物質(zhì)；(c)絲膠/pva吸水率表明在酸堿環(huán)境中都能大量吸水；

圖4絲膠/聚乙烯醇凝膠熒光檢測表明絲膠與pva形成互穿孔凝膠；

圖5藥物裝載的絲膠/聚乙烯醇凝膠藥物釋放檢測：(a)慶大霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線、(b)阿司匹林的標(biāo)準(zhǔn)曲線、(c)慶大霉素的釋放曲線、(d)阿司匹林的釋放曲線；

圖6藥物裝載的絲膠/聚乙烯醇凝膠的抑菌曲線測試和抑菌圈實驗：(a)(c)抑制大腸桿菌、(b)(d)抑制金黃色葡萄球菌；

圖7藥物裝載的絲膠/聚乙烯醇凝膠細(xì)胞毒性測試：(a)nih3t3細(xì)胞的細(xì)胞活力測試、(b)hek293細(xì)胞的細(xì)胞活力測試、(c)nih3t3細(xì)胞的死活細(xì)胞染色檢測、(d)hek293細(xì)胞的死活細(xì)胞染色檢測；

圖8藥物裝載的絲膠/聚乙烯醇凝膠的傷口感染模型檢：(a)傷口感染模型、(b)為nih3t3細(xì)胞傷口模型中細(xì)胞與細(xì)菌的活性統(tǒng)計、(c)為hek293細(xì)胞傷口模型中細(xì)胞與細(xì)菌的活性統(tǒng)計、(d)為nih3t3細(xì)胞傷口模型中死活細(xì)胞染色檢測、(e)為nih3t3細(xì)胞傷口模型中細(xì)菌涂板檢測活力、(f)為hek293細(xì)胞傷口模型中死活細(xì)胞染色檢測、(g)為hek293細(xì)胞傷口模型中細(xì)菌涂板檢測活力。

具體實施方式

下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。

實施例1、絲膠-聚乙烯醇凝膠的制備

方案1：

多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠的制備方法，包括如下步驟：

(1)絲膠蛋白的提取：將蠶繭剪成小碎片，置于高壓鍋中高溫高壓(120℃、0.1mpa)制備絲膠溶液，將制備的絲膠溶液用紗布過濾，除去包含絲素在內(nèi)的不溶性物質(zhì)，得到絲膠溶液，將得到的絲膠溶液冷凍干燥，得到絲膠粉末；

(2)多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠的制備：將絲膠粉末重溶后制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2％的絲膠溶液，然后與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2％的pva溶液按體積比為4：1混合后加入模具中，于室溫(18～25℃)放置10min后放入-20℃冰箱中反復(fù)凍融3-4次，然后進(jìn)行冷凍干燥，制得多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠。

按照相同的方法，區(qū)別在于反復(fù)凍融分別在-80℃和196℃條件下進(jìn)行。

方案2：

多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠的制備方法，包括如下步驟：

(1)絲膠蛋白的提取：將蠶繭剪成小碎片，置于高壓鍋中高溫高壓(120℃、0.1mpa)制備絲膠溶液，將制備的絲膠溶液用紗布過濾，除去包含絲素在內(nèi)的不溶性物質(zhì)，得到絲膠溶液，將得到的絲膠溶液冷凍干燥，得到絲膠粉末；

(2)多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠的制備：將絲膠粉末重溶后制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的絲膠溶液，然后與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的pva溶液按體積比為4：2混合后加入模具中，于室溫(18～25℃)放置10min后放入-80℃冰箱中反復(fù)凍融，然后進(jìn)行冷凍干燥，制得多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠。

按照相同的方法，區(qū)別在于絲膠溶液與pva溶液的體積比分別為4:1和4:4。

方案3：

多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠的制備方法，包括如下步驟：

(1)絲膠蛋白的提?。簩⑿Q繭剪成小碎片，置于高壓鍋中高溫高壓(120℃、0.1mpa)制備絲膠溶液，將制備的絲膠溶液用紗布過濾，除去包含絲素在內(nèi)的不溶性物質(zhì)，得到絲膠溶液，將得到的絲膠溶液冷凍干燥，得到絲膠粉末；

(2)多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠的制備：將絲膠粉末重溶后制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％的絲膠溶液，然后與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％的pva溶液按體積比為4：2混合后加入模具中，于室溫(18～25℃)放置10min后放入-80℃冰箱中反復(fù)凍融，然后進(jìn)行冷凍干燥，制得多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠。

檢測不同冷凍條件制得的多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠的孔隙情況，結(jié)果如圖1所示。圖1中a為sem觀察不同冷凍條件下制備的絲膠/聚乙烯醇凝膠的孔隙，圖1中b為不同冷凍條件下制備的多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠的孔隙大小統(tǒng)計，結(jié)果表明，不同冷凍條件下制得的多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠的孔徑不同，溫度越低，孔徑越小。圖1中c為-80℃冷凍條件下絲膠溶液與pva溶液不同比例制備的多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠的孔斜率，結(jié)果表明，絲膠溶液與pva溶液在不同比例下都有較高的孔斜率。

