發(fā)明所屬領(lǐng)域：本發(fā)明屬于動(dòng)物細(xì)胞系領(lǐng)域，特別涉及一種人結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌細(xì)胞系的建立，及其動(dòng)物模型和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：：印戒細(xì)胞癌是結(jié)直腸腺癌的一種特殊亞型。根據(jù)2010年版who的組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)，印戒細(xì)胞癌被定義為組織內(nèi)50％以上的腫瘤細(xì)胞由胞漿中富含黏蛋白的腺癌細(xì)胞構(gòu)成，黏蛋白充滿細(xì)胞質(zhì)并使細(xì)胞核移位，在顯微鏡下呈典型印戒細(xì)胞樣結(jié)構(gòu)。原發(fā)于胃的印戒細(xì)胞癌在臨床上最為常見(jiàn)，約占到所有印戒細(xì)胞癌的95％以上，其他印戒細(xì)胞癌也可出現(xiàn)于結(jié)直腸癌、卵巢癌、腹膜癌及膽囊癌中。在結(jié)直腸癌中，印戒細(xì)胞癌是極為少見(jiàn)的，占所有結(jié)直腸癌的1％左右。印戒細(xì)胞癌的發(fā)病年齡較傳統(tǒng)腺癌明顯提前，不同文獻(xiàn)報(bào)道印戒細(xì)胞癌的平均發(fā)病年齡在52-67歲之間，小于40歲人群的發(fā)病率明顯高于傳統(tǒng)腺癌。結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌的預(yù)后比傳統(tǒng)腺癌較差，5年生存率在0％-36％之間，平均存活時(shí)間為9-45個(gè)月。與傳統(tǒng)腺癌相比，印戒細(xì)胞癌發(fā)現(xiàn)時(shí)的病期較晚，約60％的印戒細(xì)胞癌患者在確診時(shí)已經(jīng)處于iii期或iv期，i-ii期的印戒細(xì)胞癌比率僅有5％左右。此外，印戒細(xì)胞癌極易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腹膜轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移率分別高達(dá)79％及35.7％，卻較少發(fā)生肝轉(zhuǎn)移。腹膜轉(zhuǎn)移使患者喪失根治性手術(shù)的機(jī)會(huì)，且對(duì)化療的敏感性差，因此導(dǎo)致印戒細(xì)胞癌患者的預(yù)后更差。有關(guān)結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和耐藥的生物學(xué)機(jī)制目前尚不清楚。目前缺少用于結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌發(fā)生機(jī)理及抗印戒細(xì)胞癌藥物開(kāi)發(fā)的接近臨床腫瘤生物學(xué)特性的實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)對(duì)美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心atcc、上海細(xì)胞庫(kù)等國(guó)際上大型細(xì)胞庫(kù)搜索，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)已經(jīng)建立好的人結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌細(xì)胞系。由于臨床上無(wú)法獲得相同的病例，在方法學(xué)上無(wú)法進(jìn)行比較；更由于倫理道德的限制，以人本身作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象推動(dòng)醫(yī)學(xué)發(fā)展困難重重。離體培養(yǎng)的人源腫瘤細(xì)胞可充分反映腫瘤的臨床生物學(xué)特性，遺傳性穩(wěn)定的體外培養(yǎng)的人源腫瘤細(xì)胞對(duì)于藥物的耐藥性及敏感性具有很好的預(yù)測(cè)性，是研究結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制和抗腫瘤藥物篩選的理想實(shí)驗(yàn)材料。疾病的動(dòng)物模型是生物醫(yī)學(xué)研究中建立的具有人體疾病的癥狀相似表現(xiàn)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)象和材料。采用動(dòng)物模型對(duì)疾病進(jìn)行研究具有樣本數(shù)量大和性狀一致性，能更方便，更有效地認(rèn)識(shí)疾病的發(fā)生，發(fā)展規(guī)律，并提供預(yù)防和治療方法。由于病例數(shù)的限制，目前國(guó)內(nèi)外多數(shù)研究都基于病例報(bào)道或者小規(guī)模的回顧性研究，對(duì)于其發(fā)生發(fā)展機(jī)制的生物學(xué)研究相對(duì)少見(jiàn)。