本發(fā)明涉及一種活性提高的枯草芽孢桿菌啟動(dòng)子及其構(gòu)建與應(yīng)用，屬于啟動(dòng)子工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)是一種已被美國(guó)fda認(rèn)定為生物安全gras(generallyregardedassafe)的革蘭氏陽(yáng)性菌。其具有良好的蛋白質(zhì)分泌能力的優(yōu)勢(shì)，并且發(fā)酵條件簡(jiǎn)單，因而被廣泛應(yīng)用于工業(yè)和食品酶制劑的生產(chǎn)中。雖然諸多工業(yè)、食品酶制劑已經(jīng)在b.subtilis中實(shí)現(xiàn)重組表達(dá)，但現(xiàn)有蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)所具有的異源蛋白生產(chǎn)能力還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足規(guī)?；a(chǎn)的需求。其中啟動(dòng)子元件在基因表達(dá)系統(tǒng)中發(fā)揮核心作用，而大多數(shù)正在b.subtilis中使用的啟動(dòng)子存在活性不高的問題。啟動(dòng)子是重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)中最基礎(chǔ)、最重要的一類生物元件，它直接調(diào)控目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而影響外源蛋白的合成。目前應(yīng)用最多的是天然啟動(dòng)子，但由于天然啟動(dòng)子存在種屬特異性，無(wú)法滿足構(gòu)建更為復(fù)雜的人工代謝途徑等研究的要求。

目前有多種策略改造啟動(dòng)子以提高其活性，比如改造啟動(dòng)子up元件或者對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行串聯(lián)等。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明的目的是提供新型枯草芽孢桿菌高效表達(dá)啟動(dòng)子及其人工構(gòu)建和篩選方法。

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種枯草芽孢桿菌高效啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子的核苷酸序列如seqidno.2～seqidno.4任一所示的序列。

在一種實(shí)施方式中，所述啟動(dòng)子是在核苷酸序列如seqidno.1所示的psrfa啟動(dòng)子的基礎(chǔ)上進(jìn)行突變得到的。

在一種實(shí)施方式中，所述啟動(dòng)子是將psrfa啟動(dòng)子“-10”區(qū)上游序列進(jìn)行突變得到的。

在一種實(shí)施方式中，所述啟動(dòng)子的核苷酸序列是將seqidno.1所示的序列的第297位至303位堿基進(jìn)行突變后得到的。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供含有所述啟動(dòng)子的重組載體。

在一種實(shí)施方式中，所述重組載體為枯草芽孢桿菌載體。

在一種實(shí)施方式中，所述重組載體為大腸桿菌—枯草芽孢桿菌穿梭載體。

在一種實(shí)施方式中，所述重組載體是將pbsg03質(zhì)粒中的啟動(dòng)子替換成核苷酸序列如seqidno.2～seqidno.4任一所示的啟動(dòng)子后得到的。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供含有所述啟動(dòng)子的重組菌。

在一種實(shí)施方式中，所述重組菌為枯草芽孢桿菌重組菌。

在一種實(shí)施方式中，所述枯草芽孢桿菌重組菌含有所述重組載體。

在一種實(shí)施方式中，所述枯草芽孢桿菌重組菌是先構(gòu)建含有啟動(dòng)子psrfa和目的基因的枯草芽孢桿菌載體，然后將啟動(dòng)子psrfa替換成核苷酸序列如seqidno.2～seqidno.4任一所示的啟動(dòng)子，得到重組載體轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌中即得到重組菌。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供所述啟動(dòng)子、所述重組載體或者所述枯草芽孢桿菌重組菌在提高基因表達(dá)方面的應(yīng)用。

在一種實(shí)施方式中，所述基因?yàn)榫G色熒光蛋白gfp基因或者l-天冬氨酸酶基因。

本發(fā)明的有益效果：

本方法通過(guò)人工合成啟動(dòng)子文庫(kù)，得到表達(dá)能力較強(qiáng)的啟動(dòng)子，用于異源蛋白高效表達(dá)，以期滿足工業(yè)用途。此策略對(duì)于枯草芽孢桿菌中啟動(dòng)子的改造具有很大借鑒意義。