圖2為多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠的表征；a為ft-ir檢測表面特征；b為力學(xué)性能檢測結(jié)果；c為xrd檢測晶型結(jié)構(gòu)；d為tga檢測穩(wěn)定性。結(jié)果表明，絲膠與pva混合均勻，加入pva后能夠顯著提高絲膠的力學(xué)性能，并且不影響絲膠的晶型結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定性提高。

圖3為多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠吸水性測試；a為多孔絲膠/pva接觸角結(jié)果，表明多孔絲膠/pva快速吸收水，b為多孔絲膠/pva溶脹平衡時間，表明絲膠是快速吸水的主要物質(zhì)；c為絲膠/pva吸水率，表明在酸堿環(huán)境中都能大量吸水。

圖4為多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠熒光檢測結(jié)果。結(jié)果表明絲膠與pva形成互穿孔凝膠。

實施例2、多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠負(fù)載藥物

方案1：

多孔絲膠-聚乙烯醇凝膠負(fù)載藥物的方法，包括如下步驟：

實施例1方案1制得的多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠浸潤于慶大霉素濃度為0.05mg/ml、阿司匹林濃度為0.2mg/ml的混合溶液中，得負(fù)載藥物的多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠。

方案2：

多孔絲膠-聚乙烯醇凝膠負(fù)載藥物的方法，包括如下步驟：

實施例1方案1制得的多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠浸潤于慶大霉素濃度為0.03mg/ml、阿司匹林濃度為0.2mg/ml的混合溶液中，得負(fù)載藥物的多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠。

方案3：

多孔絲膠-聚乙烯醇凝膠負(fù)載藥物的方法，包括如下步驟：

實施例1方案1制得的多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠浸潤于慶大霉素濃度為0.03mg/ml、阿司匹林濃度為0.5mg/ml的混合溶液中，得負(fù)載藥物的多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠。

圖5為負(fù)載藥物的多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠的檢測結(jié)果；a為慶大霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，b為阿司匹林的標(biāo)準(zhǔn)曲線，c為慶大霉素的釋放曲線，d為阿司匹林的釋放曲線。

實施例3、負(fù)載藥物的多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠抗菌檢測實驗

1.抑菌生長曲線實驗

本發(fā)明通過對自然生長的細(xì)菌和加入多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠、負(fù)載藥物的多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠的細(xì)菌生長曲線進(jìn)行對比，從而確定藥物裝載的絲膠/聚乙烯醇凝膠的抗菌效果，具體方法為：

(1)分別取大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的單菌落接種于滅菌的100mllb液體培養(yǎng)基(ph7.4)中，在轉(zhuǎn)速為220rpm、溫度為37℃條件下培養(yǎng)12小時；

(2)分別取步驟(1)活化的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌懸液100μl加入到8mllb培養(yǎng)基中，每種菌液準(zhǔn)備5組，其中一組為空白組，其余4組分別加入多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠、負(fù)載藥物的多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠(絲膠：聚乙烯醇凝膠＝4：1)、負(fù)載藥物的多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠(絲膠：聚乙烯醇凝膠＝4：2)、負(fù)載藥物的多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠(絲膠：聚乙烯醇凝膠＝4：4)，然后在轉(zhuǎn)速為220rpm、溫度為37℃條件下培養(yǎng)，并在0h、12h、24h時取菌懸液0.5ml，檢測其在600nm處的光吸收值，根據(jù)測得的吸收值分別繪制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長情況，結(jié)果如圖6中a和b所示。分析多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠、負(fù)載藥物的多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠對細(xì)菌生長的影響，結(jié)果顯示，添加藥物負(fù)載的多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠后，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長均受到了明顯抑制，表明本發(fā)明制備的負(fù)載藥物的多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠具有優(yōu)異的抗菌性能。

2.抑菌圈實驗

為進(jìn)一步確定負(fù)載藥物的多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠的抗菌作用，利用抑菌圈的方法測試了負(fù)載藥物的多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果。具體方法如下：

(1)分別取大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的單菌落接種于滅菌的100mllb液體培養(yǎng)基(ph7.4)中，在轉(zhuǎn)速為220rpm、溫度為37℃條件下培養(yǎng)10小時；

(2)將步驟(1)活化的菌懸液稀釋100倍后取200-300μl加入lb固體培養(yǎng)基表面，并在轉(zhuǎn)速為220rpm的搖床中培養(yǎng)1-2小時，使稀釋液均勻分布在瓊脂培養(yǎng)基表面；