另外，結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌細(xì)胞與傳統(tǒng)腺癌細(xì)胞從細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)特性上都差別很大，對(duì)各種生長(zhǎng)因子的需求亦不同，所以無(wú)法參考現(xiàn)有的建細(xì)胞系方法培養(yǎng)結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌細(xì)胞。經(jīng)查閱大量文獻(xiàn)和專利數(shù)據(jù)，目前沒(méi)有發(fā)現(xiàn)已經(jīng)成功建立的結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌細(xì)胞系。因此，也缺少直腸印戒細(xì)胞癌細(xì)胞的動(dòng)物模型。因此，本領(lǐng)域的研究人員迫切需立結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌細(xì)胞系，以及結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌細(xì)胞的動(dòng)物模型。發(fā)明技術(shù)內(nèi)容：本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新的人結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌細(xì)胞系，該細(xì)胞系可穩(wěn)定傳代，可充分反映人結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌的臨床生物學(xué)特性。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種人結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌細(xì)胞的動(dòng)物模型，該動(dòng)物模型不僅充分反映腫瘤的臨床生物學(xué)特性，對(duì)于藥物的耐藥性及敏感性具有很好的預(yù)測(cè)性，是研究結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制和抗腫瘤藥物篩選的理想動(dòng)物模型。本發(fā)明的再一個(gè)目的是建立動(dòng)物模型的方法。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供篩選治療結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌的候選藥物的方法。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌細(xì)胞及其動(dòng)物模型的用途本發(fā)明公開(kāi)了一株人結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌細(xì)胞系，細(xì)胞命名為人結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌細(xì)胞系csrcc01，該細(xì)胞系保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為cctccno：c201722。本發(fā)明還公開(kāi)了人結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌細(xì)胞系的子代細(xì)胞系。子代細(xì)胞具有相同的遺傳穩(wěn)定性。本發(fā)明公開(kāi)的人結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌細(xì)胞及其子代細(xì)胞系具有下列生物學(xué)特征：1)將培養(yǎng)csrcc01細(xì)胞的培養(yǎng)瓶置于倒置顯微鏡下，在明視野下可見(jiàn)csrcc01細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)失去了接觸抑制，呈惡性生長(zhǎng)，具有懸浮生長(zhǎng)的特點(diǎn)，部分細(xì)胞可見(jiàn)新月形細(xì)胞核，符合印戒細(xì)胞的特點(diǎn)；2)csrcc01細(xì)胞連續(xù)傳代后，染色體仍保持人源性腫瘤細(xì)胞染色體的特征，表現(xiàn)為非整倍體，染色體眾數(shù)(m)集中在76-85之間，占70％；該csrcc01細(xì)胞為異倍體，染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)畸變嚴(yán)重，符合惡性腫瘤的遺傳學(xué)特征；3)csrcc01細(xì)胞免疫熒光染色顯示，上皮細(xì)胞粘附分子(epcam，綠色，400×)呈細(xì)胞膜陽(yáng)性，證明其上皮來(lái)源，黏液蛋白-2(mucin-2，紅色，400×)為胞漿內(nèi)強(qiáng)陽(yáng)性，將細(xì)胞核(dapi，藍(lán)色)擠向細(xì)胞的一側(cè)，符合其印戒細(xì)胞癌的病理特征；4)csrcc01細(xì)胞的倍增時(shí)間約為48小時(shí)；5)csrcc01細(xì)胞周期分布比例是g1期占56.867％，s期占36.695％，g2/m期占6.438％6)將5.0×106個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞懸液和基質(zhì)膠以1:1混合，皮下接種balb/c裸鼠，第38天時(shí)腫瘤體積為1148.39±327.16mm3；本發(fā)明的人直腸印戒細(xì)胞癌細(xì)胞系來(lái)源于新鮮的臨床人結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌手術(shù)切除送檢確認(rèn)標(biāo)本。