本發(fā)明得到了三個(gè)優(yōu)于原始啟動(dòng)子的突變啟動(dòng)子pv1、pv2、pv3，其表達(dá)熒光強(qiáng)度分別是原始啟動(dòng)子的1.76、1.5、1.67倍。此外，本發(fā)明用篩選得到的最優(yōu)啟動(dòng)子pv1去表達(dá)l-天冬氨酸酶，實(shí)現(xiàn)了l-天冬氨酸酶的高效表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證突變型啟動(dòng)子的功能。

附圖說(shuō)明

圖1：psrfa啟動(dòng)子突變體庫(kù)構(gòu)建策略；

圖2：psrfa啟動(dòng)子突變體文庫(kù)篩選；

圖3：psrfa突變體啟動(dòng)子搖瓶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證a：生長(zhǎng)曲線，b：gfp表達(dá)曲線，c：24h熒光強(qiáng)度比較，d：sds-page檢測(cè)gfp表達(dá)量；

圖4：天冬氨酸酶在重組枯草芽孢桿菌中的表達(dá)；a：lb培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線，b：tb培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線，c：lb培養(yǎng)基中酶活測(cè)定，d：tb培養(yǎng)基中酶活測(cè)定，e：sds-page檢測(cè)aspa在lb培養(yǎng)基中的表達(dá)，f：sds-page檢測(cè)aspa在tb培養(yǎng)基中的表達(dá)。

具體實(shí)施方式

1、gfp熒光強(qiáng)度的檢測(cè)方法：樣品12000×g離心2min，收集菌體，pbs緩沖液洗3次，用pbs稀釋到一定濃度的菌體懸液，取200μl至96孔酶標(biāo)板，放入synergytmh4熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光。程序設(shè)置為：中度震板1min；600nm檢測(cè)菌體濃度；激發(fā)光495nm，吸收光525nm，增益80，檢測(cè)熒光。

2、aspa酶活檢測(cè)方法：

向100μlecaspa純酶液終加入終濃度為100mmol·l^-1的富馬酸銨底物溶液(ph為7.0)及終濃度為1mmol·l^-1的mg²⁺，37℃反應(yīng)10min。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)體系于100℃反應(yīng)10min，12000rpm離心5min，吸取上層溶液，用0.22μm有機(jī)濾膜過(guò)濾。通過(guò)hplc檢測(cè)殘余富馬酸的方法測(cè)定酶活。

其中，hplc檢測(cè)方法如下：

選擇有機(jī)酸分析色譜柱prevailorganicacid(oa)(5μm，4.6mm×250mm)。流動(dòng)相為20％甲醇溶液(用磷酸調(diào)ph至2.2)，流速為0.6ml·min^-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm，柱溫為40℃，檢測(cè)時(shí)間為15min，進(jìn)樣量為10μl。所測(cè)得的富馬酸含量等同于標(biāo)樣所測(cè)得富馬酸含量，從而計(jì)算酶活。每組實(shí)驗(yàn)檢測(cè)3次取平均值。

酶活定義：在37℃，ph為7.0的條件下，每分鐘轉(zhuǎn)化底物富馬酸生成1mmol產(chǎn)物l-天冬氨酸所需酶量為一個(gè)酶活單位1u。

比酶活定義：每mg蛋白所含的酶活力單位數(shù)，即比活力＝活力u·mg^-1蛋白。

3、培養(yǎng)基：lb培養(yǎng)基(l^-1)：胰蛋白胨10g，nacl10g，酵母提取物5g，ph7.0，配制固體培養(yǎng)基時(shí)添加瓊脂粉20g。

tb培養(yǎng)基(gl^-1)：酵母提取物24，胰蛋白胨12，甘油4，k2hpo412.54，kh2po42.31，ph7.0。

4、培養(yǎng)條件：重組菌種從-80℃冰箱中取出，在含有相應(yīng)抗性的lb平板上劃線，挑取單菌落在含有5mllb培養(yǎng)基的試管中200r·min^-1，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。之后按2％接種量轉(zhuǎn)入含有50mltb培養(yǎng)基的250ml搖瓶中培養(yǎng)。