(3)取直徑為0.3cm的多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠、負(fù)載藥物的多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠(絲膠：聚乙烯醇凝膠＝4：1)、負(fù)載藥物的多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠(絲膠：聚乙烯醇凝膠＝4：2)、負(fù)載藥物的多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠(絲膠：聚乙烯醇凝膠＝4：4)，平鋪在稀釋液分布均勻的lb培養(yǎng)基表面；然后在37℃條件下培養(yǎng)12h，結(jié)果如圖6中c和d所示。結(jié)果顯示，在放置有多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠的lb培養(yǎng)基中，接種大腸桿菌的培養(yǎng)基和接種金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)基上沒有形成明顯的抑菌圈，表明多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠本身對細(xì)菌的生長沒有抑制作用，而在含負(fù)載藥物的多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠的lb培養(yǎng)基中，都觀察到形成了明顯的抑菌圈，表明藥物裝載的絲膠/pva薄膜對細(xì)菌的生長抑制作用明顯甚至能夠殺滅細(xì)菌。

實施例4、負(fù)載藥物的多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠的細(xì)胞毒性實驗

為了確定負(fù)載藥物的多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠生物相容性，進(jìn)行了細(xì)胞毒性實驗，所選細(xì)胞為小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(nih3t3)和人胚胎腎細(xì)胞(hek293)。具體方法為：

1、將nih/3t3和hek293細(xì)胞培養(yǎng)于含有10％(v/v)胎牛血清(fbs，gibco)的dmem培養(yǎng)基中，在含5％co2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

2、收集生長至96％匯合度的nih/3t3和hek293細(xì)胞按500/100ul/孔平鋪到48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在含5％co2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h；

3、將0.3cm的多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠、負(fù)載藥物的多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠添加到48孔板中，在含5％co2，37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12h、24h和36h；

4、向48孔板中按照20μl/孔的劑量加入cck-8試劑，在含5％co2，37℃條件培養(yǎng)1.5h，在450nm波長下測定孔內(nèi)的細(xì)胞吸光值。結(jié)果如圖7中a和b所示，多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠對細(xì)胞生長沒有影響，負(fù)載藥物的多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠對細(xì)胞生長也沒有影響，表明沒有細(xì)胞毒性。

5、同時在對細(xì)胞進(jìn)行死活細(xì)胞染色檢測吧。結(jié)果如圖7中c和d所示，在多孔絲膠/pva處理后的細(xì)胞和負(fù)載藥物的多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠處理后的細(xì)胞和對照組相比都是活細(xì)胞的狀態(tài)，基本觀察不到死細(xì)胞的存在，表明沒有細(xì)胞毒性。

實施例5、傷口感染模型實驗

為了確定負(fù)載藥物的多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠實際運用，進(jìn)行傷口感染模型實驗，所選小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(nih/3t3)和人胚胎腎細(xì)胞(hek293)作為感染細(xì)胞。具體方法為：

1.將nih/3t3和hek293細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板中在含有10％(v/v)胎牛血清(fbs，gibco)的dmem培養(yǎng)基中，5％co2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h待其長成單層細(xì)胞；

2.吸出24孔板中的培養(yǎng)基，并用pbs洗三遍，加入新鮮的無抗培養(yǎng)基，此時的單層細(xì)胞模擬創(chuàng)傷皮膚。向每孔細(xì)胞中加入10μl金黃色葡萄球菌，加入的細(xì)菌模擬感染傷口的細(xì)菌。最后在培養(yǎng)基上置入負(fù)載藥物的多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠模擬傷口敷料(圖8，a)；

3.傷口感染模型在含5％co2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h吸取10μl培養(yǎng)基涂板檢測細(xì)菌的活力，cck-8試劑檢測細(xì)胞的活性，同時死細(xì)胞染色檢測細(xì)胞的存活情況，結(jié)果如圖8中b和c所示；結(jié)果顯示加入敷料的實驗組與對照相比細(xì)菌存活率極低而細(xì)胞存活率極高。

4.死活細(xì)胞染色檢測結(jié)果如圖8中d和f所示。結(jié)果顯示，加入敷料的實驗組的細(xì)胞基本存活下來，很少看到死細(xì)胞，而實驗組基本觀察不到活細(xì)胞。涂板檢測結(jié)果如圖8中e和g所示，結(jié)果顯示對照組中存在大量的細(xì)菌，而實驗組中則基本觀察不到細(xì)菌。實驗結(jié)果表明負(fù)載藥物的多孔絲膠/聚乙烯醇凝膠能夠保護(hù)細(xì)胞免受細(xì)菌的侵染并且能夠殺死細(xì)菌且對細(xì)胞生長沒有影響。

最后說明的是，以上優(yōu)選實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過上述優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。