本發(fā)明還公開(kāi)了人結(jié)直腸癌印戒細(xì)胞癌細(xì)胞系的建立方法，包括以下步驟：獲得新鮮的臨床人結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌手術(shù)切除標(biāo)本，切成20～50mg的小塊，pbs緩沖液(含500u/ml青霉素g、500μg/ml硫酸鏈霉素)漂洗3次，每次5分鐘，隨后用置于消化液(含dmem培養(yǎng)基、1％胎牛血清、500u/ml膠原蛋白酶iv、1.5mg/ml膠原蛋白酶ii、125μg/mlii型中性蛋白酶，20ug/ml透明質(zhì)酸酶及10μmly27632)中，37攝氏度水浴搖床消化30分鐘，劇烈搖晃離心管收集消化下來(lái)的細(xì)胞團(tuán)，用預(yù)冷的pbs緩沖液(含500u/ml青霉素g、500μg/ml硫酸鏈霉素)漂洗3次，每次應(yīng)用離心機(jī)69g、4℃離心5分鐘，細(xì)胞團(tuán)用基質(zhì)膠重懸，以200個(gè)細(xì)胞團(tuán)/50μl基質(zhì)膠的密度接種于24孔板，將24孔板于37℃放置5分鐘使基質(zhì)膠聚合，每孔加入500μladvanceddmem/f12培養(yǎng)基[含體積百分比10％的胎牛血清、1×normocin(invivogen)、1×gentamicin/amphotericinb(gibco)、10mmhepes、10mmglutamax、1×n2,1×b27,1mmn-乙酰半胱氨酸,50ng/ml表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子,500ng/mlnoggin,500ng/mlr-spondin]，于37℃培養(yǎng)箱體積百分比5％的co2條件下培養(yǎng)。約14天后，可見(jiàn)細(xì)胞團(tuán)增大，收集基質(zhì)膠，應(yīng)用預(yù)冷的pbs緩沖液漂洗3次，每次應(yīng)用離心機(jī)69g離心5分鐘，接種于培養(yǎng)瓶中，靜置培養(yǎng)，可見(jiàn)印戒細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)。本發(fā)明還公開(kāi)了人結(jié)直腸癌印戒細(xì)胞癌細(xì)胞系的傳代方法：將懸浮細(xì)胞及培養(yǎng)基收集、離心，pbs緩沖液漂洗1次，用advanceddmem/f12培養(yǎng)基重懸并以1:5的比例接種于新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。本發(fā)明還公開(kāi)了人結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌細(xì)胞的用途，該細(xì)胞用于在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生人結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌，其優(yōu)選的哺乳動(dòng)物是裸鼠。在離體培養(yǎng)的人結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌細(xì)胞中施加無(wú)細(xì)胞毒性測(cè)試化合物，導(dǎo)致人結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌細(xì)胞數(shù)量減少或死亡的測(cè)試化合物就是治療結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌的候選化合物。本發(fā)明還公開(kāi)了一種建立人結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌動(dòng)物模型的方法,其特征在于，包括步驟：(a)將1—5.0×106個(gè)人結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌細(xì)胞的細(xì)胞懸液和基質(zhì)膠以1:1混合，皮下接種裸鼠；(b)培養(yǎng)步驟(a)的裸鼠2-4周，獲得人結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌動(dòng)物模型。