5、枯草芽孢桿菌168轉(zhuǎn)化方法：挑單菌落bs168接種至2ml的spi培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜；從過(guò)夜培養(yǎng)物中取100μl，接種至5mlspi培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)4-5h后開始測(cè)od600。當(dāng)od600約為1.0時(shí)，移取200μl菌液轉(zhuǎn)接至2ml的spii培養(yǎng)基中，于37℃、100r·min^-1搖床孵育1.5h；向管中加入20μll00×egta(乙二醇雙(α-氨基乙基醚)四乙酸)溶液，于37℃、100r·min^-1搖床中培養(yǎng)10min后分裝500μl每l.5ml離心管；向管中加入經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證正確的適量質(zhì)粒，吹吸混勻放置于37℃、100r·min^-1的搖床中培養(yǎng)2h；培養(yǎng)結(jié)束，吸取菌液約200μl均勻涂相應(yīng)的選擇性平板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。

實(shí)施例1：psrfa啟動(dòng)子突變體庫(kù)構(gòu)建策略

(1)以psrfa-7bp-1和psrfa-7bp-2(表1)為引物，以pbsg03為模板，對(duì)psrfa啟動(dòng)子[c.guan,w.cui,j.cheng,l.zhou,j.guo,x.hu,g.xiao,z.zhou,constructionanddevelopmentofanauto-regulatorygeneexpressionsysteminbacillussubtilis,microb.cellfact.14(2015)]σ^a識(shí)別核心區(qū)“-10區(qū)”上游7bp堿基進(jìn)行簡(jiǎn)并突變(圖1)。

表1本實(shí)施例中用到的引物

實(shí)施例2：psrfa啟動(dòng)子突變體文庫(kù)篩選

將所得到的psrfa啟動(dòng)子突變體文庫(kù)轉(zhuǎn)化b.subtilis168，涂布平板，獲得轉(zhuǎn)化子。挑取得到的枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化子至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定菌液的od600和gfp熒光強(qiáng)度，篩選不同gfp表達(dá)水平的突變體啟動(dòng)子。

從96孔板篩選結(jié)果可以看出(圖2)，所有轉(zhuǎn)化子都成功表達(dá)了序列如seqidno.5所示的gfp，大部分轉(zhuǎn)化子的gfp熒光強(qiáng)度下降，有3個(gè)轉(zhuǎn)化子的gfp熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，說(shuō)明這3個(gè)突變體啟動(dòng)子是正向突變，得到的這3個(gè)突變體啟動(dòng)子分別為pv1、pv2、pv3，堿基序列分別如seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4所示。

實(shí)施例3：psrfa突變體啟動(dòng)子搖瓶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

將實(shí)施例2篩選得到的3個(gè)psrfa啟動(dòng)子用于搖瓶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。在250ml搖瓶體系中驗(yàn)證這些轉(zhuǎn)化子表達(dá)gfp活性，結(jié)果顯示，帶有突變體啟動(dòng)子質(zhì)粒的菌株的生長(zhǎng)曲線與野生型菌株一致(圖3-a)，并且野生型與突變體啟動(dòng)子都在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的中后期活性迅速提高(圖3-b)，這符合psrfa啟動(dòng)子受群體感應(yīng)信號(hào)激活這一特點(diǎn)。篩選得到的3個(gè)突變體啟動(dòng)子的活性較野生型啟動(dòng)子都大幅提升，最高的pv1活性約為野生型啟動(dòng)子的1.76倍(圖3-c)，pv2、pv3，表達(dá)熒光強(qiáng)度分別是野生型啟動(dòng)子psrfa的1.5、1.67倍。sds-page檢測(cè)結(jié)果與gfp熒光檢測(cè)結(jié)果一致(圖3-d)。

實(shí)施例4：天冬氨酸酶在重組枯草芽孢桿菌中的表達(dá)

將實(shí)施例3中最佳突變啟動(dòng)子pv1分別用于天冬氨酸酶aspa(序列如seqidno.6所示)的表達(dá)，實(shí)施過(guò)程主要是將原始載體中的報(bào)告基因gfp替換成aspa，具體引物設(shè)計(jì)見上表1，天冬氨酸酶表達(dá)量較原始psrfa啟動(dòng)子提高了90％，圖4顯示是表達(dá)天冬氨酸酶具體情況。

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。

序列表

<110>江南大學(xué)

<120>一種活性提高的枯草芽孢桿菌啟動(dòng)子及其構(gòu)建與應(yīng)用

<160>12

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>607

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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