本發(fā)明公開(kāi)的一個(gè)優(yōu)選方法是：(a)將5.0×106個(gè)保藏編號(hào)為cctccno：c201722的細(xì)胞懸液和基質(zhì)膠以1:1混合，皮下接種裸鼠；(b)培養(yǎng)步驟(a)的裸鼠4周，獲得人結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌動(dòng)物模型。本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了一種篩選治療結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌的候選藥物的方法，其特種在于，它包括步驟：(a)將1—5.0×106個(gè)的人結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌細(xì)胞的細(xì)胞懸液和基質(zhì)膠以1:1混合，皮下接種裸鼠；(b)培養(yǎng)步驟(a)的裸鼠2-4周，獲得人結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌動(dòng)物模型；(c)將測(cè)試化合物施用于步驟(b)的人結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌動(dòng)物模型，并與未施用測(cè)試化合物的步驟(b)的人結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌動(dòng)物模型比較，其中施用后使結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌癥狀改善或治愈的測(cè)試化合物就是治療結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌的候選化合物。在步驟(c)中，將測(cè)試化合物施用于動(dòng)物模型的方式選自：局部施用于人結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌病灶處、靜脈給藥、口服給藥。在本發(fā)明中，結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌也叫直腸印戒細(xì)胞癌細(xì)胞。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：于現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有如下優(yōu)點(diǎn)：相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果如下：1)本發(fā)明的人結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌細(xì)胞系性狀穩(wěn)定，可穩(wěn)定多次傳代，為結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌提供新的更接近于臨床腫瘤生物學(xué)特性的實(shí)驗(yàn)材料。2)本發(fā)明的細(xì)胞系具有高度成瘤性，可以成功制備結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌動(dòng)物模型，所制的動(dòng)物模型可以用于基礎(chǔ)研究及藥物篩選。通過(guò)與裸小鼠體內(nèi)傳代親本腫瘤相比較，可用于分析體外、體內(nèi)藥物敏感性及耐藥性的相關(guān)性，可以建立體外、體內(nèi)兩個(gè)相關(guān)聯(lián)的抗結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌藥物篩選平臺(tái)。3)本發(fā)明提供的動(dòng)物模型可以用于研究結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)理和耐藥機(jī)理，進(jìn)而可以尋找結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移和耐藥特征性生物標(biāo)志物。4)本發(fā)明公開(kāi)的細(xì)胞系是人結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌的臨床前期應(yīng)用的理想細(xì)胞系。生物材料的保藏本發(fā)明的人結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌細(xì)胞系csrcc01，于2017年4月12日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，保藏編號(hào)為cctccno：c201722,研究者可依法從cctcc獲取該細(xì)胞，再現(xiàn)本發(fā)明。中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心位于中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)，郵編430072，email：cctcc@whu.edu.cn.附圖說(shuō)明圖1是人結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌細(xì)胞系csrcc01的形態(tài)學(xué)觀察(100×)圖2是人結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌細(xì)胞系csrcc01細(xì)胞的染色體分析圖3是人結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌細(xì)胞系csrcc01細(xì)胞的免疫熒光染圖圖4是人結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌細(xì)胞系csrcc01細(xì)胞的生長(zhǎng)模式圖圖5是人結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌細(xì)胞系csrcc01細(xì)胞周期分析圖圖6是人結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌細(xì)胞系csrcc01細(xì)胞的成瘤性效果圖，圖中a表示終點(diǎn)時(shí)小鼠腫瘤；圖中b表示人結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌細(xì)胞系csrcc01細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)生長(zhǎng)曲線(腫瘤體積)。圖7是人結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌腫瘤模型的病理組織切片圖，圖中a表示臨床上取得的腫瘤標(biāo)本(100×)；圖中b表示人結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌細(xì)胞系csrcc01細(xì)胞在裸小鼠體內(nèi)成瘤(100×)。圖8是人結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌細(xì)胞系csrcc01動(dòng)物模型體內(nèi)給抗腫瘤藥抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)圖。圖9是人結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌細(xì)胞系csrcc01在體外96孔板施加化療藥物5-fu,sn-38致癌細(xì)胞數(shù)量減少圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體的實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不能限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1培養(yǎng)基配制，試劑配制：培養(yǎng)基配方實(shí)施例2：人結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌細(xì)胞系csrcc01細(xì)胞的制備人直腸印戒細(xì)胞癌細(xì)胞系來(lái)源于新鮮的臨床人結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌手術(shù)切除送檢確認(rèn)標(biāo)本。病人，女，43歲，降結(jié)腸癌雙側(cè)卵巢轉(zhuǎn)移，病理診斷為粘液腺癌，部分為印戒細(xì)胞癌，浸潤(rùn)至粘膜下層，脈管神經(jīng)未見(jiàn)侵犯，淋巴結(jié)0/22。手術(shù)切除送檢確認(rèn)標(biāo)本的使用獲得病人知情同意。從復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院獲得新鮮的臨床結(jié)腸印戒細(xì)胞癌切除標(biāo)本，立即浸潤(rùn)預(yù)冷的無(wú)菌pbs緩沖液(含500u/ml青霉素g、500μg/ml硫酸鏈霉素)中。在生物安全柜中，用新鮮的該無(wú)菌pbs緩沖液沖洗標(biāo)本，切成20～50mg的小塊，pbs緩沖液(含500u/ml青霉素g、500μg/ml硫酸鏈霉素)漂洗3次，每次5分鐘，隨后用置于消化液(含dmem培養(yǎng)基、1％胎牛血清、500u/ml膠原蛋白酶iv、1.5mg/ml膠原蛋白酶ii、125μg/mlii型中性蛋白酶，20ug/ml透明質(zhì)酸酶及10μmly27632)中，37攝氏度水浴搖床消化30分鐘，劇烈搖晃離心管收集消化下來(lái)的細(xì)胞團(tuán)，用預(yù)冷的pbs緩沖液(含500u/ml青霉素g、500μg/ml硫酸鏈霉素)漂洗3次，每次應(yīng)用離心機(jī)69g、4℃離心5分鐘，細(xì)胞團(tuán)用基質(zhì)膠重懸，以200個(gè)細(xì)胞團(tuán)/50μl基質(zhì)膠的密度接種于24孔板，將24孔板于37℃放置5分鐘使基質(zhì)膠聚合，每孔加入500μladvanceddmem/f12培養(yǎng)基[含體積百分比10％的胎牛血清、1×normocin(invivogen)、1×gentamicin/amphotericinb(gibco)、10mmhepes、10mmglutamax、1×n2,1×b27,1mmn-乙酰半胱氨酸,50ng/ml表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子,500ng/mlnoggin,500ng/mlr-spondin]，于37℃培養(yǎng)箱體積百分比5％的co2條件下培養(yǎng)。約14天后，可見(jiàn)細(xì)胞團(tuán)增大，收集基質(zhì)膠，應(yīng)用預(yù)冷的pbs緩沖液漂洗3次，每次應(yīng)用離心機(jī)69g離心5分鐘，接種于培養(yǎng)瓶中，靜置培養(yǎng)，可見(jiàn)印戒細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)。傳代培養(yǎng)：當(dāng)成團(tuán)懸浮印戒細(xì)胞布滿培養(yǎng)瓶時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞傳代，具體步驟如下：將懸浮細(xì)胞及培養(yǎng)基收集、離心，pbs緩沖液漂洗1次，用advanceddmem/f12培養(yǎng)基重懸并以1:5的比例接種于新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，形態(tài)較為均一。傳代至30代以上。在本發(fā)明中，來(lái)源于腫瘤組織的原代培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)細(xì)胞呈上皮樣，細(xì)胞形態(tài)較為均一，無(wú)接觸抑制，初期生長(zhǎng)速度較為緩慢；隨著傳代次數(shù)的增加，生長(zhǎng)速度逐步加快；將該細(xì)胞系命名為人直腸印戒細(xì)胞癌細(xì)胞系csrcc01，于2017年4月12日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)(地址：中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)，郵編：430072)，保藏編號(hào)為cctccno：c201722。實(shí)施例3人直腸印戒細(xì)胞癌細(xì)胞系csrcc01的生物學(xué)特性本發(fā)明采用含有胎牛血清、hepes、glutamax、n2、b27、n-乙酰半胱氨酸、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、noggin及r-spondin的advanceddmem/f12培養(yǎng)液培養(yǎng)csrcc01細(xì)胞，使其能體外長(zhǎng)期生長(zhǎng)和穩(wěn)定傳代，當(dāng)細(xì)胞傳至20代以上，細(xì)胞形狀逐漸穩(wěn)定，進(jìn)行相關(guān)的生物學(xué)、遺傳性和組織來(lái)源鑒定，直至30代都具有相同的穩(wěn)定的性狀。經(jīng)實(shí)驗(yàn)觀察與驗(yàn)證，體外生長(zhǎng)的csrcc01細(xì)胞具有典型的上皮樣形態(tài)，失去接觸生長(zhǎng)抑制，呈惡性生長(zhǎng)。遺傳學(xué)研究證實(shí)該細(xì)胞為異倍體，染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)畸變嚴(yán)重，符合惡性腫瘤的遺傳學(xué)特征。該csrcc01細(xì)胞能在裸小鼠體內(nèi)形成腫瘤，具有致瘤性。具體如下：3.1形態(tài)學(xué)觀察將培養(yǎng)csrcc01細(xì)胞的培養(yǎng)瓶置于倒置顯微鏡下，在明視野下進(jìn)行拍照。結(jié)果見(jiàn)圖1(100×)，可見(jiàn)，csrcc01細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)失去了接觸抑制，呈惡性生長(zhǎng)，具有重貼生長(zhǎng)的特點(diǎn)，部分細(xì)胞可見(jiàn)新月形細(xì)胞核，符合印戒細(xì)胞的特點(diǎn)。3.2染色體的鑒定將培養(yǎng)的csrcc01細(xì)胞置于4℃孵育12小時(shí)后，加入秋水仙素，使其終濃度為0.4μg/ml，再于37℃孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)10小時(shí)。采集分裂中期的細(xì)胞，用固定液進(jìn)行固定，然后將細(xì)胞懸液滴于預(yù)冷的載物片上，用giemas染色液染色，于顯微鏡下計(jì)數(shù)染色體數(shù)。結(jié)果見(jiàn)圖2，可見(jiàn)，csrcc01細(xì)胞連續(xù)傳代后，染色體仍保持人源性腫瘤細(xì)胞染色體的特征，表現(xiàn)為非整倍體，染色體眾數(shù)(m)集中在76-85之間，占70％?？梢?jiàn)該csrcc01細(xì)胞為異倍體，染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)畸變嚴(yán)重，符合惡性腫瘤的遺傳學(xué)特征。3.3免疫熒光染色將csrcc01細(xì)胞用基質(zhì)膠重懸接種于24孔板中，待細(xì)胞增殖成團(tuán)后，去除培養(yǎng)基，用4％多聚甲醛固定，脫水后進(jìn)行石蠟包埋，切片進(jìn)行免疫熒光染色。根據(jù)圖3結(jié)果顯示，上皮細(xì)胞粘附分子(epcam，綠色，400×)呈細(xì)胞膜陽(yáng)性，證明其上皮來(lái)源，黏液蛋白-2(mucin-2，紅色，400×)為胞漿內(nèi)強(qiáng)陽(yáng)性，將細(xì)胞核(dapi，藍(lán)色)擠向細(xì)胞的一側(cè)，符合其印戒細(xì)胞癌的病理特征。3.4細(xì)胞動(dòng)力學(xué)將吹散的csrcc01細(xì)胞以1×104/50μl基質(zhì)膠的密度接種于24孔板中，進(jìn)行培養(yǎng)，分別在24小時(shí)、48小時(shí)、96小時(shí)、144小時(shí)、162小時(shí)應(yīng)用倒置顯微鏡拍照，追蹤單個(gè)細(xì)胞的生長(zhǎng)變化(圖4a)，并計(jì)算每個(gè)100×視野下細(xì)胞團(tuán)的克隆個(gè)數(shù)(圖4b)。根據(jù)圖4結(jié)果顯示，csrcc01細(xì)胞的倍增時(shí)間約為48小時(shí)。3.5細(xì)胞周期分布。收集約1-106細(xì)胞與15ml離心管中，離心棄上清。細(xì)胞沉淀用4ml-20℃75％乙醇重懸，4℃固定過(guò)夜。離心棄上清，加入3mlpbs水化15min，加入500μlpi染色液?；靹颍覝胤跤?0分鐘。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。檢測(cè)得到周期分布圖(圖5)和各周期分布比例(下表)。周期分布百分比g1期56.867s期36.695g2/m期6.4383.6細(xì)胞的成瘤性體外培養(yǎng)和收集csrcc01細(xì)胞，皮下接種balb/c(每只動(dòng)物接種5.0×106個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞懸液和基質(zhì)膠以1:1混合，共接種5只動(dòng)物)，每周兩次測(cè)量腫瘤大小。接種約2周后，腫瘤開(kāi)始形成并生長(zhǎng)。繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，其中腫瘤體積＝(長(zhǎng)×寬2)÷2，在第38天結(jié)束實(shí)驗(yàn)，這時(shí)的腫瘤體積為1148.39±327.16mm3，并且安樂(lè)死處死動(dòng)物，無(wú)菌取瘤。可見(jiàn)該csrcc01細(xì)胞能在裸小鼠體內(nèi)形成腫瘤，具有致瘤性(圖6)。實(shí)施例4：人直腸印戒細(xì)胞癌動(dòng)物模型的建立4.1體外培養(yǎng)和收集csrcc01細(xì)胞，皮下接種balb/c(每只動(dòng)物接種5.0×106個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞懸液和基質(zhì)膠以1:1混合，共接種5只動(dòng)物)，每周兩次測(cè)量腫瘤大小。接種約2周后，腫瘤開(kāi)始形成并生長(zhǎng)。在第38天腫瘤體積為1148.39±327.16mm3(圖6)。4.2腫瘤的病理學(xué)鑒定csrcc01細(xì)胞在裸鼠皮下接種30天后形成的腫瘤，進(jìn)行石蠟包埋茄片和h&e染色，結(jié)果見(jiàn)7。它們的病理診斷結(jié)果見(jiàn)下表1?？梢?jiàn)臨床標(biāo)本(圖7a)和csrcc01細(xì)胞在裸小鼠體內(nèi)所形成的腫瘤(圖7b)結(jié)構(gòu)類似，形成對(duì)應(yīng)關(guān)系。表1.各腫瘤標(biāo)本的病理診斷結(jié)果實(shí)施例5：預(yù)防和治療人結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌的候選藥物的篩選將csrcc01細(xì)胞在裸鼠皮下接種成瘤，待皮下腫瘤長(zhǎng)至150立方毫米左右，通過(guò)尾靜脈給抗腫瘤藥物5-fu組(30mg/kg),隔天給藥，連續(xù)兩周，同時(shí)對(duì)照以生理鹽水作為對(duì)照組。圖8結(jié)果顯示給藥組腫瘤生長(zhǎng)明顯受到抑制，提示csrcc01細(xì)胞裸鼠荷瘤模型能用于體內(nèi)候選藥物的篩選。實(shí)施例6：在離體培養(yǎng)細(xì)胞中進(jìn)行預(yù)防和治療人結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌的候選藥物的篩選將懸浮csrcc01細(xì)胞收集、離心，pbs緩沖液漂洗1次，用advanceddmem/f12培養(yǎng)基重懸并以每孔1.0×104的密度接種于96孔板中，培養(yǎng)24后加入10微升不同濃度治療大腸癌藥物-5-fu(10μm)和伊利替康的活性成分sn38(10μm)，帶培養(yǎng)5天后用mtt方法檢測(cè)細(xì)胞存活。結(jié)果(圖9)顯示10umsn38(抑制率約為70％)和10um5-fu((抑制率約為50％)能明顯抑制csrcc01細(xì)胞生長(zhǎng)，呈現(xiàn)抗腫瘤活性。該結(jié)果提示csrcc01細(xì)胞株可以用于結(jié)直腸印戒細(xì)胞癌的候選藥物的篩選。當(dāng)前第1頁(yè)12